123I-3H11在荷瘤裸鼠體內(nèi)的SPECT顯像

秦紅斌，高惠波，陳大明，楊 志，金小海，白紅升，李存福，雷衍慶，尹 衛(wèi)，*

1.原子高科股份有限公司，北京 102413；2.北京大學(xué) 臨床腫瘤學(xué)院，北京腫瘤醫(yī)院暨北京腫瘤防治研究所 核醫(yī)學(xué)科，北京 100036

胃癌的死亡率居我國(guó)各種癌癥之首，患者就診時(shí)多屬進(jìn)展期，對(duì)放、化療不敏感，根治手術(shù)效果不理想，迫切需要探索新的診治方法[1]。應(yīng)用單克隆抗體可以特異性的識(shí)別惡性腫瘤[2]。單克隆抗體3H11與胃癌組織具有高陽(yáng)性反應(yīng)率、高選擇性及高親和力的特點(diǎn)[3]。3H11對(duì)多種腫瘤組織具有良好的結(jié)合特性，并已成功地用于原發(fā)腫瘤及轉(zhuǎn)移病灶的臨床顯像診斷[4-5]。免疫熒光顯示，著染部位限于靶細(xì)胞的質(zhì)膜，并得到免疫電鏡的證實(shí)[6]。其對(duì)應(yīng)抗原為210 kD的蛋白質(zhì)，基本不含糖[7-8]。近年來(lái)，研究者采用131I標(biāo)記的單克隆抗體3H11對(duì)胃癌的導(dǎo)向治療進(jìn)行了廣泛的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，并取得了一定的研究成果[9-10]。王川等[11]研究了125I-3H11在胃癌放射免疫導(dǎo)向手術(shù)的應(yīng)用價(jià)值，在臨床取得較滿意的效果。張梅穎等[12]采用131I-3H11在荷人胃癌移植瘤中進(jìn)行γ相機(jī)攝片，結(jié)果表明，標(biāo)記物可明顯地濃聚在腫瘤部位，可獲得較清晰的圖像，但標(biāo)記物大部分仍在血池中，這就可能造成它的腫瘤定位、特別是探測(cè)處于高本底部位的病灶不夠理想。為了探索更好的顯像效果，本工作擬采用核性質(zhì)優(yōu)異的123I作為顯像核素標(biāo)記單抗3H11，并對(duì)標(biāo)記物在荷瘤裸鼠體內(nèi)的生物分布進(jìn)行觀察和SPECT顯像，探討標(biāo)記物作為胃癌和轉(zhuǎn)移瘤診斷顯像劑的可能性，為臨床應(yīng)用提供必要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝備

FT-603井型γ閃爍探頭-FH463A智能定標(biāo)儀，北京核儀器廠；AR2130型電子天平，感量0.001 g，美國(guó)OHAUS公司；單道可調(diào)移液器，美國(guó)Eppendorf公司；PD-10柱，瑞典GE Healthcare公司；Whatman No.1試紙，英國(guó)Whatman公司；Haier BCD-278A/C普通冰箱，市售；單光子發(fā)射體斷層掃描儀(SPECT)，德國(guó)Simens公司；京立LD5-10離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司。

1.2 主要材料與試劑

小鼠單克隆抗體3H11、胃癌BGC823細(xì)胞，北京腫瘤研究所惠贈(zèng)；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Na123I溶液，原子高科股份有限公司；胃癌荷瘤裸鼠BALB/C(6～8周齡)，SPF級(jí)，體重18～20 g，雌性，均于右前腿根部背側(cè)接種2×106個(gè)BGC823細(xì)胞，8～10 d后腫瘤直徑為0.8～1.0 cm，北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；其余化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

1.3 3H11標(biāo)記物親和常數(shù)測(cè)定

采用文獻(xiàn)[13]報(bào)道的優(yōu)化條件進(jìn)行3H11的123I標(biāo)記及標(biāo)記物的純化。123I-3H11與BGC823靶細(xì)胞的親和常數(shù)采用96孔板法測(cè)定。按照每孔3×104個(gè)BGC823細(xì)胞包被到96孔板，于4 ℃放置過(guò)夜，棄去培養(yǎng)液并用200 μL磷酸鹽緩沖溶液(PBS，含0.1% BSA，pH=7.4，0.01 mol/L)洗滌3次；每孔加入含5% BSA的PBS 200 μL封閉，37 ℃孵育1 h；將123I-3H11按倍比稀釋法配成系列濃度，分別與包被的靶細(xì)胞結(jié)合，反應(yīng)平衡后，按上述方法洗滌，洗滌后每孔加入200 μL的2 mol/L NaOH溶液，37 ℃下消化細(xì)胞20 min；收集每孔的細(xì)胞消化液，并且使用PBS洗3次，合并至消化液中；在γ計(jì)數(shù)器上測(cè)定每管試樣為總結(jié)合(TB)，并測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)樣的放射性計(jì)數(shù)。非特異性結(jié)合(NBS)每孔再加入200 ng(100 μL)抗體3H11,置于37 ℃孵育1 h后洗滌3次，消化后測(cè)γ計(jì)數(shù)。

