類胡蘿卜素純化及分析技術(shù)最新研究進展

張小明 賈艷青 許春潮 牟德華*

1（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018）2（定興縣質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗所，定興 072650）

·綜述評論·

類胡蘿卜素純化及分析技術(shù)最新研究進展

張小明1*賈艷青2許春潮2牟德華1**

1（河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050018）2（定興縣質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗所，定興 072650）

類胡蘿卜素是一類重要的天然色素的總稱，隨著現(xiàn)代分析檢測技術(shù)的快速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)了越來越多的類胡蘿卜素。通過對類胡蘿卜素的分析檢測技術(shù)如液相色譜法、質(zhì)譜法等以及前處理純化方法如膜分離技術(shù)、高速逆流色譜技術(shù)等進行總結(jié)，以期為今后進一步研究類胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)提供方便。

類胡蘿卜素；純化；分析技術(shù)

類胡蘿卜素是一類重要的天然色素，此外還具有許多重要的生理功能，如抗氧化、防癌、利于心血管和眼睛健康。類胡蘿卜素主要分為胡蘿卜素和葉黃素兩大類，幾種常見的類胡蘿卜素有番茄紅素、玉米黃素、全反式-β-類胡蘿卜素、花藥黃素、α-類胡蘿卜素、紫黃素等，普遍存在于動物、高等植物、真菌、藻類和細菌中。自從19世紀(jì)初分離出胡蘿卜素以來，至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近700多種天然的類胡蘿卜素，但是類胡蘿卜素的機體作用機制至今未解釋清楚，主要是因為其種類繁多，許多類胡蘿卜素還存在多種異構(gòu)體。近年來出現(xiàn)了很多關(guān)于類胡蘿卜素的研究，如張春秋等從馬鈴薯中成功提取類胡蘿卜素。還有一些研究人員以柿子皮、沙棘果、銀杏葉、螺旋藻、海蟹等為原料提取類胡蘿卜素。隨著可利用食品新資源的不斷豐富，提取出來的類胡蘿卜素種類也相應(yīng)增加，而其種類及其含量的準(zhǔn)確分析測定就成為當(dāng)代研究的一個重要內(nèi)容。

1 類胡蘿卜素檢測前純化技術(shù)研究進展

類胡蘿卜素在分析檢測之前一般要經(jīng)濃縮或者干燥過程進行純化，常用的方法有利用溶液極性不同進行梯度萃取分離法、薄層層析法等，雖然簡便易行，但分離效果較差。近年隨著科學(xué)技術(shù)的進步，出現(xiàn)了許多純化速度更快、效果更好的方法，如柱層析法、膜分離法、液相色譜法等。

1.1 柱層析法

柱層析法是將固定相裝在一金屬或玻璃柱中，或是將固定相附著在毛細管內(nèi)壁上做成色譜柱，試樣從柱頭到柱尾沿一個方向移動而進行分離的方法。胡曉丹等在提取金盞菊花中的類胡蘿卜素過程中，采用氧化鎂、氧化鋁和層析硅膠三種玻璃層析柱，以石油醚浸潤，類胡蘿卜素粗提液通過層析柱后，將洗脫液用薄層色譜法評價三種填充料的純化效果，數(shù)據(jù)顯示氧化鎂純化效果最優(yōu)。Cristiane H等應(yīng)用活化的氧化鎂/硅藻土（質(zhì)量比1∶1） 填充柱純化β-胡蘿卜素、葉黃素、新黃素和紫黃質(zhì)等幾種類胡蘿卜素，以便于高效液相色譜檢測。柱層析法一般用于類胡蘿卜素的粗提取，對單體顆粒以及直徑大小要求不嚴(yán)格，目前此種方法在國內(nèi)外應(yīng)用比較廣泛。

1.2 膜分離法

膜分離技術(shù)指在分子水平上，使不同粒徑分子的混合物在通過半透膜時選擇性分離，從而有效地實現(xiàn)溶液的濃縮，除去其他雜質(zhì)。李媛媛在研究膜分離技術(shù)法純化梔子黃色素影響因素時，采用陶瓷膜微濾對梔子黃色素萃取液原料進行不同壓力及膜孔徑條件下純化實驗，最終確定了陶瓷膜孔徑200 nm，壓力0.125 MPa是最佳的工藝參數(shù)。Ming Chih Chiu等曾利用平板高分子膜（NF10） 從粗制的棕櫚油中精制類胡蘿卜素，結(jié)果顯示分離效率極佳，建議在色素精制乃至食品行業(yè)進行推廣。

