實(shí)驗(yàn)性水上漂浮、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠ＨＰＡ軸和免疫系統(tǒng)的影響

王　堅(jiān)　趙　旦　李　潔　王國(guó)洪　胡蘭萍　邵加慶　顧　萍　杜　宏　王揚(yáng)天

摘要：目的：探討大鼠經(jīng)實(shí)驗(yàn)性水上漂浮、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后血清皮質(zhì)酮（CORT）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）以及白細(xì)胞介素1β、IL-6（IL-1β、IL-6）的變化及垂體ACTH陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的變化。方法：將大鼠隨機(jī)分為水上漂浮組（A組）、水上漂浮并高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（B組）、對(duì)照組（C組），每組12只，均為10周齡雄性大鼠。A組在人工造浪水池中接受連續(xù)180min的水上漂浮，并加以貓恐嚇；B組按A組給予如前180min水上漂浮后繼續(xù)給予連續(xù)奔跑120min；C組除與A組、B組同時(shí)禁食、水外不給任何應(yīng)激。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后測(cè)定CORT、ACTH及IL-1β、6水平及行垂體ACTH陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的免疫組化分析。結(jié)果：與C組相比，A組CORT水平稍增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），而B組CORT的升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；與A組相比，B組CORT亦升高（P<0.01）。與C組相比，A組血清ACTH水平無(wú)改變（P>0.05）,而B組ACTH降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.033）。與C組相比，A組IL-6升高（P＝0.023），B組IL-1β、IL-6均升高（P＝0.031，0.022）。免疫組化染色示A、B組垂體ACTH表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量皆減少（P皆<0.05），但A、B組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：急性心理應(yīng)激可激活下丘腦-垂體-腎上腺軸，并導(dǎo)致細(xì)胞因子IL-6血濃度增加，在心理應(yīng)激基礎(chǔ)上予以單次大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可進(jìn)一步增加大鼠應(yīng)激反應(yīng)的程度，致CORT以及細(xì)胞因子IL-1β、6血濃度進(jìn)一步升高，而ACTH受抑，且垂體ACTH陽(yáng)性細(xì)胞也相應(yīng)減少。

關(guān)鍵詞：大鼠；水上漂??；高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)；垂體腎上腺軸；白細(xì)胞介素

中圖分類號(hào)：G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1004-4590(2009)02-0068-04

下丘腦－垂體－腎上腺軸（hypothalamic-pituitary-adrenal axis ，HPA軸）是與應(yīng)激關(guān)系最為密切的內(nèi)分泌軸，無(wú)論是心理性應(yīng)激還是運(yùn)動(dòng)應(yīng)激對(duì)HPA軸都有影響，表現(xiàn)為促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotrophic hormone，ACTH）和皮質(zhì)醇水平的改變。HPA軸的激活或抑制主要與心理性應(yīng)激或運(yùn)動(dòng)應(yīng)激的時(shí)間和強(qiáng)度有關(guān)。一般說(shuō)來(lái)，急性應(yīng)激可激活HPA軸，但慢性應(yīng)激對(duì)HPA軸有抑制作用。細(xì)胞因子是一種具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的高活性小分子蛋白質(zhì)，能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能，與應(yīng)激的聯(lián)系亦十分密切。近年來(lái)對(duì)應(yīng)激的研究逐步發(fā)展，形成了以心理－神經(jīng)內(nèi)分泌－免疫網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)之跨學(xué)科概念。本文將急性心理應(yīng)激、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)結(jié)合起來(lái)，旨在觀察急性心理應(yīng)激及急性心理應(yīng)激與大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)結(jié)合后對(duì)HPA軸和部分細(xì)胞因子的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

于大鼠跑臺(tái)適應(yīng)性訓(xùn)練3天，剔除無(wú)法進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)大鼠后成功篩選雄性Sprague-Dawley大鼠36只，鼠齡10周，體重180±20g（南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供）。試驗(yàn)前在清潔級(jí)動(dòng)物飼養(yǎng)中心以標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物維持期飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食和飲水，室內(nèi)溫度為20-26°C，濕度50%-70%，自然晝夜節(jié)律光照。大鼠隨機(jī)分為三組：水上漂浮組（A組）、水上漂浮并高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)組（B組）、對(duì)照組（C組），每組均為12只。

1.2 實(shí)驗(yàn)性水上漂浮、高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)模型的建立

