水產(chǎn)品及水產(chǎn)制品中三聚氰胺檢測方法的研究

梁寶愛 張素娟

（國家農(nóng)副加工產(chǎn)品及白酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心、山西省食品質(zhì)量檢驗監(jiān)督中心，太原 030012）

水產(chǎn)品及水產(chǎn)制品中三聚氰胺檢測方法的研究

梁寶愛*張素娟

（國家農(nóng)副加工產(chǎn)品及白酒質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心、山西省食品質(zhì)量檢驗監(jiān)督中心，太原 030012）

采用氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（GCMS/MS） 對鮮、冷或凍水產(chǎn)品（養(yǎng)殖魚、蝦、蟹、貝等） 及水產(chǎn)制品（干、熏、鹽制水產(chǎn)） 中三聚氰胺進行了檢測。樣品采用乙睛和甲醇提取，提取液離心凈化，氮氣吹干，利用衍生化試劑BSTFA-TMCS（體積比為 99∶1） 進行衍生化反應、優(yōu)化儀器條件、考察基體干擾，利用三重四級桿氣相色譜聯(lián)用的多反應監(jiān)測（MRM） 技術，對三聚氰胺衍生物進行定性定量分析。以三聚氰胺衍生物離子對m/z 342＞171、m/z 342＞327離子對進行定性，以m/z 342＞327進行定量。方法的線性范圍為 0.005 μg/L ～ 0.1 μg/L；回歸方程為y=1 434 164.378 8x-704.012 5，相關系數(shù)R2=0.999 4；方法定量限0.03 mg/kg?；厥章蔬_90%以上，相對標準偏差RSD＜5.0%。該方法簡便、快速、靈敏、準確，適合于水產(chǎn)品和水產(chǎn)制品中三聚氰胺含量的確證和定量測定。

水產(chǎn)品及水產(chǎn)制品；三聚氰胺；檢測；氣相色譜—質(zhì)譜/質(zhì)譜法

食品安全直接危害人民群眾身體健康和生命安全，危及企業(yè)生存，甚至影響我國產(chǎn)品聲譽、國際貿(mào)易和國家形象。乳制品中三聚氰胺事件的出現(xiàn)，企業(yè)缺乏自律是根本，但缺乏檢測方法和手段，以至于無法查處這些違法添加物也是重要的原因之一。2008年10月，香港市場上從內(nèi)地進口的雞蛋中檢測出三聚氰胺，香港對內(nèi)地進口雞蛋開始全面檢測，并將檢測范圍擴大至從內(nèi)地進口的肉類及動物內(nèi)臟。因此，盡快開發(fā)出相應的檢測方法，對其他動物源性食品中三聚氰胺的檢測和監(jiān)控具有很重要的意義。

1 實驗方法

1.1 主要試劑

甲醇、乙腈、三氯甲烷，均為色譜純；吡啶，分析純；衍生化試劑，N，O－雙三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA） +三甲基硅烷（TMCS），體積比為99∶1；三聚氰胺標準物質(zhì)（C3H6N6），純度≥99.0 g/100 g。

1.2 主要儀器

Agilent 7100氣相色譜-質(zhì)譜 /質(zhì)譜（GC-MS/MS）儀：配有電子轟擊電離離子源（EI）；分析天平，感量0.01 g和0.000 1 g；高速萬能粉碎機；渦旋混合器；勻漿機；超聲波水浴；高速冷凍離心機，轉(zhuǎn)速不低于4 000 r/min；氮氣吹干儀；電熱恒溫干燥箱；具塞塑料離心管。

1.3 試樣前處理

1.3.1 水產(chǎn)制品

準確稱取粉碎混勻的試樣1 g（精確到0.01 g），加入10.00 mL乙腈水或甲醇水，渦旋混勻2 min后超聲提取20 min，于4℃以不低于4 000 r/min離心10 min，取上清液用直徑0.2 μm微孔濾膜過濾，準確吸取200 μL濾液，50℃下氮氣吹干，衍生化后待測。

1.3.2 水產(chǎn)品

準確稱取混勻試樣1 g（精確到0.01 g，試樣取可食部分切碎混勻），加入10.0 mL乙腈或甲醇，渦旋混勻2 min后超聲提取20 min，于4℃以不低于4 000 r/min離心10 min，取上清液用直徑0.2 μm微孔濾膜過濾，準確吸取200 μL濾液，50℃下氮氣吹干，衍生化后待測。

