核磁共振代謝組學(xué)方法研究雷公藤紅素對大鼠糖尿病潰瘍促愈合作用機(jī)制

胡永勝

摘 要 采用腹腔注射鏈脲佐菌素結(jié)合打孔器皮膚燙傷構(gòu)建SD大鼠糖尿病潰瘍模型，隨機(jī)分為正常創(chuàng)面生理鹽水處理組、 糖尿病潰瘍模型生理鹽水處理組、 糖尿病潰瘍模型雷公藤紅素處理組，潰瘍創(chuàng)面持續(xù)給藥處理14 d，利用基于核磁共振的代謝組學(xué)方法研究雷公藤紅素處理后大鼠糖尿病潰瘍組織代謝特征，并結(jié)合形態(tài)觀察計算潰瘍愈合率及組織病理學(xué)檢測（HE染色、 Masson染色）技術(shù)研究大鼠糖尿病潰瘍的愈合情況，揭示雷公藤紅素對大鼠糖尿病潰瘍的治療作用及其機(jī)制。研究結(jié)果表明，雷公藤紅素可誘導(dǎo)大鼠潰瘍創(chuàng)面上皮再生化，調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞浸潤和膠原纖維分布，促進(jìn)潰瘍創(chuàng)面愈合。經(jīng)偏最小二乘法分析，篩選并鑒定出20種潛在內(nèi)源性差異代謝物。代謝通路分析表明，雷公藤紅素能夠顯著提高潰瘍組織三羧酸循環(huán)水平，促進(jìn)其能量供應(yīng)，加快蛋白合成，改善線粒體功能和氧化應(yīng)激水平，加速皮膚組織的自我修復(fù)能力，促進(jìn)糖尿病潰瘍的愈合。本研究為雷公藤紅素作為治療糖尿病潰瘍新藥研究提供了參考。

關(guān)鍵詞 雷公藤紅素； 糖尿病潰瘍； 核磁共振波譜； 代謝組學(xué)

1 引 言

糖尿病潰瘍是糖尿病常見的慢性并發(fā)癥之一，潰瘍創(chuàng)面愈合延遲或不愈合、 愈合后創(chuàng)面反復(fù)發(fā)作，極易導(dǎo)致糖尿病患者致殘和早亡[1]。糖尿病潰瘍創(chuàng)面常伴隨著炎癥修復(fù)，然而過度炎癥會影響創(chuàng)面肉芽形成，導(dǎo)致組織脆弱和上皮形成遲滯，最終加重潰瘍創(chuàng)面難愈合和導(dǎo)致并發(fā)感染[2]，如何調(diào)控創(chuàng)面炎癥修復(fù)已成為臨床治療糖尿病潰瘍亟需解決的難點(diǎn)和重點(diǎn)問題[3，4]。

中藥雷公藤中提取的活性成分雷公藤紅素（Celastrol，Cel）具有抗腫瘤、 抑制免疫反應(yīng)和抗炎癥作用、 抑制血管生成等多種藥理作用[5～7]，特別是優(yōu)良的抗炎及調(diào)控成纖維細(xì)胞增生及膠原蛋白合成的藥理作用[8，9]，在促進(jìn)創(chuàng)面愈合方面顯示了其潛在應(yīng)用價值。然而雷公藤紅素在治療糖尿病潰瘍方面的應(yīng)用尚未見相關(guān)研究報道。

代謝組學(xué)重點(diǎn)關(guān)注生物體系受疾病侵襲、 藥物干預(yù)、 環(huán)境變化等外界刺激下所產(chǎn)生的代謝應(yīng)答變化規(guī)律，廣泛應(yīng)用于疾病診斷、 藥物毒性評價、 作用機(jī)制和基因功能研究[10，11]。 與色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相比，核磁共振（NMR）技術(shù)具有非侵襲性、 非樣品破壞性、 高分辨率和結(jié)果穩(wěn)定、 重現(xiàn)性好的特點(diǎn)，在生物樣本的微量檢測和無損檢測以及組織樣本的原位檢測方面是不可替代的分析手段[11，12]。鑒于此，本研究通過基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)和組織病理學(xué)檢測技術(shù)，系統(tǒng)考察了雷公藤紅素對糖尿病潰瘍的治療作用，并初步探討其可能的作用機(jī)理，以期為雷公藤作為治療糖尿病潰瘍的新藥研究提供實(shí)驗依據(jù)。

