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    絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管的皮膚致敏實驗

    2009-04-11 05:06:53嚴(yán)小莉趙亞紅趙微加楊宇民
    組織工程與重建外科雜志 2009年1期
    關(guān)鍵詞:絲素紅斑導(dǎo)管

    嚴(yán)小莉 趙亞紅 趙微加 楊宇民

    絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管的皮膚致敏實驗

    嚴(yán)小莉 趙亞紅 趙微加 楊宇民

    目的評價本實驗室自制的絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管對皮膚潛在的致敏性。方法以ISO 10993-10:1995標(biāo)準(zhǔn),采用最大劑量法,將白化豚鼠分為SF-NGC組、陽性對照(甲醛溶液)、陰性對照(生理鹽水)3組,先進(jìn)行預(yù)試驗確定主試驗各階段的濃度,然后進(jìn)行主試驗。在激發(fā)階段的敷貼物去除后24 h、48 h、72 h,觀察記錄各組動物激發(fā)部位的皮膚情況,按標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分,并算出致敏率。結(jié)果絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管的皮膚反應(yīng)記分為0,致敏率為0。結(jié)論在試驗條件下絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管無潛在的皮膚致敏性。

    絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管生物相容性皮膚致敏試驗

    蠶絲,是最早被利用的動物蛋白質(zhì)之一。由于具有良好的力學(xué)性能,其作為生物材料的應(yīng)用也具有悠久歷史,尤其是來自Bombyx mori蠶屬的蠶絲早在100多年前就被編織成手術(shù)縫線[1]。最近,蠶絲的核心蛋白——絲素,在生物醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用正在被不斷開發(fā),尤其是近年來廣泛地應(yīng)用于組織工程學(xué)方面的研究[2-3]。本實驗室成功自制了絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管,并對其生物相容性及其對大鼠坐骨神經(jīng)的修復(fù)功能進(jìn)行了一系列研究[4-5]。本研究以ISO 10993-10:1995標(biāo)準(zhǔn),對本實驗室自制的絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管的潛在致敏作用進(jìn)行評價。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要試劑

    弗氏完全佐劑(Sigma公司);十二烷基硫酸鈉(AR,上海生化試劑有限公司);多聚甲醛(AR,國藥集團(tuán)試劑有限公司);絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管(本實驗室自制)。

    1.1.2 實驗動物

    健康的初成年白化豚鼠,體重為300~500 g,雌雄不限,雌鼠為未產(chǎn)并無孕(南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場)??倲?shù)量為80只,其中14只用于確定皮內(nèi)誘導(dǎo)的濃度,21只用于確定局部誘導(dǎo)和局部激發(fā)的濃度,45只用于主試驗。

    1.1.3 實驗分組

    共3組,分別是SF-NGC(絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管)組、陽性對照組、陰性對照組。規(guī)格為:內(nèi)徑1.8 mm,外徑4 mm。陽性對照為甲醛溶液,陰性對照為生理鹽水。

    1.1.4 材料浸提液的制備

    絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管經(jīng)過121℃高壓滅菌20 min,將材料分別以12 cm2/mL、6 cm2/mL、3 cm2/mL的標(biāo)準(zhǔn)浸入生理鹽水,在培養(yǎng)箱中(37±1)℃條件下靜置(72±0.5)h,制成高、中、低3種劑量的浸提液,并于12 h內(nèi)用于試驗。陽性對照:甲醛配制成濃度為6%、5%、4%(w/v)的水溶液。

    1.2 方法

    1.2.1 確定主試驗皮內(nèi)誘導(dǎo)階段的濃度

    將SF-NGC以12 cm2/mL、6 cm2/mL、3 cm2/mL的標(biāo)準(zhǔn)制浸提液,每種濃度的浸提液在動物去毛的肩胛骨內(nèi)側(cè)成對進(jìn)行皮內(nèi)注射,每點注射0.1 mL。每種濃度用2只豚鼠。6%、5%、4%(w/v)的甲醛水溶液3種濃度同法進(jìn)行試驗。觀察各動物的局部及全身情況。主試驗皮內(nèi)誘導(dǎo)階段所選擇的最高濃度,以不導(dǎo)致皮膚大面積損傷及對動物產(chǎn)生其它有害作用為標(biāo)準(zhǔn)。2只動物皮內(nèi)注射生理鹽水作陰性對照。

