基于代謝組學(xué)方法的小兒肺炎易感性研究

摘 要 以6個月到6歲肺炎患兒尿液為樣本，采用基于氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GCMS）的代謝組學(xué)方法，研究肺炎患兒尿液內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的變化及其易感性的發(fā)病機制。收集不同感染次數(shù)的肺炎患兒尿液樣本，包括正常兒童組29例、 單次感染肺炎患兒組35 例、 多次感染肺炎患兒組31例，分析獲得肺炎患兒尿液代謝輪廓； 同時對所得數(shù)據(jù)進行主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判別分析（PLSDA）等多元統(tǒng)計分析，綜合單因素方差分析及倍數(shù)（Fold change，F(xiàn)C）變化分析結(jié)果，最終篩選并通過FiehnLib等數(shù)據(jù)庫鑒定絲氨酸、 組氨酸、 脯氨酸、 正亮氨酸、 谷氨酰胺、 硬脂酸、 纈氨酸和異亮氨酸、 乳糖醛酸等在正常兒童組與肺炎患兒組之間有代謝差異（p value adjusted by FDR<0.05）且FC>5，吲哚3乙酸、 肌酸、 乙醇胺、 甘露糖基甘油酸和果糖在不同感染次數(shù)肺炎組之間具有差異性（p value adjusted by FDR<0.05）。實驗結(jié)果表明，肺炎患兒易感性體質(zhì)存在差異性代謝物，這些代謝物主要通過氨基酸及糖代謝對肺炎易感性產(chǎn)生影響。

關(guān)鍵詞 小兒肺炎； 易感性； 代謝組學(xué)； 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

1 引 言

肺炎是兒科常見病。世界衛(wèi)生組織（WHO）將小兒肺炎列為全球3種重要兒科疾病之一，肺炎死亡數(shù)占全世界各種原因死亡總數(shù)的5%[1]，每年全球大約有100萬5歲以下的兒童死于小兒肺炎，是發(fā)展中國家5 歲以下小兒死亡的主要原因[2]，故加強對肺炎的防治十分重要。

隨著系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)思維模式的建立，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的研究正由微觀、 實體的探索向宏觀、 系統(tǒng)的角度轉(zhuǎn)變，現(xiàn)代研究融入當前系統(tǒng)生物學(xué)將是必然的趨勢。代謝組學(xué)做為系統(tǒng)生物學(xué)的代表之一，運用高通量技術(shù)，如氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GCMS）、 液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LCMS）等，研究生命體代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，揭示機體代謝的本質(zhì)[3，4]。近年來，尿液代謝組學(xué)的臨床及實驗研究越來越多，部分研究基于液相色譜質(zhì)譜技術(shù)探討疾病的尿液代謝特征譜，涉及嘧啶代謝、 氨基酸代謝、 嘌呤代謝等[5～9]，且尿液為非創(chuàng)傷性診療措施，尿樣本采集難度較低，適用于成人及小兒臨床疾病特征譜的探索。

近年來，已有對小兒肺炎分子水平上的代謝組學(xué)研究報道[10，11]。Lu等[12]研究發(fā)現(xiàn)H1N1流感病毒感染肺炎患者血清內(nèi)多種代謝途徑發(fā)生改變，以花生四烯酸代謝通路中的內(nèi)源性物質(zhì)改變最顯著，也可能與一些內(nèi)源性氧化還原物質(zhì)如谷胱甘肽的代謝紊亂有關(guān)[13，14]。本研究采用GCMS技術(shù)，研究小兒肺炎的代謝特征，以小兒肺炎晨尿樣本為例，從尿液代謝角度出發(fā)，探討了小兒肺炎易感性的物質(zhì)基礎(chǔ)，研究并揭示基于代謝組學(xué)的小兒肺炎易感性體質(zhì)的可能的生物學(xué)機制。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

配備AS 1310 自動進樣器的Trace 1310 氣相色譜和TSQ 8000 質(zhì)譜儀、 TG5MS 氣相色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、 Speed Vac 離心濃縮儀（Thermo公司）； Allegra 64R centrifuge 離心機（美國Beckman Coulter公司）； CPA225D電子天平（德國Sartorius公司）。