2 實(shí)驗部分

2.1 儀器與試劑

羅氏血糖儀（德國羅氏公司）； AL104電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）； MilliQ 超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）； Bruker AVANCE III 600 核磁共振譜儀（美國Bruker公司）； 5415R低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）； BX51 系統(tǒng)顯微鏡（Olympus公司）； SCIENTZ49高通量組織研磨器（寧波生物科技股份有限公司）。

雷公藤紅素（批號CE150811，成都健騰生物技術(shù)有限公司）； 鏈脲佐菌素（Streptozocin， STZ，SigmaAldrich公司）； 檸檬酸、 檸檬酸鈉、 水合氯醛（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； D2O （99.9%氘代，劍橋同位素實(shí)驗室）； HE染色試劑盒、 Masson染色試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）。SD 雄性大鼠（體重180～220 g，上海斯萊克實(shí)驗動物有限責(zé)任公司），實(shí)驗動物許可證編號為 SCXK 20070005。

2.2 動物實(shí)驗

2.2.1 糖尿病大鼠潰瘍模型的制備 本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。SD雄性大鼠飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心，單籠飼養(yǎng)，室溫（22±3）℃，相對濕度50%±10%，12 h 交替照明，自由飲水、 進(jìn)食。適應(yīng)喂養(yǎng)7 d，隨機(jī)抽取8只SD大鼠作為正常組，其余16只作為糖尿病造模組。過夜禁食13 h后，造模組注射新鮮配制的STZ 檸檬酸鈉混懸溶液（60 mg/kg， i.p.），正常組給予同體積的檸檬酸鈉混懸溶液（0.10 mol/L， pH 4.5），3 d后尾靜脈采血測血糖，當(dāng)血糖值大于16.7 mmol/L 且伴隨出現(xiàn)“三多一少”癥狀者即為糖尿病造模成功[13]。再經(jīng)過1周觀測大鼠飲水飲食狀況并記錄血糖值后，進(jìn)行糖尿病潰瘍模型制作。

選取上述16只糖尿病大鼠，根據(jù)文獻(xiàn)[14＼]報道的方法構(gòu)建大鼠潰瘍模型。即首先用10%水合氯醛腹腔麻醉后，背部剃毛，常規(guī)消毒，將打孔器（直徑2 cm）置于沸水中煮5 min 后，用打孔器于大鼠背部脊柱兩側(cè)各停留30 s，造成二度燙傷，燙傷3 d后取下燙傷的皮膚，發(fā)現(xiàn)潰瘍創(chuàng)面開始有肉芽組織生長，表明糖尿病潰瘍模型制備成功。血糖水平正常的8只大鼠按上述方法制作正常創(chuàng)面組。

2.2.2 實(shí)驗分組及給藥實(shí)驗 實(shí)驗共分3組，每組8只大鼠：正常創(chuàng)面組（Con）、 糖尿病潰瘍模型生理鹽水處理組（DM）、 糖尿病潰瘍模型雷公藤紅素處理組（Cel），后兩組為糖尿病潰瘍造模成功的16只大鼠隨機(jī)分組。單籠喂養(yǎng)， 每天固定時間給藥1次，給藥前用生理鹽水清洗創(chuàng)面，其中Cel組噴灑雷公藤紅素生理鹽水溶液，給藥劑量為500 μg/次，另外兩組噴灑生理鹽水，給藥后無菌紗布覆蓋創(chuàng)面。

2.3 皮膚愈合指標(biāo)的測定

于創(chuàng)面給藥處理后第4、 7、 9、 11和14 天分別對兩組大鼠潰瘍面照相，應(yīng)用ImageTool 3.0 軟件計算潰瘍面積和愈合率。

2.4 大鼠皮膚潰瘍面HE及Masson染色

大鼠創(chuàng)面給藥處理后第14 d，分別取各處理組大鼠的潰瘍皮膚組織，4%多聚甲醛固定24 h，不同濃度乙醇水溶液中進(jìn)行脫水，二甲苯透明后常規(guī)石蠟包埋縱向連續(xù)切片（5 μm），進(jìn)行HE及Masson染色，顯微鏡下檢查創(chuàng)面組織的病理形態(tài)、 肉芽組織增生情況及上皮組織的形成。endprint