實(shí)驗(yàn)性水上漂浮主要將大鼠置于人工造浪池中進(jìn)行：采用敞開(kāi)式塑料泡沫漂浮器（1×0.6×0.3m），將漂浮器置于1.8m直徑的圓形造浪池中，調(diào)節(jié)造浪強(qiáng)度至漂浮器產(chǎn)生±15°的搖擺度。將實(shí)驗(yàn)鼠置于漂浮器中，并由間隔0.75m的土貓進(jìn)行恐嚇。期間主要是綜合采用Adamec等提出的土貓恐嚇應(yīng)激模型［1］及新環(huán)境應(yīng)激模型以形成急性心理應(yīng)激。高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)模型采用大鼠跑臺(tái)［2］，實(shí)驗(yàn)前篩選大鼠的適應(yīng)性訓(xùn)練負(fù)荷為坡度0％，速度15m/min，歷時(shí)10min，共3天；實(shí)驗(yàn)時(shí)負(fù)荷為5%坡度，速度26.8m/min，連續(xù)奔跑120min，跑程為3216m。

1.3 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

晨8時(shí)將A組與B組大鼠進(jìn)行歷時(shí)180min的水上漂浮，并給予土貓恐嚇，之后A組大鼠結(jié)束實(shí)驗(yàn)而B組大鼠繼續(xù)進(jìn)行持續(xù)120min的跑臺(tái)奔跑。按實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)若跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)時(shí)大鼠提前出現(xiàn)力竭癥狀，即不能堅(jiān)持負(fù)荷跑速,滯留跑道后1/3處達(dá)3次以上，則提前處死。但本實(shí)驗(yàn)中無(wú)提前處死大鼠。

1.4 取樣和測(cè)試

實(shí)驗(yàn)結(jié)束，立即用水合氯醛腹腔麻醉，心臟靜脈竇取血5ml，制備血清待測(cè)皮質(zhì)酮(Corticosterone，CORT）、ACTH、白細(xì)胞介素1β、IL-6（Interleukin1β、6, IL-1β、IL-6）水平。測(cè)試均采用放射免疫分析法。ACTH、IL-1β、IL-6試劑盒由北京福瑞生物工程公司提供，大鼠CORT試劑盒由美國(guó)DSL公司提供。垂體ACTH陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞免疫組化采用EnVision方法。

1.5 統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)值均以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（mean±SD）表示, 統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS11.0版軟件完成,。三組間比較采用One－Way ANOVA，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。垂體ACTH細(xì)胞免疫組化每張切片取5個(gè)視野，以陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比行秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般情況

C組大鼠神態(tài)安靜，皮毛光潔整齊，眼睛有神；A組、B組大鼠在急性心理應(yīng)激階段出現(xiàn)皮毛聳立，雙上肢離地直立現(xiàn)象顯著增多；B組大鼠進(jìn)行高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練后表現(xiàn)為神態(tài)倦怠、眼神黯淡無(wú)光、呼吸深急幅度大。

2.2 血清ACTH和CORT水平

與C組相比，A組CORT水平略增高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；而B組CORT的升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；且與A組相比，B組CORT水平亦升高（P<0.01）。（圖1）

與C組相比，A組血清ACTH水平無(wú)改變（P>0.05）,而B組ACTH降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.033）。（圖2）

2.3 血清IL-1β、IL-6水平

與C組相比，A組IL-1β無(wú)顯著改變（P>0.05），而IL-6升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.023）；B組IL-1β、IL-6均升高（P＝0.031，0.022）。（圖3）

2.4 垂體ACTH表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞免疫組化

光鏡下，各組大鼠垂體組織切片免疫組化染色均可見(jiàn)ACTH陽(yáng)性細(xì)胞：多為不規(guī)則形和星形，也可為圓形，彌漫分布于腺垂體遠(yuǎn)側(cè)部，陽(yáng)性物質(zhì)定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，為棕褐色，高倍鏡下呈顆粒狀。

C組，ACTH陽(yáng)性細(xì)胞染色深，為強(qiáng)陽(yáng)性反應(yīng)，數(shù)量約占總細(xì)胞數(shù)的30%~40%；A組、B組ACTH陽(yáng)性細(xì)胞染色較深，數(shù)量較C組相比顯示減少（P<0.05），占細(xì)胞總數(shù)的5%～20%，但A、B組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（圖4）

3 討 論

目前用以評(píng)價(jià)應(yīng)激程度的指標(biāo)多采用皮質(zhì)酮（鼠）、皮質(zhì)醇（人）、ACTH?？偟膩?lái)說(shuō)，下丘腦的室旁核是HPA軸活動(dòng)的直接控制部位［3］。在受到刺激時(shí)，室旁核的小細(xì)胞神經(jīng)元分泌促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素和精氨酸加壓素，經(jīng)垂體門脈系統(tǒng)到達(dá)垂體前葉，刺激垂體分泌ACTH，隨血流到達(dá)腎上腺，刺激腎上腺皮質(zhì)合成和分泌糖皮質(zhì)激素。

