長期體外培養(yǎng)對(duì)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化潛能的影響

劉廣鵬 張文杰 李宇琳 孫 劍 周 恒 崔 磊

長期體外培養(yǎng)對(duì)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化潛能的影響

劉廣鵬 張文杰 李宇琳 孫 劍 周 恒 崔 磊

目的觀察體外長期培養(yǎng)對(duì)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs）成骨分化潛能的影響，探討其作為組織工程骨種子細(xì)胞的可行性。方法流式細(xì)胞技術(shù)觀察長期體外培養(yǎng)的UCB-MSCs細(xì)胞表面抗原表達(dá)的變化規(guī)律，并通過Alizarin Red染色及堿性磷酸酶活性、骨鈣蛋白含量和鈣離子含量的檢測(cè)觀察長期體外培養(yǎng)對(duì)UCB-MSCs成骨特性的影響。結(jié)果體外長期傳代培養(yǎng)的UCB-MSCs能夠高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，7代之前的細(xì)胞體外增殖能力不隨傳代次數(shù)而發(fā)生明顯變化。Alizarin Red染色及堿性磷酸酶活性、骨鈣蛋白含量和鈣離子含量的檢測(cè)顯示8代之前的UCB-MSCs仍能保持較強(qiáng)的成骨分化能力。結(jié)論7代之前的UCB-MSCs能保持穩(wěn)定的體外成骨分化特性，有望成為較理想的組織工程骨種子細(xì)胞。

人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞組織工程成骨分化體外培養(yǎng)

骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（Bone marrow stromal cells, BMSCs）一直是成體干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)。BMSCs通過細(xì)胞信號(hào)通路，分泌造血細(xì)胞生長因子等方式對(duì)造血干細(xì)胞（Hematopoietic stem cells,HSCs）的增殖分化具有支持、營養(yǎng)作用，同時(shí)具有在特定條件下快速增殖、定向分化等干細(xì)胞特性[1-2]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，在臍帶血（Umbilical cord blood,UCB）中也存在類似的間充質(zhì)干細(xì)胞（UCB derived mesenchymal stem cells，UCB-MSCs）。與BMSCs相比，UCB-MSCs來源更豐富，取材更方便，蘊(yùn)藏著巨大的臨床應(yīng)用價(jià)值[3-4]。本研究將對(duì)人UCB-MSCs長期體外培養(yǎng)過程中細(xì)胞表面標(biāo)志、增殖與成骨分化潛能等特性進(jìn)行闡述，研究其作為組織工程骨種子細(xì)胞的可行性。

1 材料與方法

1.1 UCB-MSCs的分離與培養(yǎng)

5份臍血標(biāo)本均來源于上海第六人民醫(yī)院產(chǎn)科，獲得產(chǎn)婦同意。以等量的PBS緩沖液混勻，緩慢滴入到等量的淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll，美國Sigma公司)，600 g離心20 min。抽取白膜層細(xì)胞，以等量的PBS緩沖液洗滌離心，基礎(chǔ)培養(yǎng)液（含低糖DMEM，10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和鏈霉素、2 mmol/L L-谷氨酰胺）重懸，接種至100 mm培養(yǎng)皿，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第5天首次全量換液，之后每周2次換液，2周后達(dá)60%～80%融合時(shí)，0.25%胰酶（含0.02%EDTA）消化傳代。

1.2 UCB-MSCs細(xì)胞表面抗原分析

分別取第1、4、7、10代細(xì)胞，胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液。含2%牛血清白蛋白的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞，室溫下分別與CD29-PE、CD31-PE、CD34-PE、CD45-PE、CD105-PE及CD166-FITC單克隆抗體避光孵育15 min。PBS緩沖液沖洗細(xì)胞，離心，棄上清。加入含1%多聚甲醛的PBS緩沖液0.2 mL，使用同型對(duì)照單克隆抗體確定背景標(biāo)記，流式細(xì)胞儀（Beckman Coulter）分析標(biāo)記細(xì)胞。

1.3 UCB-MSCs體外增殖能力檢測(cè)

分別取第1、4、7、10代細(xì)胞，胰蛋白酶消化，接種24孔板，每孔1×103個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)儀連續(xù)計(jì)數(shù)10 d，每天計(jì)數(shù)3孔，繪制生長曲線，計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間。