2.5 潰瘍皮膚組織的1H NMR 檢測

大鼠創(chuàng)面給藥處理后第14 d，分別取各處理組大鼠的潰瘍組織，用分析天平稱重并剪碎，所有組織的重量均值和標(biāo)準(zhǔn)差為（57.4 ± 15.7） mg，加入冰甲醇4 mL/g和蒸餾水0.85 mL/g 并采用SCIENTZ48高通量組織研磨器在低溫環(huán)境下勻漿，渦旋混合樣品15 s后，加入氯仿（2 mL/g）， 渦旋。最后加入冷的氯仿2 mL/g與蒸餾水溶液2 mL/g，混勻后于冰上靜置15 min，1000 g離心15 min。待分層后取上層水溶液，凍干， 80℃保存，備用。

凍干粉用600 μL重水溶液充分溶解，1000 g離心10 min，取500 μL上清液轉(zhuǎn)移至核磁管中。所有的1H NMR 實(shí)驗均在Bruker AVANCE III 600M NMR 譜儀上進(jìn)行，1H的共振頻率為600.13 MHz。一維1H NMR 譜用90°的單脈沖序列， 預(yù)飽和方式壓水峰，溫度設(shè)定為298.0 K，譜寬12000 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)32000，累加次數(shù)為128 次。傅立葉變換之前，采集的FID 信號充零至64000，窗函數(shù)LB=0.3。所有的譜峰用Topspin 2.1軟件進(jìn)行相位校正和基線調(diào)整， 用乳酸的甲基峰（CH3， δ 1.33）進(jìn)行定標(biāo)。

2.6 NMR數(shù)據(jù)預(yù)處理和模式識別及統(tǒng)計學(xué)分析

為了發(fā)掘NMR 譜中包含的所有代謝物信息，以δ 0.004 為區(qū)間將1H NMR譜圖（δ 9.996～0.496）劃分為等寬的區(qū)域， 并對各個區(qū)域進(jìn)行自動積分， 為了消除水峰，將δ 5.096～4.620 區(qū)域設(shè)為0，為了消除血糖的異常升高導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏差，葡萄糖的譜峰信號也設(shè)為0 積分段。為了消除樣本間的濃度差異，同時對每一譜峰進(jìn)行歸一化，最后將數(shù)據(jù)輸入SIMCAP12.0 軟件包（Umetrics， Ume， Sweden）進(jìn)行偏最小二乘判別分析（PLSDA）。PLSDA 以第一和第二主成分（PC1 和PC2）作為x， y坐標(biāo)軸構(gòu)建二維空間（得分圖， Scores plot），該空間中每一個點(diǎn)代表一例樣本，圖中橢圓內(nèi)區(qū)域代表的是95%的置信區(qū)間。由PLSDA 得到的載荷圖（Loading plot）上每一數(shù)值代表NMR 譜的一個積分區(qū)間，即對應(yīng)某代謝物，此數(shù)值絕對值越大，對分組的貢獻(xiàn)就越大。PLSDA分析的準(zhǔn)確性和預(yù)測下用R2Y 和Q2的值表示。R2Y 表示PLSDA模型建模過程中所能解釋的變量數(shù)據(jù)的比例； Q2表示模型所能預(yù)測的變量數(shù)據(jù)的比例，它們的大小直接反映了該模型的可靠程度（最大值為1）。

應(yīng)用SPSS13.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，結(jié)果以mean±SD表示，3組之間的比較采用方差分析檢驗，兩組間比較采用獨(dú)立樣品t 檢驗，p<0.05 認(rèn)為具有統(tǒng)計顯著性差異。

3 結(jié)果與討論

3.1 潰瘍愈合情況及愈合率比較

在給藥處理后的第4、 7、 9、 11和14 天對各實(shí)驗組大鼠創(chuàng)面拍照分析表明，正常創(chuàng)面生理鹽水處理組大鼠創(chuàng)面愈合明顯快于另外兩組，反映了高血糖水平具有延緩創(chuàng)面愈合作用； 糖尿病潰瘍模型雷公藤紅素處理組大鼠創(chuàng)面愈合明顯快于糖尿病潰瘍模型生理鹽水處理組，雷公藤紅素表現(xiàn)出對抗高血糖水平對創(chuàng)面愈合的延緩作用，可誘導(dǎo)上皮的再生化，加速糖尿病潰瘍的創(chuàng)面愈合（見圖1、 表1）。

