一起沙門菌爆發(fā)的菌株鑒定和分子溯源研究

王 宇 許學斌 刁保衛(wèi) 王紅霞 陳 軍 周 玫 華哲云

摘要：[目的]1起沙門菌爆發(fā)的菌株鑒定和分子溯源研究。[方法]收集2007年上海市黃浦區(qū)1起食源性沙門菌爆發(fā)病例的菌株，使用3種不同產(chǎn)地沙門菌分型血清進行菌株比對鑒定，測試菌株耐藥性并對部分菌株進行多位點基因序列分型(MIST)。通過Pluse Net China非傷寒沙門菌數(shù)據(jù)庫聚類分析上海市與重慶市爆發(fā)菌株的脈沖凝膠電泳(PFGE)圖譜。[結(jié)果]發(fā)生在上海市黃浦區(qū)某工地爆發(fā)的1起食源性菌株，經(jīng)血清學和MIST鑒定為湯卜遜沙門菌ST 26型；菌株對6種抗生素(四環(huán)素、阿莫西林/克拉維酸、氨芐西林、氯霉素、萘啶酸、磺胺異惡唑)的耐藥率均為100％。2007年重慶市報告多起食源性爆發(fā)案例中的C群沙門菌，經(jīng)鑒定亦為湯卜遜沙門菌ST 26型，與上海市的菌株間存在高度遺傳同源性。[結(jié)論]蘭州生物制品研究所和泰國S&A的沙門菌分型血清的H因子“c”和“k”間存在交叉凝集。2007年上海市黃浦區(qū)發(fā)生的食源性爆發(fā)病例可能為輸入性湯卜遜沙門菌ST26型的多重耐藥克隆株引起。

關(guān)鍵詞：C群沙門菌；鑒別診斷；交叉凝集；分子分型；爆發(fā)；多重耐藥

中圖分類號：R516.3文獻標志碼：A

上海市黃浦區(qū)疾病預防控制中心作為上海市4個監(jiān)測點之一，于2007年加入全球沙門菌監(jiān)測網(wǎng)絡(GSS)，現(xiàn)更名為全球食源性感染性疾病監(jiān)測網(wǎng)(GFN)。實驗室按照方案要求配置泰國產(chǎn)沙門菌分型血清對監(jiān)測點醫(yī)院定期送檢的沙門菌腹瀉病例菌株進行血清學復核。2007年10月，黃浦區(qū)中心醫(yī)院連續(xù)報告5例以上疑為同一血清型的沙門菌腹瀉病例，實驗室初步鑒定為豬霍亂沙門菌，高度懷疑為聚集性病例，黃浦區(qū)疾病預防控制中心現(xiàn)場人員隨即對病例進行流行病學調(diào)查。爆發(fā)菌株經(jīng)我們使用泰國產(chǎn)沙門菌分型血清和丹麥SSI分型血清對菌株作分型比對、耐藥分析和脈沖凝膠電泳(PFGE)等表型與分子型的綜合分析后，最終確定引發(fā)此次食源性爆發(fā)的病原菌是湯卜遜沙門菌。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗菌株2007年上海市GSS監(jiān)測的18株湯卜遜沙門菌(包括黃浦區(qū)中心醫(yī)院分離的8株湯卜遜沙門菌爆發(fā)菌株和1株分離自市售豬肚的湯卜遜沙門菌)；大腸埃希菌ATCC25922為藥敏試驗質(zhì)控菌株；布倫登盧普沙門菌H9812作為PFGE的分子量標準菌株；國內(nèi)參考株丙型副傷寒沙門菌(CNCC50017-156)、豬霍亂沙門菌(CNCC50018-5)、豬霍亂孔成道夫變種沙門菌(CNCC50732)均來自上海市疾病預防控制中心菌種保藏室。

1.1.2培養(yǎng)基亞硒酸鹽煌綠增菌液(SBG)、羅伯特增菌液(RVS)、木糖賴氨酸膽酸鹽瓊脂平板(XLD)、CHROMagar(tm)沙門菌顯色瓊脂平板(CAS)、水解酪蛋白瓊脂平版(M-H)、H相誘導軟瓊脂平板來自上海科瑪嘉科技有限公司；腸道雙支糖綜合鑒別管和其他輔助生化鑒定試劑由本中心供應室配置。以上增菌液和平板均避光10℃以下保存，在有效期內(nèi)使用。