1.3 大孔吸附樹脂法

大孔吸附樹脂是依靠他和被吸附的分子之間的范德華引力，通過他巨大的比表面進行物理吸附而工作，使有機化合物根據(jù)吸附力及其分子量大小可以經(jīng)一定溶劑洗脫分開而達到分離、純化目的。陸偉等選擇了幾種不同的大孔樹脂對提取的梔子黃色素進行精制，結(jié)果顯示D3520和D140兩種樹脂精制效果較好。多種研究結(jié)果表明大孔吸附樹脂法兼具操作簡便，效率高等優(yōu)點，可直接應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

1.4 凝膠層析法

凝膠過濾層析是利用具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠分子篩作用，根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小不同來進行分離。呂曉玲等采用凝膠層析法對梔子黃色素進行精制，采用的支持劑為葡聚糖凝膠，進行了雙柱串聯(lián)層析，精制得率48.9%，得到的精制黃色素穩(wěn)定性得到極大提高。此種方法對于高分子物質(zhì)具有很好的分離效果，在未來的研究過程中可以逐步得以推廣。

1.5 高速逆流色譜法

高速逆流色譜是一種液-液色譜分離技術(shù)，即利用兩相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)建立起一種特殊的單向性流體動力學(xué)平衡，當(dāng)其中一相作為固定相，另一相作為流動相，在連續(xù)洗脫的過程中能保留大量固定相，不需要固體支撐體，物質(zhì)的分離依據(jù)其在兩相中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)。Hua Bin Li等應(yīng)用體積比為5∶5∶6.5∶3的正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水溶劑體系成功地從蝦青素綠球藻粗提物中得到純度大于97 g/100 g的蝦青素。Susanne Baldermann等采取體積比為30∶11∶18的正己烷、二氯甲烷、乙腈溶劑系統(tǒng)，在10℃、15℃、20℃和25℃四個溫度條件下從番茄醬粗提物中分離出全反式番茄紅素。此種方法可以避免因不可逆吸附而引起的樣品損失、變性、失活等，不但可以全部回收樣品，而且回收得到的樣品更能反映其本來的特性。

2 類胡蘿卜素分析檢測技術(shù)

類胡蘿卜素的分析檢測方法以前常用包括紙層析法、薄層色譜法、紫外可見光分光光度計法等。利用這些方法只能進行簡單的分析測定，卻不能實現(xiàn)含量、結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確分析鑒定，因此近年來出現(xiàn)了許多新的快速準(zhǔn)確的檢測技術(shù)。

2.1 色度計法

亨特色度法由三個基本坐標(biāo)表示顏色，亮度L*（L*=0生成黑色而L*=100指示白色），a*（負值指示綠色而正值指示品紅），b*（負值指示藍色而正值指示黃色）。色度計法主要是通過建立色度-含量曲線，再通過測得的色度結(jié)果推斷類胡蘿卜素的含量。此種方法廣泛應(yīng)用于測定蔬菜水果經(jīng)熱處理后顏色的變化，而且色度值與食品中的物質(zhì)含量及種類有關(guān)。A.Bengtssona等將實驗測得的參數(shù)結(jié)果α為橫坐標(biāo)，以β-類胡蘿卜素含量為縱坐標(biāo)，得到直線方程為y=25.4x－55.6（R=0.96），從而快速測定黃色果肉甘薯中β-胡蘿卜素含量。利用此種方法進行含量測定方便快捷，主要是外國學(xué)者研究此類方法。

2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成。N.M.Sachindra等采用C18柱子，流動相為體積濃度80%～100%的甲醇溶液，流速為2.0 mL/min，吸收波長為440 nm，結(jié)果顯示在印度海洋生長的蟹中其蝦青素及其酯類為主要的類胡蘿卜素，而在淡水中生長的蟹玉米黃質(zhì)占其類胡蘿卜素的大部分。J.P.Chena等應(yīng)用了一種改進的HPLC的方法，流動相為體積比99∶1的甲醇/異丙醇（A） 與二氯甲烷（B） 進行梯度流動分析，采用C30柱，檢測波長為450 nm，進樣流速1.0 mL/min，測定出來臺灣芒果中至少存在25種類胡蘿卜素。Verica Dragovic-Uzelac等利用此種法分析了三個品種的杏中的類胡蘿卜素含量與成熟期及品種的關(guān)系，分析得到的類胡蘿卜素主要為β-胡蘿卜素、γ-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素和葉黃素等。高效液相色譜法在國內(nèi)外各種研究中應(yīng)用非常普遍。

2.3 毛細管液相色譜法

毛細管液相色譜法與普通的液相色譜法的檢測原理類似，即用毛細管柱代替了常規(guī)液相柱。這種分析方法可以節(jié)省樣品的用量，因而減少了有機溶劑的消耗和對環(huán)境的污染。