1，213C肉蔻酸（1g）、 BSTFA （含1% TMCS，10 mL）、 C8～C40 烷烴系列標準品（1 mL）、 吡啶（100 mL）和甲氧胺鹽（50 mg）均購于Sigma 公司。11種標準品包括組氨酸、 絲氨酸、 脯氨酸、 硬脂酸、 纈氨酸、 異亮氨酸、 賴氨酸、 蘇氨酸、 谷氨酸、 次黃嘌呤、 肌酸（50～100 mg， Sigma 公司）。

2.2 樣品采集與制備

2.2.1 肺炎診斷標準 參照《諸福棠實用兒科學(xué)》第8版制訂肺炎診斷標準[2]，選擇病例。（1）納入標準 符合上述肺炎診斷標準的6月～6歲住院患兒及正常兒童。（2）排除標準 有明確先天/后天遺傳代謝障礙疾病者。入選時有心力衰竭、 呼吸衰竭、 中毒性腦病、 滲出性胸膜炎等嚴重合并癥者。合并有心腦血管、 肝腎和造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病及精神病患者。

2.2.2 樣品采集 本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院（江蘇省中醫(yī)院）倫理委員會批準，納入病例均獲得患兒家屬知情同意。選取2014年1～4月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院住院部確診為肺炎的6月～6歲患兒及兒童保健科采集6月～6歲正常兒童的晨尿。 共納入正常兒童（NC）組29例，單次感染肺炎（FIP）組35例，多次感染肺炎（RIP）組31例，臨床資料見表1。3組間兒童年齡、 性別、 身高、 體重?zé)o統(tǒng)計學(xué)差異（p>0.05），而肺炎組的血常規(guī)（白細胞計數(shù)、 中性粒細胞、 淋巴細胞）、 用藥情況與正常組存在差異，有統(tǒng)計意義（p<0.05）。由表1可知，學(xué)齡前期正常兒童的血常規(guī)中淋巴細胞比重較高。肺炎組兒童血常規(guī)中性粒細胞比重較正常兒童組高，淋巴細胞比重較正常兒童組低，說明本項研究納入肺炎患兒以細菌感染占主導(dǎo)地位，符合肺炎的發(fā)病規(guī)律[2]。留取晨起空腹第一次尿液的中段尿液約2 mL，于 80℃保存，避免反復(fù)凍融。

2.2.3 樣品制備 （1）尿樣處理 將尿液樣本置于4℃（或冰上）融化，14000 r/min離心10 min，取上清180 μL，加入含30U尿素酶溶液20 μL， 37℃孵育30 min，然后加入800 μL甲醇（冰浴，甲醇內(nèi)含1 mg/mL的內(nèi)標1，213C肉蔻酸），渦旋10 min， 4℃ 12000 r/min離心10 min，吸取200 μL上清液，置于離心濃縮儀中揮干2 h。（2）樣品衍生化 向尿液樣本中均加入15 mg/mL甲氧胺吡啶溶液30 μL，渦旋 1 min 后振蕩 1.5 h，混勻5 min，加入30 μL BSTFA（含1% TMCS）溶液后，渦旋1 min，后振蕩0.5 h （37℃，600 r/min）。靜置，吸取上清液60 μL于玻璃內(nèi)插管中，供GCMS進樣分析[15]。endprint

2.3 色譜質(zhì)譜儀條件

載氣為氦氣，流速為1.2 mL/min，采用分流模式，進樣口溫度250℃，分流比為20∶1，升溫程序： 起始溫度60℃，保持1 min 后，以20℃/min 升至320℃后，保持5 min； 進樣量為1 μL。采用EI 源； 離子源溫度為280℃，離子傳輸線溫度為250℃，電離能為70 eV，采集范圍為m/z 50～500，采集時間3.5～19.0 min[16]。