1.4 UCB-MSCs成骨分化能力檢測(cè)

分別取第1、4、7、10代細(xì)胞，胰蛋白酶消化，接種6孔板，每孔1×105個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞接種次日起改用成骨條件培養(yǎng)液進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。誘導(dǎo)液配方：基礎(chǔ)培養(yǎng)液，10～8 M地塞米松，10 mM β-磷酸甘油酸鈉，50 μg/L磷酸抗壞血酸。誘導(dǎo)2周后行Alizarin Red染色[5]，觀察細(xì)胞外基質(zhì)鈣化和鈣結(jié)節(jié)形成情況，并測(cè)定鈣離子含量。以未誘導(dǎo)組細(xì)胞作為對(duì)照。

細(xì)胞成骨誘導(dǎo)2周時(shí)，同時(shí)行堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，ALP）活性和骨鈣蛋白（Osteocalcin，OCN）含量測(cè)定，觀察細(xì)胞成骨分化狀況。采用磷酸對(duì)硝基苯酯二鈉鹽（美國Sigma公司）比色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ALP活性，OCN放免試劑盒（美國Biomedical Technologies公司）檢測(cè)OCN含量，實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒說明操作。以未誘導(dǎo)組細(xì)胞作為對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SAS 6.12統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，采用方差分析和Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05認(rèn)為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

原代細(xì)胞接種5 d后首次換液，細(xì)胞呈圓形或短梭形（圖1A）。9 d后細(xì)胞進(jìn)入增殖期，形成細(xì)胞集落，細(xì)胞形態(tài)也逐漸向長梭形改變（圖1B）。2周后基本達(dá)到70%融合狀態(tài)，傳代培養(yǎng)。傳代后細(xì)胞分布均勻，呈成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，4～5 d后可達(dá)80%融合。

圖1 原代培養(yǎng)的UCB-MSCs形態(tài)學(xué)觀察（A：第5天；B：第9天）

2.2 細(xì)胞表面抗原分析

不同代次UCB-MSCs表面抗原檢測(cè)結(jié)果見表1。第1～10代細(xì)胞的CD29、CD105和CD166均呈較高表達(dá)，陽性率在50%～60%左右。CD31、CD34和CD45則呈低表達(dá)，陽性率不超過5%。

表1 不同代次UCB-MSCs表面抗原的陽性表達(dá)率（%）（n=5）

2.3 細(xì)胞倍增時(shí)間分析

細(xì)胞傳代培養(yǎng)的潛伏期約為36～48 h，第2～3天開始，數(shù)量逐漸增多，對(duì)數(shù)增殖期約為5～7 d，隨后進(jìn)入增殖平臺(tái)期。根據(jù)生長曲線可知，UCB-MSCs的群體倍增時(shí)間為（36.5±5.52）h。從第7代開始細(xì)胞倍增時(shí)間逐漸延長達(dá)（45.6±4.28）h，差異有顯著性意義（P＜0.05）。

2.4 細(xì)胞成骨分化能力檢測(cè)

UCB-MSCs成骨誘導(dǎo)2周后，Alizarin Red染色為陽性，形成面積大小不等的紅色鈣鹽沉積區(qū)域。對(duì)照組則始終無明顯鈣沉積。細(xì)胞傳代至第10代時(shí)，成骨誘導(dǎo)組仍有鈣鹽沉積形成，但與之前代次細(xì)胞相比，成骨能力明顯下降（圖2）。

鈣離子定量（圖3）、ALP活性（圖4）和OCN含量（圖5）的檢測(cè)結(jié)果則表明，與未誘導(dǎo)組相比，UCB-MSCs傳至第7代時(shí)仍保持較強(qiáng)的成骨分化能力。其中第7代細(xì)胞的ALP活性和OCN含量開始下降，第10代細(xì)胞的鈣離子含量則明顯降低，但仍顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。

圖2 UCB-MSCs成骨誘導(dǎo)2周后Alizarin Red染色

圖3 鈣離子定量檢測(cè)

圖4 堿性磷酸酶活性檢測(cè)

圖5 骨鈣蛋白含量檢測(cè)

3 討論

與骨髓（Bone marrow,BM）含有HSCs一樣，人臍帶血（Umbilical cord blood,UCB）中也含有數(shù)量較為豐富的HSCs。并且臍帶血免疫原性相對(duì)較弱，其淋巴細(xì)胞相對(duì)不成熟，可用于人類白細(xì)胞抗原（HLA）配型不符者之間的輸注[6-8]。因此，UCB用于治療造血系統(tǒng)疾病已有10余年歷史，國內(nèi)一些城市也建立了相應(yīng)的UCB庫。BMSCs通過細(xì)胞信號(hào)通路，分泌造血細(xì)胞生長因子等方式對(duì)HSCs的增殖分化具有支持、營養(yǎng)作用，同時(shí)還具有在特定條件下快速增殖、定向分化等干細(xì)胞特性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在UCB中也存在類似的MSCs。這類細(xì)胞不表達(dá)造血系標(biāo)志（CD34、CD45、vWF等），而與BMSCs具有類似的生物學(xué)行為（貼壁生長、成纖維細(xì)胞形態(tài)）和細(xì)胞表面標(biāo)志（CD105、CD166、SH2、SH3等）[2-4]。