1.4 123I-3H11免疫活性測(cè)定

取1支放免管加入人血清0.5 mL(5×104個(gè))后再加入1.5 mL PBS記為N管；另取1支放免管加入BGC823細(xì)胞1 mL(5×104個(gè))后再加入1 mL PBS記為O管。N管和O管室溫放置30 min后離心6 min(3 000 r/min)，離心后取走余液。在離心后的N管和O管中分別加入123I-3H11標(biāo)記物10 μL(3H11質(zhì)量濃度0.01 mg/L)，搖勻成懸浮液，37 ℃溫育30 min，分別加入2 mL PBS，離心20 min，去上清液，測(cè)定放射性計(jì)數(shù)。再另取1支放免管加入10 μL123I-3H11標(biāo)記物作為標(biāo)準(zhǔn)液，記為T管，測(cè)定總放射性計(jì)數(shù)。按式(1)計(jì)算標(biāo)記單抗3H11免疫活性。

(1)

1.5 123I標(biāo)記3H11在胃癌BGC823裸鼠體內(nèi)評(píng)價(jià)

1.5.1胃癌裸鼠的生物分布 選用15只BALB/C胃癌裸鼠隨機(jī)分為3組，每組5只，每只自尾靜脈注射0.1 mL活度約1.11 MBq的123I-3H11，并于注射后2、24、48 h眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠。取心、肝、脾、肺、腎、胃、腸、肌肉、骨、甲狀腺，稱重并測(cè)量放射性計(jì)數(shù)。由于123I半衰期短，為了便于校正放射性衰變，取0.1 mL注射液作標(biāo)準(zhǔn)，與上述生物樣品同時(shí)測(cè)量。最后經(jīng)衰變校正后計(jì)算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)和腫瘤組織(T)與正常組織(NT)攝取放射性比(T/NT)。

1.5.2荷瘤裸鼠的SPECT顯像 隨機(jī)取3只荷人胃癌的BALB/C裸鼠(裸鼠封閉甲狀腺)于尾靜脈分別注射約7.4 MBq123I-3H11并于注射后2、24 h行SPECT顯像。顯像條件為：低能、高分辨、平行孔準(zhǔn)直儀，128×128像素，每只小鼠采集50 000～150 000的放射性計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 3H11標(biāo)記物親和常數(shù)測(cè)定結(jié)果

123I-3H11與BGC823靶細(xì)胞結(jié)合的飽和曲線(Prism 5.0軟件作圖)結(jié)果示于圖1。對(duì)于BGC823靶細(xì)胞而言，有其固有的親和力，當(dāng)123I-3H11的濃度從零開(kāi)始增加時(shí)，復(fù)合物123I-3H11-BGC823的量先快速上升，后逐漸變慢，表明其親和力高(一般上升越快，親和力越高)，當(dāng)標(biāo)記物的濃度達(dá)278.1 pmol/L時(shí)，靶細(xì)胞絕大部分被飽和，通過(guò)Prism 5.0軟件計(jì)算Kd=6.255×10-9mol/L，說(shuō)明標(biāo)記物具有特異性、高親和力。

圖1 BGC823細(xì)胞與123I-3H11放射性配基結(jié)合分析飽和曲線Fig.1 Saturation binding of 123I-3H11 to BGC823 cells●——TB，◆——SB，▲——NSB