    1.2.2 確定主試驗局部誘導(dǎo)階段和局部激發(fā)階段的濃度

    將SF-NGC以12 cm2/mL、6 cm2/mL、3 cm2/mL的標(biāo)準(zhǔn)制浸提液,分別浸透濾紙片后貼敷于動物去毛的腹側(cè)部,用封閉式包扎帶包扎固定。每種濃度用3只豚鼠。24 h后除去包扎帶和濾紙片。6%、5%、4%(w/v)的甲醛水溶液3種濃度同法進(jìn)行試驗。3只動物用生理鹽水同法進(jìn)行試驗作為陰性對照。在可能的情況下,以可導(dǎo)致動物輕度紅斑,但不對動物產(chǎn)生其他有害作用的濃度為主試驗局部誘導(dǎo)階段的濃度。選擇不產(chǎn)生紅斑反應(yīng)的濃度為主試驗局部激發(fā)階段的濃度(表1)。

    表1 各組在主試驗各階段的濃度

    1.2.3 主試驗

    第1天,提取白化豚鼠45只,分成3組,每組15只,開始適應(yīng)環(huán)境。第7天,在胸廓的背前區(qū)備皮4 cm×6 cm。

    第8天,在每只動物去毛的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位成對皮內(nèi)注射0.1 mL。其中靠近頭部的2點注射弗氏完全佐劑與生理鹽水的等體積混合液;中間2點注射預(yù)試驗時表l確定的濃度的浸提液,陰性對照組則注射生理鹽水;靠近尾部的2點注射前2種注射液的等體積混合物。

    局部誘導(dǎo)階段7 d的觀察發(fā)現(xiàn),除陽性對照組外,其余各組均未產(chǎn)生刺激反應(yīng)。遂在局部誘導(dǎo)斑貼前(24±2)h(即第14天),在未產(chǎn)生刺激反應(yīng)的豚鼠的試驗區(qū)用10%十二烷基硫酸鈉石蠟液預(yù)處理,按摩導(dǎo)入皮膚。第15天,各組分別用表1選定的濃度,將20 mm×40 mm濾紙浸透后貼敷于每只動物的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位誘導(dǎo)注射點。封閉式包扎帶包扎固定。(48±2)h后去除包扎帶和濾紙片。對照組動物使用溶劑同法操作。

    第28天,動物的單側(cè)腹部用電動剃刀剃刮毛發(fā)4 cm×6 cm范圍。第29天,用表l選定的激發(fā)階段的濃度,浸透濾紙片,貼敷于每只豚鼠的單側(cè)腹部。封閉式包扎帶包扎固定。(24±2)h后去除包扎帶和濾紙片。

    除去敷貼后24 h、48 h、72 h觀察試驗組和對照組動物激發(fā)部位的皮膚情況。按如下評分標(biāo)準(zhǔn)評價紅斑和水腫反應(yīng)程度:無紅斑:0分;極輕微紅斑:1分;紅斑清晰:2分;中度紅斑:3分;重度紅斑至輕微焦痂形成:4分。無水腫:0分;極輕微水腫:1分;水腫清晰:2分;中度水腫:3分;重度水腫:4分。

    2 實驗結(jié)果

    2.1 動物活體觀察

    各組動物活動正常,飲食正常,敷料包扎固定良好,無移位。

    SF-NGC組:各動物在去除敷料后24 h、48 h、72 h的觀察結(jié)果都是無紅斑、無水腫。

    陽性對照組:各動物在去除敷料后24 h均為中度紅斑至輕度結(jié)痂形成,中度水腫;48 h為中度紅斑至輕度結(jié)痂形成,水腫清晰;72 h為中度紅斑至輕度結(jié)痂形成,極輕微水腫。

    陰性對照組:各動物在去除敷料后24 h、48 h、72 h的觀察結(jié)果都是無紅斑、無水腫。

    2.2 各組皮膚反應(yīng)記分結(jié)果

    按ISO 10993—10:1995的皮膚反應(yīng)分類系統(tǒng)對各組皮膚反應(yīng)記分結(jié)果見表2。結(jié)果顯示陽性對照甲醛溶液的致敏率為100%,皮膚反應(yīng)平均記分為6,表明它具有致敏性。