心理應(yīng)激對(duì)HPA軸的影響與應(yīng)激作用的時(shí)間有關(guān)。一般應(yīng)激發(fā)生后5-10秒，促腎上腺皮質(zhì)激素分泌，數(shù)分鐘后，血漿中糖皮質(zhì)激素水平開(kāi)始升高，分泌高峰在應(yīng)激后30分鐘和1小時(shí)出現(xiàn)。因此，不同時(shí)程的應(yīng)激引發(fā)HPA軸的變化也有所不同。胡等指出：短期、急性應(yīng)激刺激可使大鼠皮質(zhì)酮水平顯著升高，在10分鐘內(nèi)增加8-10倍［4］。而Zarkovic的研究表明，長(zhǎng)期心理應(yīng)激可抑制皮質(zhì)激素的釋放［3］。本研究觀察到急性心理應(yīng)激后大鼠出現(xiàn)皮毛聳立、雙上肢離地直立等探索性行為現(xiàn)象顯著增多，表明大鼠處于焦慮狀態(tài)［5］，但CORT水平的升高及ACTH水平的下降均不顯著，有觀察表明血清皮質(zhì)酮水平與應(yīng)激強(qiáng)度呈顯著的正相關(guān)［6］，據(jù)此亦能說(shuō)明本研究中的水上漂浮并貓恐嚇作為急性心理應(yīng)激其程度仍較輕。

運(yùn)動(dòng)本身作為一種軀體應(yīng)激原可造成機(jī)體各種生理生化和行為的改變，有時(shí)甚至?xí)纬筛鞣N新的應(yīng)激原反作用于個(gè)體。本研究采用的跑臺(tái)模型是一種經(jīng)典的大鼠運(yùn)動(dòng)模型。根據(jù)Bedford最大攝氧量（VO2max）與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的關(guān)聯(lián)分析［7］以及勞動(dòng)強(qiáng)度的劃分方法：中等強(qiáng)度勞動(dòng)為40％VO2max，重度勞動(dòng)為64％VO2max，極重度勞動(dòng)為70％VO2max，本研究采取的是單次大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)模型，最大攝氧量為74.3％±2.9％，符合本實(shí)驗(yàn)所需。

一般認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)要造成HPA軸的激活，需要達(dá)到一定的強(qiáng)度閾值和時(shí)間閾值［8］，強(qiáng)度閾值激發(fā)了激素的反應(yīng)速度，時(shí)間閾值則決定激素的釋放總量［9］。Luger指出，當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度達(dá)到50％～60％VO2max強(qiáng)度時(shí)，即可導(dǎo)致強(qiáng)度依賴性HPA軸的激活，表現(xiàn)為ACTH和皮質(zhì)酮的升高［10］。Wittert也認(rèn)為在無(wú)氧閾以上的急性大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可激活HPA軸［11］。然而，當(dāng)長(zhǎng)期劇烈運(yùn)動(dòng)或力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)，皮質(zhì)酮水平往往下降，尤其在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中更為常見(jiàn)。對(duì)此的解釋主要有兩類：有學(xué)者認(rèn)為力竭運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)體糖原消耗很大，大量蛋白質(zhì)分解為氨基酸進(jìn)行糖異生，此時(shí)HPA軸受到抑制，腎上腺皮質(zhì)激素耗竭；但更多的學(xué)者認(rèn)為激烈運(yùn)動(dòng)中血漿CORT下降是“機(jī)體對(duì)能源致命性消耗所表現(xiàn)的一種防御性反應(yīng)”，此時(shí)腎上腺并未衰竭，可能是通過(guò)神經(jīng)調(diào)節(jié)使垂體減少了ACTH的釋放，導(dǎo)致皮質(zhì)酮分泌減少［12］。本研究中，B組皮質(zhì)酮水平較A組進(jìn)一步明顯升高，提示單次高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)心理應(yīng)激大鼠可產(chǎn)生更大程度的應(yīng)激，與尹劍春等［13］的中小負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)心理應(yīng)激后的大鼠皮質(zhì)酮釋放影響之結(jié)果截然不同。而本研究中ACTH的降低，推測(cè)可能與以下因素有關(guān)：①相比于皮質(zhì)酮，ACTH對(duì)應(yīng)激的反應(yīng)更快速，而半衰期卻較短，故其分泌峰值出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后的即刻，早于皮質(zhì)酮；②在HPA軸中，皮質(zhì)酮的負(fù)反饋調(diào)節(jié)可使ACTH的分泌受到抑制；③可能存在其他ACTH分泌的抑制機(jī)制。