2.2 123I-3H11免疫活性測(cè)定結(jié)果

在定標(biāo)儀上測(cè)定N管、O管和T管的10 s放射性計(jì)數(shù)，結(jié)果分別為291、3 282、4 349。

按式(1)計(jì)算得到標(biāo)記物的免疫活性為68.8%，標(biāo)記后單抗免疫活性有一定的損傷。

2.3 123I標(biāo)記3H11在荷人胃癌BGC823裸鼠的體內(nèi)評(píng)價(jià)結(jié)果

2.3.1荷瘤裸鼠的生物分布結(jié)果123I -3H11在荷人胃癌裸鼠體內(nèi)的生物分布示于圖2。從圖2可以看出，標(biāo)記物進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，從血液迅速清除，注射標(biāo)記物2 h后放射性攝取(Dinj)為(10.35±1.79) %ID/g，24 h后回落到(3.81±0.81) %ID/g；肝對(duì)123I-3H11的放射性攝取2 h時(shí)高達(dá)(8.02±2.52) %ID/g；腎對(duì)123I-3H11攝取2 h時(shí)高達(dá)(6.72±1.16) %ID/g，標(biāo)記物可能從肝、腎代謝；123I為親甲狀腺核素，當(dāng)在體內(nèi)脫落后沉積于甲狀腺中，本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)甲狀腺中的放射性有增高趨勢(shì)，并且較其它組織中有明顯的偏高，說(shuō)明了123I-3H11體內(nèi)有脫碘現(xiàn)象；標(biāo)記物進(jìn)入靶腫瘤較快，從注射后2 h的(4.35±1.45) %ID/g增至24 h的(11.06±1.86) %ID/g，有利于盡早開(kāi)始SPECT顯像；腫瘤部位放射性濃度維持了一個(gè)較高的水平，而且隨時(shí)間延長(zhǎng)略有升高，由此表明，單克隆抗體3H11的123I標(biāo)記物具有一定的腫瘤特異性。123I-3H11在荷胃癌裸鼠體內(nèi)的生物分布T/NT比值列于表1，從表1結(jié)果可以分析出，標(biāo)記物特異性地濃集于腫瘤，而其他組織的放射性攝取較少，即T/NT的放射性活度比值高，注射后24 h腫瘤與血、腸、肌肉比分別為2.90±0.06、17.01±0.26、15.58±0.82；標(biāo)記物從腫瘤清除較慢，保證了顯像時(shí)間充足；注射標(biāo)記物24 h后腫瘤與肝、肺、腸、胃、骨等的T/NT達(dá)到較大比值，因此可以考慮藥物注射后24 h為較佳顯像時(shí)間。

圖2 123I-3H11在荷胃癌裸鼠體內(nèi)生物分布柱狀圖Fig.2 Biodisribution of 123I-3H11 in the bearing mice1——血(Blood)，2——腫瘤(Tumor)，3——甲狀腺(Hypothyroid),4——肝(Liver)，5——腎(Kidney)，6——肺(Lung)，7——胃(Stomach)，8——脾(Spleen)，9——心(Heart)，10——腸(Intestine)，11——骨(Bone)，12——肌肉(Muscle)

2.3.2荷瘤裸鼠的SPECT顯像結(jié)果 荷瘤裸鼠分別注射123I-3H11后2、24 h行SPECT顯像，從各時(shí)刻顯像圖看，血中放射性本底早期較高，標(biāo)記物主要存在于血液中，肝、腎等器官血運(yùn)豐富，放射性分布較多而顯影明顯，腫瘤部位積聚少量顯像劑，腫瘤輪廓較清晰(圖3(a))；隨著血液中標(biāo)記物的清除，心臟、腎、肺和胃等器官放射性攝取整體也隨血液清除的增多而降低，腫瘤部位濃聚顯像劑增多，腫瘤顯像更清晰(圖3(b))。荷瘤裸鼠的SPECT顯像結(jié)果與裸鼠體內(nèi)生物學(xué)分布結(jié)果基本一致。

表1 123I-3H11在荷胃癌裸鼠體內(nèi)的生物分布T/NT比值Table 1 T/NT ratios of 123I-3H11 in tumor-bearing mice

注(Note)：n=5

圖3 2 h(a)和24 h(b)時(shí)123I-3H11在荷瘤裸鼠體內(nèi)的SPECT顯像圖Fig.3 SPECT imaging of 123I-3H11 in tumor-bearing mice at 2 h(a) and 24 h(b) post intravenous injection

3 結(jié) 論

123I標(biāo)記的胃癌單克隆抗體3H11具有很好的生物活性，與BGC823靶細(xì)胞有較高親和力；標(biāo)記物有較好的裸鼠體內(nèi)生物學(xué)行為，靶組織攝取較高，其它組織器官的非特異攝取較低；123I-3H11注射后24 h獲得清晰的腫瘤顯像。123I-3H11放射免疫顯像圖像清晰，是一種非常有潛力的放射性顯像藥物，引入臨床將有待于進(jìn)一步研究。

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