1.3.3 衍生化

取上述氮氣吹干殘留物，加入600 μL吡啶和200 μL衍生化試劑，混勻，70℃反應30 min，供GC-MS/MS法定量檢測或確證。

1.4 質(zhì)譜條件

1.4.1 儀器參考條件

a)色譜柱：5%苯基二甲基聚硅氧烷石英毛細管柱，30 m×0.25 mm（i.d.）×0.25 μm，或相當者；

b) 流速：1.0 mL/min；

c) 程序升溫：75℃保持1 min，以30℃/min速率升溫至220℃，再以5℃/min速率升溫至250℃，保持2 min；

d）進樣口溫度：250℃；

e） 接口溫度：280℃；

f）進樣量：1 μL；

g）進樣方式：不分流方式，溶劑延遲4.5 min；

h）電離方式：電子轟擊電離（EI）；

i）電離能量：70 eV；

j）離子源溫度：230℃；

k）四級桿溫度：150℃；

l）碰撞氣流速：高純氮氣1.5 mL/min；

m）碰撞能量：10 eV；

n） 掃描方式：采用多反應檢測（MRM），定量離子m/z342＞327，定性離子m/z342＞327，342＞171。

1.5 測定

1.5.1 標準曲線的繪制

準確吸取三聚氰胺標準溶液（10μg/mL），0mL、0.04 mL、0.08 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL分別于7個100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。各取1 mL用氮氣吹干，按1.3.3步驟衍生化。配制成衍生產(chǎn)物質(zhì)量濃度為0.0μg/mL、0.005μg/mL、0.01μg/mL、0.025μg/mL、0.05μg/mL、0.075μg/mL、0.1 μg/mL的標準溶液。反應液供GC-MS/MS測定。以標準工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線。

1.5.2 定量測定

待測樣液中三聚氰胺標準的響應值在標準曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應對凈化液稀釋，重新衍生化后再進樣分析。

1.5.3 定性判定

以標準樣品的保留時間以及多反應檢測離子（m/z 342＞327、342＞171） 定性；樣品中目標化合物的兩個離子的相對豐度與濃度相當標準溶液的相對豐度一致，相對豐度偏差不超過表1的規(guī)定，則可判斷樣品中存在三聚氰胺。

表1 定性離子相對豐度的最大允許偏差

1.6 結果計算

試樣中三聚氰胺的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或

式中：X—試樣中三聚氰胺的含量，mg/kg；

A—試樣中三聚氰胺的峰面積；

c—標準溶液中三聚氰胺的質(zhì)量濃度，μg/mL；

V—樣液最終定容體積，mL；

As—標準溶液中三聚氰胺的峰面積；

m—試樣的質(zhì)量，g；

f—稀釋倍數(shù)。

2 結果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

由于氣相-質(zhì)譜/質(zhì)譜法具有分析速度快、檢測靈敏度高和應用范圍廣泛的特點，本試驗選用了氣相-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀器，儀器條件選擇主要參照了GB/T22388-2008《乳及乳制品中三聚氰胺的檢測方法》中氣相-質(zhì)譜/質(zhì)譜法（GC-MS/MS） 的儀器條件，結合實驗儀器的特點調(diào)整了碰撞能量、碰撞氣流速、接口溫度。

2.2 樣品前處理方法的選擇

三聚氰胺具有溶于熱水，微溶于冷水，極微溶于熱乙醇，不溶于醚、苯和四氯化碳，可溶于甲醇、甲醛、乙酸、熱乙二醇、甘油、吡啶等特性；結合乳制品中三聚氰胺提取和凈化的前處理方法，優(yōu)化本課題中5類產(chǎn)品中三聚氰胺的提取和凈化方法，選擇了乙腈或甲醇超聲提?。▌游镉椭柘仁褂萌燃淄槿芙?，再用甲醇超聲提?。?，提取液離心過濾凈化。

2.2.1 水產(chǎn)制品

準確稱取混勻試樣1 g（精確到0.01 g），加入10.00 mL乙腈水或甲醇水，渦旋混勻2 min后超聲提取20 min，于4℃以不低于4 000 r/min離心10 min，取上清液用直徑0.2 μm微孔濾膜過濾，準確吸取200 μL濾液，50℃下氮氣吹干，衍生化后供GC-MS/MS法定量檢測或確證。對蝦米、熏魚片、鹽制魚等水產(chǎn)制品中三聚氰胺進行了加標檢測，回收率達90%以上，反復實驗，RSD＜5.0%。

2.2.2 水產(chǎn)品

準確稱取混勻試樣1 g（精確到0.01 g，試樣取可食部分切碎混勻），加入10.0 mL乙腈或甲醇，渦旋混勻2min后超聲提取15min，于4℃以4000r/min離心10 min，取上清液200 μL用直徑0.2 μm有機濾膜過濾，氮氣吹干，衍生化后供GC-MS/MS法定量檢測或確證。對鮮魚、凍蝦、鮮蟹、鮮貝等水產(chǎn)品中三聚氰胺進行了加標檢測，回收率達90%以上，反復實驗，RSD＜5.0%。

