高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)原理及其在藥物篩選中的應(yīng)用

唐梅 于曉鳳

【摘要】高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)目前已成為藥物篩選、細(xì)胞生物學(xué)功能研究的常用技術(shù)，廣泛應(yīng)用至腫瘤、干細(xì)胞、炎癥、靶點驗證、免疫性疾病和新藥研發(fā)等研究領(lǐng)域。文章簡要概述了高內(nèi)涵系統(tǒng)的原理，并對其在細(xì)胞周期、凋亡、細(xì)胞毒性、細(xì)胞遷移等方面的研究進(jìn)展作一綜述。

【關(guān)鍵詞】高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng);藥物篩選;應(yīng)用

Abstract： High content imaging analysis system （HCA） has become the common technology in drug screening and cell biology function research， which has been widely used in the field of tumors， stem cells， inflammatory， autoimmune disease， target validation， autoimmune disease and drug development. This paper summarizes the principle of the HCA， as well as the research developments in the research of cell cycle， apoptosis， cell toxicity， migration.

Key words： high content imaging analysis system; drug screening; application

【中圖分類號】F763 ? 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A ? 【文章編號】2026-5328（2021）06-041-03

0引言

細(xì)胞成像技術(shù)已成為細(xì)胞生物學(xué)、腫瘤生物學(xué)等許多相關(guān)研究領(lǐng)域的常用技術(shù)，成像技術(shù)可以將由簡至繁的疾病、細(xì)胞、生物和化學(xué)事件可視化，觀察簡單、快速。但無法進(jìn)行單細(xì)胞水平的批量參數(shù)分析。作為細(xì)胞生物學(xué)功能研究的另一種常用技術(shù)，流式細(xì)胞分析技術(shù)（flow cytometry， FCM）可以對熒光標(biāo)記的單細(xì)胞或顆粒進(jìn)行定量分析，具有高速、精準(zhǔn)等優(yōu)點，但無法同時獲得圖像，會丟失細(xì)胞形態(tài)、結(jié)構(gòu)、動態(tài)變化、3D結(jié)構(gòu)等信息。

高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)（High Content Analysis， HCA）可以結(jié)合細(xì)胞成像技術(shù)和流式細(xì)胞技術(shù)的優(yōu)點，進(jìn)行全自動高通量熒光顯微成像及多參數(shù)定量圖像分析，為科研提供了快速有效的工具，目前已應(yīng)用至腫瘤、干細(xì)胞、炎癥、免疫性疾病、靶點驗證和新藥研發(fā)等研究領(lǐng)域，成為細(xì)胞生物學(xué)功能研究的常用技術(shù)[1-5]。HCA圖像分析軟件具有智能化參數(shù)處理模塊，采用以細(xì)胞數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)的計算模型，大大提高了對復(fù)雜圖像的批量分析能力。文章概述了高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)的技術(shù)原理，并根據(jù)我們的實驗經(jīng)驗對影響實驗結(jié)果的因素進(jìn)行總結(jié)和討論，最后對其在細(xì)胞周期、細(xì)胞毒性、細(xì)胞遷移等方面的應(yīng)用進(jìn)展作一綜述。

1 ?HCA的技術(shù)原理

1.1 HCA的概念。

高內(nèi)涵系統(tǒng)也被稱為高內(nèi)涵篩選，其概念早在20世紀(jì)80年代就被提出[6]，早期應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域，現(xiàn)在已廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)、免疫學(xué)、毒理學(xué)、藥學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)等多個領(lǐng)域[7-12]。HCA能夠在保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整的前提下，對細(xì)胞、亞細(xì)胞及3D微組織進(jìn)行多通道的自動化成像，獲得單細(xì)胞水平的細(xì)胞形態(tài)、熒光強(qiáng)度、細(xì)胞動態(tài)等多維參數(shù)[13-15]。