    SF-NGC組與陰性對照組的皮膚致敏反應(yīng)平均記分均為0,致敏率為0,表明本實驗室自制的絲素蛋白人工神經(jīng)導(dǎo)管在試驗條件下對皮膚無潛在致敏性。

    表2 各組皮膚致敏率和皮膚反應(yīng)記分

    3 討論

    當(dāng)外周神經(jīng)受到長距離損傷時,必須要有合適的橋接物連接兩斷端。從而使近端神經(jīng)沿著正確的方向生長,選擇合適的橋接物成為目前神經(jīng)科學(xué)及材料科學(xué)共同關(guān)注的焦點[6]。過去曾研究以自體或異體的組織作為橋接物,但存在很多困難,如供體缺乏、免疫排斥反應(yīng)等[7]。因此,尋找一種合適的人工組織材料作為橋接物成為目前神經(jīng)再生研究的關(guān)鍵之一。

    絲素蛋白具有良好的生物力學(xué)性能;有一定的可降解性,且降解產(chǎn)物主要為游離氨基酸等[8];與背根神經(jīng)節(jié)[9]及海馬神經(jīng)元[10]都有較好的生物相容性。因而,本實驗室構(gòu)建了絲素蛋白神經(jīng)導(dǎo)管,用于神經(jīng)損傷修復(fù)的研究。

    依據(jù)醫(yī)療器械生物學(xué)評價標(biāo)準(zhǔn),醫(yī)用材料需進(jìn)行生物學(xué)評價,根據(jù)不同的臨床應(yīng)用,選擇不同的生物相容性試驗。皮膚致敏試驗是絲素蛋白神經(jīng)導(dǎo)管必須要進(jìn)行的生物學(xué)評價之一。采用豚鼠測試皮膚致敏的方法有多種,最常用的兩種方法是最大劑量法(Magnusson&Kligman)和封閉斑貼法(Buehler),只需采用其中一種方法即可。最大劑量法為最敏感和首選的方法。本試驗以ISO 10993-10:1995標(biāo)準(zhǔn),采用最大劑量法。評估得出:絲素蛋白神經(jīng)導(dǎo)管在試驗條件下無潛在致敏性。當(dāng)然,動物實驗對于材料的致敏性檢測只是初步的評價,確切的結(jié)論還需結(jié)合人體的臨床應(yīng)用情況。

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    Skin Sensitization Test of Silk Fibroin-based Nerve Guidance Conduit

    YAN Xiaoli,ZHAO Yahong,ZHAO Weijia, YANG Yumin.
    Jiangsu Key Laboratory of neuroregeneration,Nantong University,Nangtong 226001,China.

    ObjectiveTo study the sensitization of silk fibroin-based nerve guidance conduits(SF-NGCs)in vitro. MethodsAccording to ISO 10993-10:1995 standard,maximization test was conducted in guinea pig.The skin sensitization reactions,including erythema and oedema,induced by SF-NGCs,normal saline and formalin solution were observed and scored respectively at 24,48 and 72 h exposure of the infusion of the materials.The allergenic rates and mean response score were calculated.ResultsThe allergenic rates and score of skin reaction of SF-NGC was 0/15 and 0,those of norm al saline 0/15 and 0.The group of normal saline was 0/15 and 0,but the group of formalin solution was 15/15 and 5. ConclusionSF-NGC is safe without skin sensitization.

    Silk Fibroin-based Nerve Guidance Conduit;Biocompatibility;Skin Sensitization Test

    R392-33

    A

    1673-0364(2009)-01-0029-03

    2008年11月30日;

    2009年2月5日)

    10.3969/j.issn.1673-0364.2009.01.008

    國家自然科學(xué)基金(30770585),國家教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持”項目(NCET-07-0466),江蘇省高校自然科學(xué)重大基礎(chǔ)研究項目(07KJA31025)。

    226001江蘇省南通市南通大學(xué)神經(jīng)再生重點實驗室。

    楊宇民。

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