2.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)方法

采集各樣品的圖譜信息，使用MSDIAL及FiehnLib數(shù)據(jù)庫[17，18]對得到的原始資料進行預(yù)處理，通過峰提取、 物質(zhì)鑒定、 峰對齊，得到三維矩陣數(shù)據(jù)集，坐標分別為：化合物名稱、 保留時間、 保留指數(shù)及根據(jù)峰高提取的峰面積（Peak height）。對矩陣數(shù)據(jù)集進行總離子流校準（mTIC normalization）及Pareto 校準后（Pareto scalling），采用Metaboanalyst 3.0[19]進行主成分分析（PCA）及偏最小二乘法判別（PLSDA）等多元統(tǒng)計分析。接著對數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉(zhuǎn)換（log2x transformation）后，基本滿足正態(tài)分布及方差齊性后，進行單因素方差分析。根據(jù)FC及單因素方差分析所得的p值及False discovery rate （FDR）值篩選差異性代謝物，當FC >1.5及p<0.05時，提示該代謝物具有統(tǒng)計學(xué)意義。使用NIST 2014 數(shù)據(jù)庫和已有標準品對其進行驗證，并經(jīng)Metaboanalyst3.0分析相關(guān)代謝通路。

3 結(jié)果與討論

3.1 GCMS分析結(jié)果

正常兒童組，單次感染肺炎組及多次感染肺炎組的GCMS分析總離子流圖（TIC）見圖1。使用MSDIAL及FiehnLib數(shù)據(jù)庫[17，18]，將保留指數(shù)與保留時間進行線性匹對，共篩選出159種化合物，包括絲氨酸等氨基酸、 半乳糖等糖類、 琥珀酸等小分子代謝物。以內(nèi)標（1，213 C肉蔻酸）及C8～C40烷烴作為質(zhì)控標準，保留指數(shù)及峰面積RSD均控制在30%以內(nèi)。

3.2 肺炎代謝輪廓分析及差異性代謝物鑒定

采用MSDIAL處理尿液中篩選的色譜峰，再進行PCA及PLSDA分析， 由PLSDA得分圖（圖2）可見，正常兒童組與肺炎患兒組區(qū)別性比較好，肺炎組之間能夠良好區(qū)分，提示正常兒童組及不同感染次數(shù)的肺炎患兒組尿液的確存在代謝差異，通過FC>1.5及單因素方差分析（p<0.05）篩選，共找出對得分圖區(qū)分做出主要貢獻的差異性代謝物共62種，并用標準品對組氨酸、 絲氨酸、 脯氨酸、 硬脂酸、 纈氨酸、 異亮氨酸、 賴氨酸、 蘇氨酸、 谷氨酸、 次黃嘌呤、 肌酸共11種物質(zhì)進行了確認（圖3）。同時通過Cytoscape得到網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖（見電子版文后支持信息圖S1）。

3.3 代謝通路分析

使用MetaboAnalyst3.0進行代謝通路分析。根據(jù)通路影響值及p值得到：（1）丙氨酸、 天冬氨酸和谷氨酸代謝，（2）甘氨酸、 絲氨酸和蘇氨酸代謝，（3）色氨酸代謝，（4）氨基酰tRNA生物合成，（5） 精氨酸和脯氨酸代謝，（6） 半胱氨酸和甲硫氨酸代謝，（7） 淀粉和蔗糖代謝，（8） 嘌呤代謝，（9） 纈氨酸、 亮氨酸和異亮氨酸生物合成，共9條相關(guān)代謝通路（富集分析p value<0.05， Impactor factor>0.02）。上述通路與差異性代謝物之間的關(guān)系見圖4。

氨基酸類差異性代謝物（組氨酸、 絲氨酸、 脯氨酸、 亮氨酸、 異亮氨酸、 硬脂酸、 天冬酰胺，賴氨酸、 蘇氨酸、 色氨酸、 酪氨酸和纈氨酸等）在肺炎患兒組相對含量上升，糖類差異性代謝物（半乳糖醛酸、 L二硫蘇糖醇、 纖維二糖）在肺炎患兒組相對含量下降。不同感染次數(shù)肺炎患兒組與正常兒童組之間尿液差異性代謝物的相對含量變化（見電子版文后支持信息圖S2）。

