含銀涂層人工關(guān)節(jié)抗感染性能的實驗研究

陳治宇　張　暉　阮正上　黃　強

【摘要】 目的 建立兔股骨假體置換術(shù)后感染模型，探討覆蓋金屬銀/羥基磷灰石層的抗菌人工關(guān)節(jié)的抗感染性能。方法 采用普通的未鍍銀的人工關(guān)節(jié)假體做對照組，以覆蓋銀/羥基磷灰石層的人工關(guān)節(jié)假體為實驗組，術(shù)后觀察動物模型情況。結(jié)果 實驗組術(shù)后感染情況明顯優(yōu)于對照組(P<0．05)。結(jié)論 覆蓋銀/羥基磷灰石層的人工關(guān)節(jié)假體不僅具有良好的生物相容性，還具有抗菌作用。

【關(guān)鍵詞】人工關(guān)節(jié)假體；感染；銀涂層

人工關(guān)節(jié)假體自100多年前應(yīng)用于臨床以來，雖獲得巨大的發(fā)展，但有許多問題尚需解決，如植入人體后產(chǎn)生的感染問題。感染是關(guān)節(jié)置換術(shù)后的一個災(zāi)難性的并發(fā)癥，給患者帶來巨大的經(jīng)濟壓力和精神打擊?？咕鷦┦侵改軌蛴行б种莆⑸锷L繁殖或可殺死病菌的物質(zhì)。銀系抗菌劑是抗菌效率最高的無機廣譜抗菌劑，銀抗菌劑被廣泛用于抵御傷口和燒傷的感染。本課題在關(guān)節(jié)表面覆蓋金屬銀/羥基磷灰石層，此種人工關(guān)節(jié)假體不僅具有良好的生物相容性，還具有抗菌作用^[1]。

1 資料與方法

1．1 材料 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin resistant staphy1ococcus aureus，MRSA)由四川大學(xué)華西醫(yī)院檢驗科細菌培養(yǎng)室提供；兔股骨假體由本課題組自行設(shè)計提供(圖1)；電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)由四川大學(xué)分析檢測中心提供；實驗動物為新西蘭大白兔24只，體質(zhì)量為3．2~4．8 kg，骨骼結(jié)實，被毛光澤，集中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)室溫度20℃，濕度60%。

1．2 動物模型的建立 共分兩組，分別采用普通的未鍍銀的人工關(guān)節(jié)假體做對照組，以覆蓋銀/羥基磷灰石層的人工關(guān)節(jié)假體為實驗組，氯胺酮50 mg／kg肌肉麻醉，以右側(cè)股骨轉(zhuǎn)子為中心、作長4 cm的弧形切口，從右股前與外側(cè)肌間隙進人髖關(guān)節(jié)，切除股骨頭并保留股骨距2 mm。以自制髓腔銼擴髓。兩組分別插入未鍍銀的人工關(guān)節(jié)假體和含銀/羥基磷灰石涂層的人工關(guān)節(jié)假體，保持20°~30°的前傾角，逐層縫合(圖 2)。MRSA使用前于37℃培養(yǎng)1 d，生理鹽水配成菌液，用VITEK比濁儀粗測細菌濃度約1×107 CFU后，2h以內(nèi)使用。共注入MRSA細菌混懸液0．6 ml，1×107 CFU的MRSA(分2次，第1次0．3 ml注入髓腔，第2次0．3 ml在關(guān)閉傷口前，注入關(guān)節(jié)腔)。

1．3 檢測指標 術(shù)后喂養(yǎng)4周，定期觀察體溫，一般情況，并檢測血常規(guī)，以及血清C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)。4周后抽取右側(cè)髖關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)液并處死動物，觀察右側(cè)髖關(guān)節(jié)切口愈合情況，是否有紅、腫、竇道，觀察右髖關(guān)節(jié)的活動度。分別在關(guān)節(jié)囊、髖臼窩及股骨髓腔內(nèi)各取組織1塊，每塊重約0．5 g，行細菌培養(yǎng)，2塊或以上組織培養(yǎng)MRSA陽性則判定為感染；并對關(guān)節(jié)液進行培養(yǎng)，如果培養(yǎng)MRSA陽性則判定為感染^[2-3]。電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)檢測兩組動物血中的銀離子濃度，并觀察是否存在銀沉積病。

1．4 統(tǒng)計學(xué)方法 計量資料采用(x±s)表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用百分比表示，采用卡方檢驗，以P<0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 大體觀察情況的比較 實驗組切口全部愈合，局部無紅腫，無竇道溢膿，多數(shù)站起活動，對照組有5只大白兔切口局部紅腫，且活動量少。實驗組關(guān)節(jié)內(nèi)及假體周圍組織未見明顯感染跡象，對照組有8只大白兔關(guān)節(jié)內(nèi)發(fā)現(xiàn)假體周圍有炎性肉芽組織和黏稠樣膿性分泌物。