垂體免疫組化檢查結(jié)果表明ACTH陽(yáng)性染色在不同大鼠間有較大差異，A組、B組大鼠ACTH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較C組減少。Polkowska的研究提示大鼠在經(jīng)歷20min/h、共4h的足底電擊以形成急性應(yīng)激后，垂體ACTH、β－內(nèi)啡肽、PRL的免疫組化染色反應(yīng)顯著降低；而當(dāng)大鼠經(jīng)歷20min/h、連續(xù)9h、共3天的長(zhǎng)時(shí)間應(yīng)激后，ACTH、β－內(nèi)啡肽的分泌活性增加，并表現(xiàn)為細(xì)胞的肥大和增生［29］。Kaur的研究也指出，大鼠在經(jīng)歷連續(xù)7天的高原低氧應(yīng)激后，ACTH陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)顯著的增生和肥大，且ACTH分泌增加［30］。本研究屬于急性應(yīng)激反應(yīng)，垂體的免疫組化結(jié)果與Polkowska的結(jié)果以及血液中ACTH水平下降相吻合。說(shuō)明經(jīng)歷急性心理應(yīng)激和大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，垂體ACTH分泌功能亦表現(xiàn)為受抑反應(yīng)。

應(yīng)激對(duì)免疫功能的影響可表現(xiàn)為影響細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。IL-1β和IL-6能啟動(dòng)并放大應(yīng)激后的急性期反應(yīng)，促進(jìn)肝細(xì)胞源性急性期蛋白如C反應(yīng)蛋白的合成［14］。既往的研究認(rèn)為急性心理應(yīng)激能引起IL-1β的升高［15］，而IL-1亦能作用于HPA軸致皮質(zhì)醇分泌增高［16］，從而通過(guò)糖皮質(zhì)激素受體及干擾NF-κB的激活來(lái)抑制細(xì)胞因子諸如IL-2、IL-4等的進(jìn)一步生成而調(diào)控免疫功能［17］。Heinz的研究表明急性劇烈心理應(yīng)激下過(guò)度增高的皮質(zhì)醇并不會(huì)造成IL-1水平的下降［18］，Reyes的研究也提示IL-6不受增高的皮質(zhì)酮所抑制［19］。但I(xiàn)L-6對(duì)心理應(yīng)激的反應(yīng)是極為迅速的［20, 21］，在動(dòng)物試驗(yàn)中，足底電擊、束縛應(yīng)激等心理應(yīng)激都能使IL-6水平升高［22, 23］，在人體試驗(yàn)中也有類似結(jié)果［24］。Li等提出IL-6的增高可能與急性心理應(yīng)激后雌二醇水平增高，從而促進(jìn)外周血單核細(xì)胞IL-6的分泌有關(guān)［25］。運(yùn)動(dòng)對(duì)細(xì)胞因子分泌亦有影響。運(yùn)動(dòng)可引起細(xì)胞因子IL-1β、IL-6濃度增加［20］。其機(jī)制可能與以下因素有關(guān)：（1）運(yùn)動(dòng)過(guò)程中局部骨骼肌的損傷［26］；(2)外周血單核細(xì)胞中各細(xì)胞亞群發(fā)生變化，分泌IL-1、IL-6的CD4+細(xì)胞比例增高［27］；（3）運(yùn)動(dòng)過(guò)程中運(yùn)動(dòng)器官與內(nèi)臟器官之間血液重新分配，導(dǎo)致腸粘膜缺血，腸腔中內(nèi)毒素移入循環(huán)系統(tǒng)，進(jìn)而觸發(fā)單核巨嗜細(xì)胞合成與釋放細(xì)胞因子［28］。本次研究中，急性心理應(yīng)激后，IL-1僅略升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，IL-6顯著增高，說(shuō)明IL-6對(duì)心理應(yīng)激的反應(yīng)更為迅速。在繼續(xù)經(jīng)歷高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后，IL-1、IL-6均顯著增高，表明高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可引起IL-1、IL-6的增高。由于免疫網(wǎng)絡(luò)本身很復(fù)雜，神經(jīng)—內(nèi)分泌－免疫網(wǎng)絡(luò)就更復(fù)雜，應(yīng)激所引發(fā)的免疫功能改變及其與HPA軸的變化之間的關(guān)系尚需進(jìn)一步研究探討。

致謝

感謝南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)大鼠，感謝江蘇省體育科學(xué)研究所武露凌主任指導(dǎo)動(dòng)物試驗(yàn)并提供大鼠跑臺(tái)，感謝南京軍區(qū)南京總醫(yī)院病理科周曉軍、吳波、鄭曉剛主任提供實(shí)驗(yàn)條件并指導(dǎo)免疫組化檢測(cè)。

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