對比肺炎患兒組與正常兒童組可知，肺炎過程中機體能量供應(yīng)受損，需要氨基酸代謝和糖代謝參與修復(fù)。氨基酸類代謝物主要參與蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運，肺炎過程中蛋白質(zhì)不斷分解為氨基酸，氨基酸的氧化代謝及糖類物質(zhì)的消耗，進而提供能量[20～23]，參與機體修復(fù)。組氨酸及其代謝產(chǎn)物組胺是肺炎、 哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病的主要致炎因子[24]，組氨酸在肺炎組的相對含量上升，代表肺炎正處于炎癥急性期，組氨酸不斷累積并及時參與到炎癥反應(yīng)中。組氨酸還可以不斷轉(zhuǎn)化成谷氨酸及谷氨酰胺，同時谷氨酰胺不斷代謝為次黃嘌呤，黃嘌呤、 黃嘌呤核苷、 組氨酸及其代謝物的累積代表體內(nèi)能量及代謝失衡。絲氨酸是色氨酸的前體，絲氨酸可以不斷轉(zhuǎn)化成色氨酸，甲硫氨酸等。在代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控中，色氨酸有兩條主要代謝途徑：犬尿氨酸代謝和5羥色胺代謝。色氨酸犬尿氨酸通路在多種疾病中發(fā)揮作用[25，26]。色氨酸代謝主要發(fā)生于炎癥組織，肺炎急性期時，色氨酸和產(chǎn)物犬尿氨酸不斷在尿液中代謝累積[27]。多次感染肺炎患兒組與單次感染肺炎患兒組對比，存在以下5種差異性物質(zhì)：肌酸、 乙醇胺、 吲哚3乙酸、 β甘露糖基甘油酯等物質(zhì)相對含量上升，這些物質(zhì)均為氨基酸代謝產(chǎn)物，伴隨糖酵解（半乳糖醛酸、 L二硫蘇糖醇、 纖維二糖、 果糖），此類代謝底物在尿液中含量累積及代謝，可以作為肺炎急性期感染期及易感性的標記物。

4 結(jié) 論

采用GCMS與PLSDA方法分析不同感染次數(shù)肺炎患兒與正常兒童之間的尿液差異性代謝產(chǎn)物的變化，氨基酸類差異性代謝物，如組氨酸、 絲氨酸、 脯氨酸、 正亮氨酸、 硬脂酸等物質(zhì)在肺炎組明顯上升； 糖類差異性代謝物，如半乳糖醛酸、 L二硫蘇糖醇、 纖維二糖含量在肺炎組明顯下降。經(jīng)Metaboanalyst分析得到共9條相關(guān)代謝通路。表明兒童肺炎主要影響氨基酸及糖代謝，推測肺炎引起了兒童機體的氨基酸代謝及糖代謝紊亂。本研究的樣本來源尿液為無創(chuàng)性診療手段，易于獲取及采集，利用尿液代謝組學(xué)的方法評估及區(qū)分正常兒童與肺炎患兒及不同感染次數(shù)的肺炎患兒的代謝差異，可為臨床肺炎急性發(fā)作期及肺炎易感性提供依據(jù)。endprint

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Abstract The changes of endogenous metabolites in urine samples that come from pneumonia patients of 6 months to 6 years old children were analyzed by metabolomics methods based on gas chromatography and mass spectrometry （GCMS）. The aim of this study was to analyze and study the pathogenesis of endogenous metabolites in children with pneumonia and the pathogenesis of pneumonia susceptibility. The urine samples were collected and divided into normal children group （NC group， n=29）， first infection with pneumonia group （FIP group， n=35）， and repeated infection with pneumonia group （RIP group， n=31）. The urine metabolic profile of pneumonia was obtained by GCMS. Principal component analysis （PCA） and partial least squaresdiscriminant analysis （PLSDA） were used to analyze the data. The results were analyzed by oneway analysis of variance and Fold change. Finally， there was significant difference between the normal group and the pneumonia group， the significant metabolites were serine， histidine， proline， norleucine， glutamine， stearic acid， valine， isoleucine with p value<0.05 and Fold change>5， and indole3acetic acid， creatine， ethanolamine， mannosylglycerol and fructose were significant between the two pneumonia groups with p value<0.05. The urinary metabolites demonstrated that amino acid metabolism and glucose metabolism were the main metabolic pathways and responsible for the susceptibility to pneumonia.

Keywords Pneumonia inchildren； Susceptibility； Metabolomics； Gas chromatographymass spectrometry

（Received 12 September 2017； accepted 22 December 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.81373688）， the Postgraduate Research and Innovation Project of Colleges and Universities of Jiangsu Province （No.SJLX_0432）， Jiangsu Provincial 333 Highlevel Talents Cultivation Project （No.BRA2016427）， and Jiangsu Provincial Six Talent Peaks Project （No.YY022）.endprint