2．2 體溫 兩組動物的體溫均波動在38．5℃~39．5℃，但實驗組的體溫明顯低于對照組(P<0．05)。

2．3 細菌培養(yǎng)情況比較 實驗組仍有2只兔的髖關(guān)節(jié)存在感染，感染率為16．66%；對照組有12只兔的髖關(guān)節(jié)存在感染，感染率為100%，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．001)。

2．4 兩組實驗室檢查情況比較 兩組白細胞計數(shù)在2周末差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0．09)，在4周末差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．05)，實驗組CRP值與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0．001)。

2．5 假體的安全性 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)檢測發(fā)現(xiàn)實驗組血中的銀離子濃度(1．69±1．01)ppb，顯著高于對照組血中的銀離子濃度(0．031±0．008)ppb。實驗組未發(fā)現(xiàn)銀沉積病，假體周圍組織切片也沒發(fā)現(xiàn)異物肉芽腫和炎癥反應(yīng)(圖3)。

3 討論

全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后急性感染多數(shù)是金黃色葡萄球菌感染和表皮葡萄球菌。據(jù)美國疾病控制中心報道，35%的金黃色葡萄球菌為甲氧西林耐藥^[4]。耐藥的金黃色葡萄球菌屬于高毒性致病菌，在本實驗中，對照組細菌培養(yǎng)全為陽性，達到了感染模型制備的目的。本研究中實驗組的體溫、CRP、細菌培養(yǎng)感染率等指標都明顯優(yōu)于對照組，表明金屬銀/羥基磷灰石層的抗菌人工關(guān)節(jié)具有優(yōu)良的抗感染功效。

Anagnostakos等統(tǒng)計初次人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染發(fā)病率為1%~2%^[5]，生物被膜(biofilm)是引起人工關(guān)節(jié)假體感染的主要因素之一。生物被膜是細菌為適應(yīng)生存環(huán)境而黏附于生物材料或活性組織表面，并包被在自身產(chǎn)生的黏液性蛋白多糖基質(zhì)中而形成的細菌群落或微克隆，它是一個不斷變化的動態(tài)結(jié)構(gòu)^[6]。當人工關(guān)節(jié)假體植入體內(nèi)后，表面立即被血液成分(蛋白、血漿大分子、紅細胞、血小板)覆蓋，形成所謂的條件膜，細菌通過化學(xué)作用，如范德華力、酸根、靜電、疏水性作用及蛋白結(jié)合等，黏附在條件膜和假體表面。機體免疫力正常時，多數(shù)浮游菌被殺死，少數(shù)殘存細菌黏附到材料表面之后調(diào)整基因表達，在生長繁殖的同時分泌大量胞外黏質(zhì)物(extracellular slime substance，ESS)，將多個細菌粘連到一起形成生物被膜。平時，細菌多以休眠狀態(tài)藏匿于生物被膜中，當有特定觸發(fā)因素時即從休眠或靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橹虏【８腥疽坏┌l(fā)生就會使假體產(chǎn)生松動，喪失正常功能，給患者帶來極大的痛苦，且感染還會反復(fù)發(fā)作，遷延難愈^[7]，而常規(guī)的抗生素療法很難奏效，因而人工關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染的預(yù)防和治療一直是該領(lǐng)域中一項極其重要的課題。繼而有人研究成功在普通聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)骨水泥中添加抗生素而在人工關(guān)節(jié)假體表面形成抗生素骨水泥(antibiotic impregnated bone cement)層來作為解決感染較為常用的方法^[8]。但經(jīng)使用后發(fā)現(xiàn)，抗生素骨水泥長期釋放低濃度抗生素，容易使細菌產(chǎn)生耐藥性，而且隨著添加抗生素的增多，過敏反應(yīng)發(fā)生的概率也很高，且一旦發(fā)生處理困難，必須取出假體，這不僅會給患者帶來極大的痛苦，而且還要帶來過重的經(jīng)濟負擔。