1.1.3試劑和儀器血清有沙門菌分型診斷血清50種(蘭州生物制品研究所)、沙門菌分型診斷血清79種(S&A，Ltd，泰國)、沙門菌分型血清118種(SSI，丹麥)；抗生素紙片包括四環(huán)素(TET)、頭孢噻呋(EFT)、阿莫西林/克拉維酸(AMC)、氨芐西林(AMP)、復方磺胺甲嗯唑(SXT)、環(huán)丙沙星(CIP)、氯霉素(C)、氧氟沙星(OFX)、萘啶酸(NA)、頭孢吡肟(FEP)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他啶(CAZ)、慶大霉素(CN)、鏈霉素(S)、磺胺異惡唑(s3)、甲氧芐氨嘧啶(W)(Oxoid，英國)16種；另有藥敏分配器，VitekAM-60自動生化鑒定儀(生物梅里埃，法國)和菌液比濁儀(西門子，德國)；限制性內(nèi)切酶Xba I(TaKaRa，日本)；SeaKem Gold瓊脂糖(Cambraex Bio Rockland，美國)；脈沖凝膠電泳儀CHEF mapper system和凝膠成像系統(tǒng)GEL Doc 2000(Bio-Rad，美國)。血清和抗生素紙片均在有效期內(nèi)使用。

1.2方法

1.2.1GSS監(jiān)測爆發(fā)病例調(diào)查按照《上海市沙門菌病監(jiān)測方案2007年》中的定義和流行病學調(diào)查程序進行。

1.2.2菌株鑒定8株爆發(fā)菌株由臨床實驗室使用蘭州生物所的沙門菌分型血清作初步鑒定后，送轄區(qū)疾病預防控制中心實驗室使用泰國S&A沙門菌分型血清復核鑒定，結(jié)果存疑者由市疾病預防控制中心實驗室用丹麥SSI沙門菌分型血清確認。玻片凝集屬于直接抗原抗體反應的定性試驗，根據(jù)抗原抗體產(chǎn)生凝集顆粒的程度進行分級。+：菌體抗原凝集顆粒細，背景渾濁不清；++：菌體抗原凝集顆粒較粗實，背景渾濁；+++：反應過程快，菌體抗原凝集顆粒細而均勻，背景較清；#：反應過程快，菌體抗原凝集顆粒粗實，背景清亮。

1.2.3抗生素敏感性試驗參照美國臨床實驗室標準研究所(CLSI，2007年版)的操作規(guī)程采用改良K-B法，根據(jù)抑菌圈直徑判斷敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)。頭孢噻呋(EFT)K-B法的判斷結(jié)果為19≤20～23 1≥24mm(由Oxoid公司提供參考值)。

1.2.4多位點基因序列分析MIST分型(ST型)挑選5株湯卜遜沙門菌，在中國疾病預防控制中心國家腸道病重點實驗室測定沙門菌基因組上的7個管家基因(thrA、purE、sucA、hisD、aroC、hemD、dnaN)的部分片段，完成多位點測序后輸入數(shù)據(jù)庫分型。

1.2.5PFGE和數(shù)據(jù)庫根據(jù)GSS監(jiān)測方案要求，將上海市2007年分離的18株湯卜遜沙門菌，在中國疾病預防控制中心傳染病預防控制國家重點實驗室按照Pulse Net規(guī)定的PFGE標準方法，獲得脈沖場凝膠電泳圖譜，使用Bio Numerics(Version 4.0)軟件進行聚類分析，并通過國家傳染病預防控制國家重點實驗室非傷寒沙門菌圖譜數(shù)據(jù)庫(Pluse Net China)比對上海市湯卜遜爆發(fā)菌株與重慶市C群沙門菌爆發(fā)菌株的分子圖譜。

2結(jié)果

2.1菌株來源

黃浦區(qū)中心醫(yī)院2007年10月報告同一菌型沙門菌腹瀉病人均來自黃浦區(qū)制造局路193號南聯(lián)工地。該工地共有建筑工人百余人，均為浙江紹興來滬務工人員，飲水為自來水，住宿為簡屋房，共有2層，約300m²，12人/間。旁邊為白搭廚房以及用餐點。經(jīng)流行病學調(diào)查核實，2007年10月4日—13日共發(fā)現(xiàn)11人腹瀉，男性6名，女性5名?；颊甙l(fā)病時間為5日2人，9日3人，11日1人，13日3人。臨床癥狀表現(xiàn)均有腹瀉癥狀，稀便；發(fā)熱4人，嘔吐5人。發(fā)病后主動就診，其中8人分離出沙門菌(經(jīng)最終確認為湯卜遜沙門菌)。發(fā)病者有明顯的