本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了常用的鑒定間充質(zhì)來源的細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD105和CD166，發(fā)現(xiàn)這些表面抗原在UCB-MSCs中呈較高表達(dá)，而低表達(dá)造血系細(xì)胞的表面抗原，如CD31、CD34和CD45。并且體外長期傳代培養(yǎng)未影響細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，與BMSCs比較相似，表明密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)的方法可以獲得臍血來源的MSCs。而對(duì)傳代細(xì)胞倍增時(shí)間的分析結(jié)果顯示，隨傳代次數(shù)增多，7代之內(nèi)的細(xì)胞群體倍增時(shí)間變化不明顯，7代之后則逐漸延長，差異有顯著性。

MSCs表達(dá)、合成成骨特異性蛋白及細(xì)胞外鈣鹽沉積，是檢測(cè)MSCs向成骨細(xì)胞定向分化的標(biāo)志物。作為骨組織重要的基質(zhì)蛋白，ALP活性的高表達(dá)是成骨細(xì)胞成熟的重要標(biāo)志，而OCN主要沉積在骨組織的細(xì)胞外基質(zhì)，被認(rèn)為是成骨細(xì)胞特征性的蛋白質(zhì)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到7代之前的UCB-MSCs成骨誘導(dǎo)后能夠高表達(dá)ALP和OCN，而第10代的鈣離子含量則顯著降低。結(jié)合抗原分析與細(xì)胞倍增時(shí)間的結(jié)果，表明7代之前的UCB-MSCs具有較高的成骨分化能力和體外增殖能力。體內(nèi)回植的方法是評(píng)價(jià)MSCs成骨潛能的最有價(jià)值的標(biāo)準(zhǔn)[11]。因此，UCB-MSCs是否能夠作為組織工程骨的種子細(xì)胞，還需要進(jìn)一步開展體內(nèi)回植的相關(guān)研究。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，UCB-MSCs為間充質(zhì)來源的干細(xì)胞，生物學(xué)性能穩(wěn)定，較長期（7代之內(nèi)）體外傳代培養(yǎng)仍能保持成骨分化能力，有望在組織工程及再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域獲得進(jìn)一步的應(yīng)用。

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The Effects of Long-term Culture In Vitro on the Osteogenic Differentiation Potential of Human Umbilical Cord Blood Derived Mesenchymal Stem Cells

LIU Guangpeng1,ZHANG Wenjie2,LI Yulin1,SUN Jian1,ZHOU Heng1,CUI Lei12.
1 Shanghai Tissue Engineering Research and Development Center,Shanghai 200235,China.2 Tissue Engineering Key Laboratory,Shanghai Ninth People′s Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.

ObjectiveTo observe the effects of long-term culture in vitro on the osteogenic differentiation potential of human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells(UCB-MSCs).MethodsThe CD markers of UCB-MSCs were identified by flow cytometric analysis.Osteogenic differentiation of UCB-MSCs at different passages was evaluated by Alizarin Red staining,and measurement of alkaline phosphatase activity,osteocalcin content,and calcium content respectively.ResultsThe CD marker expression of UCB-MSCs maintained high until passage 10,while the osteogenic differentiation potential of UCB-MSCs began to decrease from passage 7.ConclusionUCB-MSCs(before passage 7)may serve as optimal seed cells for tissue engineered bone.

Human umbilical cord blood derived mesenchymal stem cells;Tissue engineering;Osteogenic differentiation; Long-term culture in vitro

Q813.1+1

A

1673－0364（2009）－01－0004－03

2008年11月13日；

2009年1月5日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.002

國家自然科學(xué)基金（30800232）；上海市科技啟明星計(jì)劃項(xiàng)目（07QA14053）；上海－英格蘭東北地區(qū)科技合作計(jì)劃（075407072）。

200235上海市上海組織工研究與開發(fā)中心（劉廣鵬，李宇琳，孫劍，周恒，崔磊）。200011上海市上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院組織工程實(shí)驗(yàn)室（張文杰，崔磊）。