3.2 HE和Masson染色結(jié)果

大鼠創(chuàng)面組織的HE和Masson染色結(jié)果表明，Con組、 DM組、 Cel組創(chuàng)面愈合情況有明顯差異（圖2）。HE染色圖（圖2A）顯示，DM組相對于Con組和Cel組有更多、 更密集的炎性細(xì)胞，說明DM組的潰瘍恢復(fù)能力較其它兩組差。Cel組與DM組相比，表現(xiàn)為皮膚真皮層細(xì)胞數(shù)量少，且結(jié)節(jié)、 圓形和旋轉(zhuǎn)的區(qū)域少，說明Cel組的潰瘍恢復(fù)效果明顯優(yōu)于DM組（圖2A）。在Masson染色結(jié)果中，除了能進(jìn)一步清楚地看出各組細(xì)胞的數(shù)目和排列情況的差異，同時也發(fā)現(xiàn)DM組真皮層的膠原纖維更為濃密且分布不規(guī)整，這也說明其恢復(fù)程度不及Cel組（圖2B）。

3.3 糖尿病潰瘍組織的代謝輪廓分析

代謝組學(xué)以其多途徑整體觀的研究模式，在闡述藥物的藥理作用機(jī)制方面有著獨(dú)特優(yōu)勢[15]。圖3 顯示了本研究中3組大鼠潰瘍組織提取液的典型1D 1H NMR譜。圖3中Con組列出了潰瘍組織中能被1H NMR檢測到的代謝物，相對于Con組，DM組和Cel組大鼠潰瘍組織中的多種代謝物在給藥處理14 d后都有明顯的變化。為了深入挖掘NMR譜中包含的代謝信息，采用多變量模式識別方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，PLSDA結(jié)果的散點(diǎn)圖和載荷圖見圖4。3個實(shí)驗組在散點(diǎn)圖上明顯分開，說明各組的代謝模式有較大差異，表明糖尿病影響創(chuàng)面愈合的代謝模式，雷公藤紅素處理后在一定程度上逆轉(zhuǎn)糖尿病對創(chuàng)面愈合代謝模式的改變。針對主成分得到的3組PLSDA模型的參數(shù)值列于表2， 3組建模的R2Y都很高，表明PLSDA模型可信。根據(jù)PLSDA模式識別分析，共篩選得到20種內(nèi)源性代謝物的含量變化。

如表3所示，相對于Con組，DM組中的尿嘧啶、 S腺苷高半胱氨酸、 肌酸、 尿囊素、 谷氨酰胺、 谷氨酸、 酪氨酸、 甲酸、 丙氨酸、 三磷酸鳥苷、 胞苷、 肌苷的含量降低； 而尿刊酸酯、 α葡萄糖、 β葡萄糖、 醋酸、 磷酸膽堿、 ?；撬?、 肌醇、 丙酮酸的含量上升。與DM組相比，Cel組與DM組代謝物呈現(xiàn)了相似的代謝變化，如尿嘧啶、 S腺苷高半胱氨酸、 肌酸、 尿囊素、 谷氨酰胺、 谷氨酸、 酪氨酸、 甲酸、 丙氨酸、 三磷酸鳥苷、 胞苷、 肌苷的含量降低； α葡萄糖、 β葡萄糖、 磷酸膽堿、 ?；撬?、 肌醇的含量上升，這些代謝特征反映了高血糖水平對潰瘍創(chuàng)面愈合的影響。然而更重要的是，這種代謝趨勢得到了減緩甚至逆轉(zhuǎn)，有趨向于Con組的代謝特征，在一定程度上反映了雷公藤紅素對糖尿病潰瘍的治療作用。endprint

3.4 特征代謝物相關(guān)代謝通路及糖尿病潰瘍的病理分子機(jī)制

基于1H NMR的代謝組學(xué)技術(shù)得到的代謝模式和代謝物變化，有助于了解雷公藤紅素促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制。愈合率（Healing rate， HR）按下式計算：