1.2 HCA的實驗流程。

HCA的實驗流程包括高內(nèi)涵成像樣品的準(zhǔn)備、獲取明場或熒光圖像、高內(nèi)涵數(shù)據(jù)分析。（1）樣品準(zhǔn)備

樣品準(zhǔn)備包括微孔板選擇和細(xì)胞培養(yǎng)和熒光標(biāo)記。高內(nèi)涵的成像孔板包括6-384孔板，貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)適合選擇TC-treated孔板，保證細(xì)胞貼壁良好，普通多孔板厚度約為 1um，適合于低倍鏡拍攝。分析細(xì)胞濃度、形態(tài)時可以選擇普通多孔板，但在觀察細(xì)胞器結(jié)構(gòu)等需要更好成像效果的實驗以及需要使用高倍鏡如40倍、63倍鏡時，都適合選擇薄底板。微孔板常用有聚苯乙烯材質(zhì)和玻璃材質(zhì)，玻璃材質(zhì)相對透光性更好，但不合適貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)，可以對微孔板進(jìn)行特殊處理，如用明膠、膠原等包被[16，17]。細(xì)胞需均勻單層鋪板，鋪板時優(yōu)化細(xì)胞濃度，控制細(xì)胞生長時間，保證檢測時細(xì)胞密度不超過75%，以確保分析時細(xì)胞拆分準(zhǔn)確。細(xì)胞處理和熒光標(biāo)記時需參考文獻(xiàn)確定藥物濃度、處理時間、抗體染料濃度等。

（2）圖像獲取

隨著高內(nèi)涵系統(tǒng)和顯微鏡領(lǐng)域的發(fā)展，HCA設(shè)備在光源、采集裝置等配置上都有了很大提高。HCA具有寬場、明場、共聚焦三種成像方式，寬場成像視野大、速度快，但存在較大的背景噪聲，且成像深度不夠。共聚焦成像可以去除非焦平面的信號，使得其對比度和分辨率更高，但共聚焦成像需要更長的曝光時間或能量更強(qiáng)的激發(fā)光，造成對細(xì)胞的光毒性和光淬滅性更大。所以對于易淬滅熒光樣品及活細(xì)胞長時間動態(tài)觀察的實驗，合適選擇寬場成像，對于厚樣本和微組織3D成像適合選擇共聚焦成像模式。

（3）數(shù)據(jù)分析

HCA的分析軟件可對同一實驗的多參數(shù)、多維度數(shù)據(jù)進(jìn)行自動化定量分析，包括對細(xì)胞個體或群體進(jìn)行靶標(biāo)分子定量檢測和表型檢測，以及進(jìn)行大數(shù)據(jù)生物信息學(xué)分析。分析系統(tǒng)預(yù)設(shè)幾十種復(fù)雜而精確的算法對圖像進(jìn)行運算獲得數(shù)百種圖像參數(shù)，從而挖掘生物學(xué)相關(guān)信息。目前常用的分析軟件有PerkinElmer公司的Columbus、Operetta、High content profiler以及Thermo Fisher公司的HCS Studio細(xì)胞分析軟件、Store圖像及數(shù)據(jù)庫管理軟件等。

2 ?HCA在藥物篩選領(lǐng)域的應(yīng)用

2.1 細(xì)胞周期

腫瘤治療中最重要的治療策略之一就是針對細(xì)胞增殖與細(xì)胞分裂進(jìn)行抑制。這兩者都可以使用高內(nèi)涵多標(biāo)記細(xì)胞成像方式檢測[18]。崔巍等[19]采用應(yīng)用高內(nèi)涵技術(shù)對心肌成纖維細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)行分析，檢測了 BrdU陽性比例細(xì)胞各分裂時期細(xì)胞百分比，將各項參數(shù)與流式細(xì)胞分析結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)沒有統(tǒng)計學(xué)差異，證明了高內(nèi)涵系統(tǒng)能精確、量化地分析細(xì)胞增殖。段紹維等[20]利用高內(nèi)涵系統(tǒng)獲得有絲分裂指數(shù)、微管、紡錘體形成等細(xì)胞周期評價指標(biāo)，分析了土槿皮乙酸對人乳腺癌細(xì)胞周期的影響。Gasparri等[21]利用高內(nèi)涵系統(tǒng)分析了BrdU陽性的細(xì)胞比例、細(xì)胞核熒光強(qiáng)度等增殖參數(shù)，研究生長因子和血清刺激后人皮膚成纖維的增殖情況。