可疑食物及共同進餐史。調(diào)查中未能獲取可疑污染食品，現(xiàn)場經(jīng)環(huán)境消毒等措施處置后，未見后續(xù)病例。

2.2菌株確認

黃浦區(qū)中心醫(yī)院實驗室分離的8株爆發(fā)菌株經(jīng)蘭州生物制品研究所的沙門菌分型血清初步鑒定為豬霍亂沙門菌，后經(jīng)區(qū)疾病預防控制中心使用泰國S&A血清復核后發(fā)現(xiàn)存在H相位的“c”和“k”，因子間的交叉凝集現(xiàn)象，多數(shù)菌株可以根據(jù)交叉凝集結(jié)果的強弱初步判斷為湯卜遜沙門菌。用丹麥SSI血清比對8株爆發(fā)菌株均與“k”因子呈特異性凝集而“c”因子不凝集，最終確認為湯卜遜沙門菌。

2.3國內(nèi)參考株的血清學比對和ST分型

國內(nèi)參考株丙型副傷寒沙門菌(CNCC 50017-156)的ST型為146，目前在沙門菌MLST數(shù)據(jù)庫中，該ST型菌株均為丙型副傷寒沙門菌；國內(nèi)參考株豬霍亂沙門菌(CNCC50018-5)為ST 139，數(shù)據(jù)庫中該型也均為豬霍亂沙門菌；國內(nèi)參考株豬霍亂孔成道夫變種沙門菌(CNCC 50732)的sT型為145，數(shù)據(jù)庫顯示該sT型菌株為豬霍亂孔成道夫變種沙門菌或豬霍亂沙門菌；5株爆發(fā)菌株ST型均為26，MLST數(shù)據(jù)庫顯示，該型菌株均為湯卜遜沙門菌。MLST結(jié)果與丹麥SSI血清分型結(jié)果完全一致(表1)。

2.4菌株耐藥性

8株爆發(fā)株對14種抗生素的耐藥譜完全一致，其中對四環(huán)素、阿莫西彬克拉維酸、氨芐西林、氯霉素、萘啶酸均100％耐藥。

2.5PFGE分型

上海市的18株湯卜遜沙門菌經(jīng)Xba I酶切的電泳圖譜完全一致，屬于同一遺傳克隆。通過中國疾病預防控制中心國家非傷寒沙門菌圖譜數(shù)據(jù)庫(Pluse Net China)，聚類分析上海湯卜遜爆發(fā)菌株與重慶市C群沙門菌菌株的圖譜，兩地菌株的圖譜均符合爆發(fā)菌株的典型特征，重慶的爆發(fā)菌株間有90％的遺傳同源性，與上海爆發(fā)菌株間有85％的遺傳同源性；上海1株湯卜遜食源菌株與爆發(fā)菌株存在70％的遺傳同源性，1株散發(fā)病例菌株與重慶爆發(fā)菌株間有95％的遺傳同源性(圖1)。

3討論

由于8株湯卜遜沙門菌爆發(fā)菌株的最后確診，使湯卜遜沙門菌列上海市2007年非傷寒沙門菌l臨床腹瀉病例的第3位。分析診斷初始被誤報為豬霍亂沙門菌的原因：①僅有1個H因子的差異，由于國產(chǎn)分型血清“k”與“c”因子間存在的交叉凝集，且“c”因子一旦“先入為主”后，很容易產(chǎn)生豬霍亂沙門菌的結(jié)論。②技術(shù)人員缺少對沙門菌主要菌型致病理論的認知是產(chǎn)生錯誤的次要因素，除傷寒沙門菌外，甲型副傷寒和豬霍亂沙門菌也屬臨床常見的侵襲性(菌血癥)沙門菌，血培養(yǎng)多見，腸道罕見。由3種沙門菌分型血清的現(xiàn)場比對說明，沙門菌分型血清的優(yōu)劣是除操作者自身使用技能以外的另一個對結(jié)果準確性有重要影響的客觀因素之一。類似的混淆問題發(fā)生在早些時候(2007年7—9月，重慶市)報告數(shù)起丙型副傷寒沙門菌引起食源性爆發(fā)的診斷中。當?shù)丶膊☆A防控制中心的結(jié)論因未檢測到相應Vi基因而被中國疾病預防控制中心傳染病預防控制國家重點實驗室否定，后經(jīng)泰國S&A、丹麥SSI血清和MLST鑒定亦為湯卜遜沙門菌ST26型。