HR（%）=[（OA-NHA）/OA＼]×100（1）

式中，OA為原始面積，NHA為未愈合面積。結(jié)果如表3和圖5所示，與Con組相比，DM組和Cel組中葡萄糖都處于較高的水平， 提示雷公藤紅素并不是通過降低血糖發(fā)揮減輕糖尿病潰瘍的作用。糖尿病潰瘍發(fā)生時，創(chuàng)面啟動自我修復(fù)過程，此過程中涉及到氨基酸代謝、 蛋白質(zhì)以及核酸物質(zhì)的合成，需要保證充足的能量供應(yīng)和物質(zhì)代謝[16]。糖尿病大鼠高血糖引起的線粒體功能的改變、 能量代謝的失衡，呈現(xiàn)出能量供應(yīng)效率降低； 此外， 參與體能氨基酸代謝、 蛋白質(zhì)合成、 核酸代謝的相關(guān)代謝物水平下調(diào)，物質(zhì)代謝儲備不足，創(chuàng)面的自我修復(fù)過程受到影響。經(jīng)雷公藤紅素處理后，參與氨基酸代謝的S腺苷高半胱氨酸、 谷氨酸、 谷氨酰胺呈現(xiàn)了明顯的回調(diào)趨勢，提高了氨基酸代謝水平，保證了潰瘍創(chuàng)面修復(fù)過程中蛋白合成需要。此外，參與核酸代謝的三磷酸鳥苷、 胞苷、 肌苷代謝水平也呈現(xiàn)了明顯的回調(diào)，保證了創(chuàng)面自我修復(fù)過程中的核酸代謝需要。

丙酮酸含量的變化也值得注意，在DM組中，由于高血糖造成機(jī)體線粒體功能的改變，丙酮酸進(jìn)入線粒體中進(jìn)行有氧呼吸減少，造成了丙酮酸相對堆積[17]。經(jīng)雷公藤紅素處理后，丙酮酸含量恢復(fù)，提示雷公藤紅素在一定程度上了改善了機(jī)體的線粒體功能，提高了能量供應(yīng)的效率和能力[18]，改善了創(chuàng)面的愈合進(jìn)程。此外，作為能量供應(yīng)的補(bǔ)充，肌酸的儲備也在雷公藤紅素處理后呈回調(diào)趨勢。此外，?；撬嶙鳛闈撛诘目寡趸瘎?可以保護(hù)組織免受氧化應(yīng)激造成的損傷[19]，雷公藤紅素處理后?；撬崴缴险{(diào)，提示該藥可能通過抗氧化應(yīng)激機(jī)制發(fā)揮促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面愈合的效應(yīng)。

4 結(jié) 論

雷公藤紅素可以調(diào)控糖尿病潰瘍創(chuàng)面的炎性細(xì)胞聚集以及膠原纖維的分布，促進(jìn)糖尿病潰瘍創(chuàng)面的愈合，代謝組學(xué)結(jié)果初步提示該藥可能通過促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、 改善線粒體功能和氧化應(yīng)激等機(jī)制發(fā)揮作用。本研究揭示了雷公藤紅素可以作為治療糖尿病潰瘍新藥開發(fā)的應(yīng)用潛能，雷公藤紅素對炎性細(xì)胞調(diào)控機(jī)制還有待于分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等技術(shù)進(jìn)一步研究。

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Abstract The experimental SD rats were randomly divided into normal control group （Con group）， diabetic ulcer model group （DM group） and Celastrol group （Cel group）. Except the control group， diabetic ulceration rat models were established by intraperitoneal injection of streptozotocin along with skin scald. And then， each group was treated by spraying the saline solution on the affected skin with （Cel group） or without （Con group and DM group） Cel （q.d.×14 d）. Nuclear magnetic resonance （NMR）based metabonomic analysis was applied to detect metabolic characteristics， accompanied by healing rate calculation and HE and Masson staining to study therapeutic effect of celastrol on accelerated healing of skin wounds of diabetic ulceration rats， which could be used to elucidate therapeutic effects of celastrol on the rat diabetic ulceration and its mechanism. The results showed that celastrol could induce epithelial regeneration of the rat ulcer wound， regulate the infiltration of inflammatory cells and the distribution of collagen fibers， and promote the healing of the ulcer wound. About 20 endogenous potential differential metabolites were screened and identified by partial least square analysis. Metabolic pathway analysis was carried out to show that celastrol can significantly recovery the level of the tricarboxylic acid cycle， promote its energy supply， accelerate the protein synthesis， improve mitochondrial dysfunction and oxidative stress， and accelerate the selfrepair ability of skin tissue. Celastrol can promote the healing of ulcers skins of the diabetic rats， which contribute to experimental basis of the drugs for the treatment of diabetic ulcers.

Keywords Celastrol； Diabetic ulceration； Nuclear magnetic resonance； Metabolomics

（Received 22 June 2017； accepted 2 December 2017）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No.81503335）and the Medical Science and Technology Innovation Foundation of Nanjing Military Region （No.14ZD13）endprint