本研究中的抗菌人工關(guān)節(jié)假體表面有金屬銀涂層，因而當其與體液等氧化介質(zhì)接觸后，金屬銀將逐漸被氧化而釋放出銀離子，當微量銀離子到達微生物細胞膜時，因細胞膜帶有負電荷，銀離子首先會依靠庫倫力牢固吸附在細胞膜上，然后進一步穿透細胞壁進入病菌內(nèi)，與病菌生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸中存在的巰基(-SH)、氮基(-NH2)等含硫、氨的官能團發(fā)生反應(yīng)，使病菌的蛋白質(zhì)凝固，破壞病菌的細胞合成酶的活性，使細胞喪失分裂增殖能力而最終消亡，從而達到抗菌并減少或消除人工關(guān)節(jié)假體相關(guān)感染發(fā)生的目的^[9]。金屬銀的氧化速度，或者說釋放銀離子的速度，或者說銀離子的殺菌效力與金屬銀的表面積相關(guān)。因為金屬銀表面積越大，與體液等氧化介質(zhì)接觸面積就越大，越容易氧化，同時與細菌接觸機會也越大，殺菌效率也就越高。本涂層中銀顆粒直徑可以達到10~50 nm，這就明顯增加金屬銀的表面積，從而增加與細菌接觸的機會，因此殺菌效力也就顯著提高^[10]。

在本實驗中，未發(fā)現(xiàn)銀沉積病，血中銀離子濃度也較低。一項覆蓋銀的外固定系統(tǒng)的研究中表明，發(fā)現(xiàn)銀無細胞毒性，也無遺傳性毒性(genotoxic)^[11]。有研究采用人成骨細胞體外檢測含納米銀骨水泥的細胞毒性，結(jié)果顯示在納米銀組和對照組之間無顯著差別，說明納米銀離子在有效濃度內(nèi)無毒性^[12]。Tweden發(fā)現(xiàn)銀離子濃度高達1200 ppb時對成纖維細胞仍無毒性^[13]?，F(xiàn)今應(yīng)用的表面微孔非骨水泥關(guān)節(jié)假體表面也可鍍一層適當厚度的銀，銀顆粒位于微孔孔隙里，從而達到既有利于骨長入又可發(fā)揮銀的抗菌效用。本研究提供一種新型的抗菌人工關(guān)節(jié)假體，其推廣需要進一步的臨床試驗的證據(jù)。

參考文獻

［1］ Kim TN，F(xiàn)eng QL，Kim JO，et al．Antimicrobial effects of metal ions(Ag+，Cu2+，Zr2+)in hydroxyapetite.J Mater Sci Mater Med，1998，9(3)：129-134.

［2］ 王茂源，趙建寧，吳蘇稼，等．萬古霉素磷酸鈣骨水泥在人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后感染二期翻修術(shù)中作用的實驗研究．中國矯形外科雜志，2006，14(6)：443-445.

［3］ Crockarell JR，Hanssen AD，Osmen DR，et al．Treatment of infection with debridement and retention of the components flowing hip arthroplasty．J Bone Joint Surg(Am)，1998，80：1306-1313.

［4］ Carvin KL，Hinrichs SH，Urban JA.Emerging antibiotic resistant bacteria： their treatment in total joint arthroplasty．Clin Orthop，1999，369：110-123.

［5］ Anagnostakos K，Kelm FO．Antibioticqmpregnated PMMA hip spacers：Current status．Acta Orthop，2006，77(4)：628-637.

［6］ Costerton JW,Stewart PS,Greenberg EP.Bacterial biofilms:a common cause of persistent infections.Science,1999，284(5418):1318-1322.

［7］ Nelson CL,Mclaren AC，Mclarten SG，et al.Is aseptic loosening truly aseptic Clin Orthop,2005，437:25-30.

［8］ Espehaug B，Engesaerer LB，Vollset SE，et al．Antibiotic pro ylaxis in total hip arthroplasty．Review of 10，905 primary cemented total hip replacements reported to the Norwegian arthroplasty register，1987 to 1995．J Bone Joint surg(Br)，1997，79(4)：590-595.

［9］ Nicolle LE.Catheterrelated urinary tract infection.Drugs Aging，2005,22(8):627-639.

［10］ Baker C，Pradhan A，Pakstis L,et al.Synthesis and antibacterial properties of silver nanoparticles.J Nanosci Nanotechnol，2005,5(2):244-245.

［11］ Bosetti M，Massè A，Tobin E,et al.Silver coated materials for external fixation devices:in vitro biocompatibility and genotoxicity.Biomaterials，2002，23(3):887-892.

［12］ Vizuete ML，venero JL．An in vitro assessment of the antibacterial properties and cytotoxicitv of nanoparticulate silver bone cement．Biomaterials，2004，25(18)：4383-4391.

［13］ Tweden JD，Cameron AJ，Razzouk WR，et al.Biocompatibility of silver-modified polyester for antimicrobial protection of prosthetic valves.J Heart Valve Dis，1997(5)： 553-561.