2.2 細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是一個與基因的激活、表達(dá)、調(diào)控等復(fù)雜作用相關(guān)的過程，所以對于凋亡的檢測評價參數(shù)應(yīng)是多維度的。目前對于凋亡的研究主要在形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)水平上的變化，形態(tài)學(xué)變化包括核皺縮、核膜破碎、線粒體形態(tài)變化、凋亡小體出現(xiàn)等。生物化學(xué)上的變化包括染色質(zhì)的DNA斷裂、線粒體膜電位變化、胞膜滲透性變化、caspases （半胱天冬酶）的激活等。喬可等[22]應(yīng)用高內(nèi)涵的活細(xì)胞長時間成像模塊通過檢測細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度、細(xì)胞核尺寸、細(xì)胞核的碎片化等多種參數(shù)，研究了小鼠神經(jīng)瘤母細(xì)胞經(jīng)谷氨酸處理后的形態(tài)學(xué)變化特征。任艷青等[23]利用高內(nèi)涵系統(tǒng)通過檢測線粒體膜電位、膜通透性、核DNA 含量、核形態(tài)、細(xì)胞數(shù)量等參數(shù)的變化研究了黃芩配方顆粒對人肝癌 HepG2細(xì)胞凋亡的影響。

2.3 細(xì)胞毒性

在藥物研發(fā)過程中，能夠及時對早期毒性指標(biāo)進(jìn)行檢測是非常重要的一部分。李丹丹等[24]用生首烏醇提物和制首烏醇提物處理人源性肝癌細(xì)胞Hep G2，利用高內(nèi)涵系統(tǒng)獲得細(xì)胞數(shù)、胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子、線粒體功能相關(guān)參數(shù)等檢測指標(biāo)，證明兩種藥物的肝毒性與細(xì)胞凋亡具有很大的相關(guān)性。利用高內(nèi)涵的活細(xì)胞長時間成像模式監(jiān)測藥物細(xì)胞毒性的研究也很多。高陽[25]等利用高內(nèi)涵系統(tǒng)動態(tài)觀察藥物處理后的Hep G2細(xì)胞數(shù)、核DNA含量、谷胱甘肽水平、活性氧水平、線粒體膜電位等5個參數(shù)，對藥物的細(xì)胞毒性作用進(jìn)行定量分析。

2.4細(xì)胞遷移

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤重要的生物學(xué)特性，研究腫瘤轉(zhuǎn)移過程及分子機(jī)制對于臨床治療有重要意義。研究者開始利用高內(nèi)涵系統(tǒng)對單細(xì)胞進(jìn)行長時間實時追蹤，分析細(xì)胞運動的距離、速度、偏轉(zhuǎn)角度等遷移參數(shù)。王睿[26]采用transwell實驗利用高內(nèi)涵系統(tǒng)長時間動態(tài)檢測2種黃酮類化合物處理后胃癌細(xì)胞的遷移情況，研究發(fā)現(xiàn)兩種化合物均能抑制胃癌細(xì)胞的遷移能力。近年來對于miRNA在腫瘤治療中的研究越來越多，研究表明miRNA在腫瘤細(xì)胞增殖、遷移等過程中起到重要調(diào)控作用，對于腫瘤治療具有重要意義。常顏信[27]利用高內(nèi)涵系統(tǒng)篩選出17個與膽囊癌轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNAs。Zhang H S[28]等對癌細(xì)胞中參與調(diào)控細(xì)胞遷移的miRNAs利用高內(nèi)涵系統(tǒng)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在各種不同類型的癌細(xì)胞中超過20%的miRNAs對細(xì)胞的遷移能力產(chǎn)生影響。

3 ?結(jié)語

近年來，高內(nèi)涵系統(tǒng)因其高通量、高效率等優(yōu)勢已在腫瘤研究、新藥研發(fā)等方面得到廣泛應(yīng)用。高內(nèi)涵系統(tǒng)可以在一次實驗中獲得多靶點、多維度且同時涉及形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)水平的參數(shù)，其配置的活細(xì)胞工作站模塊可以對細(xì)胞的生長、遷移等活動進(jìn)行長時間動態(tài)監(jiān)測，復(fù)雜、智能的自動化分析軟件為研究者提供精確、可靠的數(shù)據(jù)。因此，高內(nèi)涵技術(shù)已成為藥物篩選和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域的重要技術(shù)手段。

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基金項目：浙江中醫(yī)藥大學(xué)科研項目資助（批準(zhǔn)號：2020ZY19）

作者簡介：唐梅，1987.08，女，漢族，安徽合肥人，碩士，助理實驗師，研究方向：細(xì)胞與分子生物學(xué)。

*通訊作者：于曉鳳，1989.11，女，漢族，山東萊西人，碩士，助理實驗師，研究方向：細(xì)胞與分子生物學(xué)。

浙江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥科學(xué)院 ?杭州 ?310053