C群沙門菌中有多個血清型因抗原式相同導致難以鑒別，本次研究發(fā)現(xiàn)的確存在豬霍亂與湯卜遜沙門菌、丙型副傷寒與湯卜遜沙門菌之間的多重混淆。對此，技術(shù)人員除依賴高質(zhì)量的診斷血清及科學嚴謹?shù)囊蜃予b定流程外，還要輔以某些特殊生化反應。丙型副傷寒沙門菌Vi抗原有不穩(wěn)定性，即Vi為陰性也無法排除丙型副傷寒沙門菌，必須對Vi進行多次誘導后方可排除丙型副傷寒沙門菌，有條件者可用PCR方法檢測Vi基因，這樣就不會將豬霍亂沙門菌(包括豬霍亂孔成道夫變種和得揆忒變種)誤判成丙型副傷寒沙門菌。其次單純的血清分型無法鑒別豬霍亂、豬霍亂孔成道夫變種以及豬霍亂得揆忒變種3種沙門菌血清型，簡易生化試驗能夠鑒別(見表2)，前提是因子的鑒定須正確。類似的情況也存在乙型副傷寒與爪哇沙門菌的鑒定中。兩者抗原式完全相同，僅靠酒石酸鹽反應即可甄別：爪哇沙門菌陽性而乙型副傷寒沙門菌為陰性。但最終報告在法定傳染病疫情管理中的意義卻顯著不同，乙型副傷寒沙門菌可引起類傷寒樣癥狀，屬國家乙類報告和管理傳染病，而爪哇沙門菌導致的腸炎屬丙類報告?zhèn)魅静?。由此表明，正確的血清型鑒定結(jié)果能體現(xiàn)腸道傳染病早期防控的科學價值。

基于基因組差異的分子分型技術(shù)已得到越來越多的應用。在本研究中，我們利用Pluse Net China數(shù)據(jù)庫將上海爆發(fā)菌株與重慶的“丙型副傷寒”沙門菌爆發(fā)菌株的圖譜進行聚類對比，并使用多位點基因序列分型(MIST)，最終確認不同時間、不同空間的病例菌株同屬湯卜遜沙門菌克隆株。因存在高度遺傳同源性，使我們有理由懷疑該ST 26型克隆株存在外源性輸入的流行病學特征。

早期國外開展的沙門菌監(jiān)測不太強調(diào)臨床實驗室對沙門菌的分型能力，而GSS項目開始轉(zhuǎn)變這種依靠公共衛(wèi)生實驗室診斷沙門菌的模式。開始逐步推廣到哨點的臨床實驗室。這種循序漸進的方式值得國內(nèi)即將建立的沙門菌監(jiān)測體系借鑒，更為重要的是，此能力建設需要得到臨床實驗室在技術(shù)與管理體系上的重視并加大投入。因此，我們建議臨床實驗室與轄區(qū)疾病預防控制中心實驗室之間合理互補、優(yōu)化配置沙門菌的分型血清，共享血清鑒定程序，避免誤判現(xiàn)象。

1999年3月6—31日，美國加洲曾發(fā)生因食用被污染的鮮香菜造成76人湯卜遜沙門菌感染發(fā)病(其中35人的流調(diào)特征屬散發(fā)病例)；2000年8月，美國加洲南部出現(xiàn)持續(xù)增多的湯卜遜沙門菌腹瀉病例，最后確認源于1名隱性感染的食品從業(yè)人員不斷加工生產(chǎn)的“帶菌”面包。以上信息充分說明正確的沙門菌血清分型是沙門菌感染流行病學分析、分子分型的先決條件，我國已開始較大范圍的沙門菌監(jiān)測，必將發(fā)現(xiàn)更多公共衛(wèi)生新問題，所以要求實驗室嚴格診斷血清的質(zhì)量控制和鑒定程序，準確的分型結(jié)果可促進對沙門菌病的溯源調(diào)查和科學防控。