Hui Xu等采用毛細管液相色譜法對固相微萃取技術(shù)提取的β-胡蘿卜素進行測定分析，采用單片硅ODS柱，其中最優(yōu)條件：樣品量100 nL；檢測波長452 nm；甲醇做流動相；流速1.0 μL/min。β-胡蘿卜素檢測限1.9 ng/mL，結(jié)果顯示此方法的峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。隨著分析儀器向小型化發(fā)展的趨勢，毛細管液相色譜將越來越多地被人們使用。

2.4 凝膠滲透色譜法

凝膠滲透色譜法是根據(jù)物質(zhì)在分離柱上不同的分子流體力學(xué)體積大小進行分離測定。當(dāng)儀器和實驗條件確定后，溶質(zhì)的淋出體積與其分子量呈反比關(guān)系。Dan Qiu等借助凝膠滲透色譜法，進行了固體β-胡蘿卜素經(jīng)加熱后異構(gòu)化產(chǎn)物及降解反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定，系統(tǒng)由Waters 1525 HPLC高壓泵、Waters 2414 RI檢測器、HR3-HR2-HR1色譜柱組成，采用洗提液為四氫呋喃，流速1.0 mL/min，通過得到的分子量與時間曲線進行結(jié)果分析。應(yīng)用凝膠滲透色譜法可以有效的鑒定不同分子大小的類胡蘿卜素。

2.5 質(zhì)譜儀法

質(zhì)譜儀法是一種利用電場和磁場將運動的離子（帶電荷的原子、分子或分子碎片）按他們的質(zhì)荷比分離后進行檢測的方法。Cristiane H等在測定菊苣和新西蘭菠菜中類胡蘿卜素受成熟度、季節(jié)及加工因素的影響時，采用質(zhì)譜儀法進一步鑒定類胡蘿卜素的分子量，電子轟擊質(zhì)譜Waters集成系統(tǒng)配置有HPLC-MS接口，霧化器溫度為90℃，電離電壓為70 eV，離子源溫度為210℃，質(zhì)核比為150～650，最后得到的鑒定結(jié)果顯示，新葉黃素和紫黃質(zhì)質(zhì)荷比m/z為600，葉黃素分子量為568，β-胡蘿卜素分子量為536，為更準(zhǔn)確地鑒定物質(zhì)提供了有利的數(shù)據(jù)。由于質(zhì)譜分析具有靈敏度高，樣品用量少，分析速度快，分離和鑒定同時進行等優(yōu)點而被人們廣泛采用。

2.6 紅外光譜法

每種物質(zhì)分子都具有由其組成和結(jié)構(gòu)決定的獨有的紅外吸收光譜，用紅外光譜法，可以根據(jù)光譜中吸收峰的位置、形狀來推斷被檢測物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，依照特征吸收峰的強度來測定混合物中各組分的含量。

Daniel E等在分析西紅柿中類胡蘿卜素含量時，借助FTS 3 500GX傅立葉變化紅外光譜儀，操作分辨率為8 cm-1，吸收波譜通過高頻區(qū)400 cm-1～7 000 cm-1確定，通過類胡蘿卜素的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分析西紅柿中的類胡蘿卜素，從而確定西紅柿的品種及產(chǎn)區(qū)，該方法快速簡單，科學(xué)性強。Xinjuan Chen等利用近紅外系統(tǒng)，采用的反射光譜（log 1/R） 為1 100 nm～2 500 nm，以2 nm為間隔，檢測了151個中國羽衣甘藍樣品中的葉黃素和β-胡蘿卜素。這種方法與HPLC法相比更加精確，同時此法具有快速、高靈敏度、檢測試樣用量少等優(yōu)點，將來必然會應(yīng)用到類胡蘿卜素的更多檢測工作中。

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Arecent survey research on purification and analysis ofcarotenoids

ZHANGXiao-ming1*JIAYan-qin2XUChun-chao2Mou De-hua1**
1(College ofbiologyscience and engineering，Hebei universityofscience and technology，Shijiazhuang 050018，China)
2(Hebei province dingxingcountyqualityand technical supervision&testinginstitute，Dingxingxian 072650，China)

Carotenoids comprise a class of natural pigments.With the rapid development of analysis methods，more and more carotenoids were found.The high-performance ion chromatography （HPIC），Mass Spectrometry（MS），membrane separation and High-speed Countercurrent Chromatography （HSCCC）were summarized.These enabled further investigation of Structure and Properties ofcarotenoids.

carotenoids；purification；analysis method

*張小明，男，1986年出生，河北科技大學(xué)在讀碩士研究生。

**通訊作者：牟德華，男，教授，主要從事農(nóng)產(chǎn)品深加工以及天然產(chǎn)物分離的研究。Email:dh-mou@163.com.

2010-09-25