2.2.3 衍生化

取上述氮氣吹干殘留物，加入600 μL吡啶和200 μL衍生化試劑混勻，70℃反應30 min，供GC-MS/MS法定量檢測或確證。

2.3 線性范圍的確定

確定標準系列的范圍，選用從0.005 μg/mL至0.1 μg/mL，6個不同質(zhì)量濃度的三聚氰胺標準溶液進行實驗，結果從標準系列來看，線性關系良好，R2=0.999 4。見圖1、圖2、圖3。

圖1 三聚氰胺標準曲線圖

圖2 三聚氰胺衍生物GC-MS/MS選擇離子質(zhì)譜圖

圖3 三聚氰胺衍生物GC-MS/MS多反應監(jiān)測質(zhì)量質(zhì)譜圖

2.4 檢出限的確定

在本試驗條件下，將標準溶液連續(xù)稀釋后進行干蝦米、烤魚片、鮮魚、鮮蝦、鮮蟹、鮮貝、空白樣品的加標回收，根據(jù)3倍噪音的峰響應值和10倍噪音的峰響應值、取樣量和進樣量，得出該方法檢出限為0.01 mg/kg，該方法定量限為0.03 mg/kg。

2.5 精密度的測定

對蝦米、熏魚片、鮮魚、凍蝦、鮮蟹、鮮貝等樣品前處理采用了乙腈超聲提取法和甲醇超聲提取法兩種方法，分別按已確定的儀器方法對三聚氰胺進行6次測定（對不同樣品加不同質(zhì)量濃度的三聚氰胺標準溶液），相對標準偏差RSD＜5.0%。

2.6 回收率的測定

取蝦米、熏魚片、鹽制魚、鮮魚、凍蝦、鮮蟹、鮮貝等樣品使用乙腈超聲提取和甲醇超聲提取，分別離心凈化，氮氣吹干，衍生化后按已確定的質(zhì)譜條件加不同質(zhì)量濃度的三聚氰胺標準溶液進行測定，回收率均＞90.0%。

3 結語

通過大量試驗證明，用上述方法可以對水產(chǎn)品及水產(chǎn)制品食品中三聚氰胺進行準確的定性和定量測定，標準曲線線性相關系數(shù)R2＝0.999 4，線性關系良好；方法回收率達90%以上；RSD＜5.0%，精密度高。

［1］宋書鋒，魯杰，安娟，等.GB/T22388-2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法〔S〕.中國國家標準出版社，2008.

［2］李紅梅，張慶合，湯樺，等.GB/T 22400-2008原料乳中三聚氰胺快速檢測液相色譜法〔S〕.中國國家標準出版社，2008.

Research on the detection methods of melamine content in fishery products and aquatic products

LIANGBao-ai*ZHANGSu-juan
（National farmproducts and liquor qualitysupervision and inspection center,Shanxi Province foodstuffqualitysupervision and inspection center，Taiyuan 030012，China）

The melamine contents in fresh,cool or frozen fishery products（farming-fish,shrimp,crab,cowry and so on）and aquatic products(dried,smoke-dried,saline)were detected by gas chromatography-mass/mass spectrometry (GC-MS/MS).Samples were extracted with acetonitrile and methanol，extracting solution was purged after decentralization，blowed dry through nitrogen and derivatized with a mixed system composed of BSTFA and TMCS （99:1，V/V）prior to GC-QqQ-MS/MS analysis in multiple reaction monitoring（MRM）mode.The optimal values of crucial instrument parameters and matrixinterference were investigated.Melamine was qualified using the ion pairs of m/z 345＞171 and m/z 342＞327 and quantified using the ion pair of m/z 342＞327.The developed method exhibited good linearitywithin the range of0.0050 to0.100 ug/L.The regression equation was y=1 434 164.378 8x-704.012 5，and correlation was 0.999 4.The detection Limit was 0.03 mg/kg for melamine(RSN=10)and the recoveries for determining melamine were greater than 90%.The relative standard deviations were less than 5.0%.This method is simple and convenient,rapid,sensitive and accurate，and can meet analysis requirements ofmelamine in fisheryProducts and aquatic products.

fishery products and aquatic products；melamine； detection； gas chromatography-mass/mass spectrometrymethod

*梁寶愛，女，1963年出生，1983年畢業(yè)于太原理工大學化學分析專業(yè)，高級工程師。

2010-11-04