沒食子酸對人肝癌HepG2細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響及其機制

摘要：目的 觀察沒食子酸（GA）對人肝癌HepG2細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，并探討其作用機制。方法 用不同濃度GA（0、5、10、20、30、40、50 μg/mL）處理肝癌HepG2細胞24 h和48 h后，CCK-8法檢測細胞活性并計算IC 50 值；實驗分為對照組（HepG2細胞）、5 μg/mL GA組、10 μg/mL GA組、20 μg/mL GA組，平板克隆形成實驗檢測GA對細胞增殖能力的影響，細胞劃痕和Transwell小室侵襲實驗檢測GA對細胞遷移和侵襲能力的影響，流式細胞儀檢測GA對細胞凋亡的影響；Western Blot檢測基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、MMP-9和凋亡相關蛋白表達情況。多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。結果 GA作用HepG2細胞24 h和48 h的IC 50 值為（38.02±2.58）μg/mL和（18.36±1.54）μg/mL。對照組、5 μg/mL GA組、10 μg/mL GA組、20 μg/mL GA組的細胞克隆形成數(shù)分別為（239.00±29.45）個、（210.00±19.00）個、（144.33±16.03）個、（57.00±9.55）個，與對照組比較，各實驗組細胞克隆形成能力均明顯下降（P值均lt;0.05）。處理24 h后，各組細胞的遷移率分別為42.62%±7.82%、35.34%±6.42%、21.85%±4.42%、12.57%±3.54%，穿膜細胞數(shù)目分別為（230.30±15.30）個、（182.12±12.60）個、（137.20±7.50）個、（124.40±6.80）個，與對照組比較，各實驗組細胞的相對遷移率和穿膜細胞數(shù)均明顯下降（P值均lt;0.05）。處理48 h后，各組細胞凋亡率分別為0.67%±0.08%、13.27%±1.07%、20.94%±2.45%、40.74%±2.63%，與對照組比較，各實驗組細胞凋亡率均明顯升高（P值均lt;0.05）。與對照組比較，各實驗組細胞MMP-2、MMP-9表達水平均明顯降低（P值均lt;0.05），Bcl-2關聯(lián)X蛋白（Bax）、裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved caspase-3）蛋白表達水平均明顯升高（P值均lt;0.05）。結論 GA可抑制HepG2細胞增殖、遷移和侵襲，促進其凋亡，作用機制可能與調控Bax/Bcl-2以及遷移相關蛋白MMP-2、MMP-9有關。

關鍵詞：沒食子酸；肝腫瘤，實驗性；細胞增殖；細胞運動；細胞凋亡

基金項目：吉林省衛(wèi)生與健康技術創(chuàng)新項目（2020J082）

Effect and mechanism of gallic acid on the proliferation，migration，invasion，and apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells

WANG Zhiru，ZHAO Wenjing，CHEN Xi

Central Laboratory，Hepatobiliary Hospital of Jilin，Changchun 130062，China

Corresponding author：ZHAO Wenjing，xingyuewj@163.com （ORCID：0000-0002-0841-9362）

Abstract：Objective To investigate the effect of gallic acid （GA） on the proliferation，migration，invasion，and apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2 cells and its mechanism. Methods HepG2 cells were treated with different concentrations of GA （0，5，10，20，30，40，and 50 μg/mL） for 24 and 48 hours，and CCK8 assay was used to measure cell viability and calculate IC 50 . The experiment was divided into control group （HepG2 cells），5 μg/mL GA group，10 μg/mL GA group，and 20 μg/mL GA group. Plate colony formation assay was used to evaluate the effect of GA on cell proliferation；wound healing assay and Transwell chamber assay were used to observe the effect of GA on cell migration and invasion；flow cytometry was used to observe the effect of GA on cell apoptosis；Western blot was used to measure the expression of matrix metallopeptidase-2 （MMP-2），matrix metallopeptidase-9 （MMP-9），and apoptosis-related proteins. A one-way analysis of variance was used for comparison between multiple groups，and the least significant difference t-test was used for further comparison between two groups. Results The mean IC 50 value of GA on HepG2 cells was 38.02±2.58 μg/mL at 24 hours and 18.36±1.54 μg/mL at 48 hours. The number of cell colonies was 239.00±29.45 in the control group，210.00±19.00 in the 5 μg/mL GA group，144.33±16.03 in the 10 μg/mL GA group，and 57.00±9.55 in the 20 μg/mL GA group，suggesting that compared with the control group，each GA group had a significant reduction in cell colony formation ability （all Plt;0.05）. After 24 hours of treatment，the cell migration rate was 42.62%±7.82% in the control group，35.34%±6.42% in the 5 μg/mL GA group，21.85%±4.42% in the 10 μg/mL GA group，and 12.57%±3.54% in the 20 μg/mL GA group，respectively，in these four groups，and the number of transmembrane cells in these four groups was 230.30±15.30，182.12±12.60，137.20±7.50，and 124.40±6.80，respectively，suggesting that compared with the control group，each GA group had significant reductions in migration rate and the number of transmembrane cells （all Plt;0.05）. After 48 hours of treatment，the cell apoptotic rate was 0.67%±0.08% in the control group，13.27%±1.07% in the 5 μg/mL GA group，20.94%±2.45% in the 10 μg/mL GA group，and 40.74%±2.63% in the 20 μg/mL GA group，and compared with the control group，each GA group had a significant increase in cell apoptosis rate （all Plt;0.05）. Compared with the control group，each GA group had significant reductions in the protein expression levels of MMP-2 and MMP-9 （all Plt;0.05） and significant increases in the protein expression levels of Bax and cleaved caspase-3 （all Plt;0.05）. Conclusion GA can inhibit the proliferation，migration，and invasion of HepG2 cells and promote the apoptosis of HepG2 cells，possibly by regulating MMP-2，MMP-9，and the apoptosis-related proteins Bax/Bcl-2.

Key words：Gallic Acid；Liver Neoplasms，Experimental；Cell Proliferation；Cell Movement；Apoptosis

Research funding：Health Science and Health Technology Innovation Project of Jilin Province （2020J082）

肝細胞癌（HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一［1］，其預后差病死率高，病死率位居惡性腫瘤第二位［2-3］。研究表明，腫瘤復發(fā)和轉移是導致HCC患者死亡的重要原因，抑制癌細胞的遷移、侵襲是HCC防治的關鍵［4-5］。藥用植物及其有效活性成分是良好的抗腫瘤藥物來源。沒食子酸（gallic acid，GA）是一種天然多酚類化合物，存在于山茱萸、五倍子、牡丹皮、掌葉大黃等多種植物［6］，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒等藥理作用［7］。研究表明，GA對結腸癌、胃癌等腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲具有顯著的抑制作用，并促進腫瘤細胞凋亡［8-9］。本研究觀察GA對HepG2細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響，探討GA抗肝癌的作用分子機制，以期為抗肝癌新藥開發(fā)提供理論基礎和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人肝癌HepG2細胞（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號 KG020）；GA（Med Chem Express，批號HY-N0523）；MEM培養(yǎng)基（江蘇凱基生物技術股份有限公司，批號KGL1601-500）；胎牛血清（普諾賽，批號164210-50）；CCK-8（APEXBIO）；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（BD）；Matrigel基質凝膠（Corning）；兔抗人B 細胞淋巴瘤因子 2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、兔抗人Bcl-2關聯(lián)X蛋白（Bcl2-associated X protein，Bax）、小鼠抗人基質金屬蛋白酶2（matrix metallpproteinase-2，MMP-2）、兔抗人MMP-9、兔抗人裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved caspase-3）抗體均購自英國Abcam公司。Olympus CHX41倒置顯微鏡；Rayto RT-2100型多功能酶標儀；上海天能凝膠成像系統(tǒng)；Beckman DxELEX流式細胞儀；上海安亭TGL-20B高速臺式離心機。

1.2 CCK-8法檢測細胞活性 HepG2細胞接種于96孔板（6×10 3 個/孔），培養(yǎng)24 h后分為對照組、空白組（無細胞）和實驗組，對照組和空白組加入100 μL完全培養(yǎng)基，實驗組加入100 μL不同濃度GA（5、10、20、30、40、50 μg/mL）的培養(yǎng)基，每組設5個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h后，每孔加入CCK-8試劑10 μL，4 h后酶標儀450 nm波長處測定吸光度（A）值。細胞存活率（%）=（A 實驗組 －A 空白組 ）/ （A 對照組 －A 空白組 ）×100%，計 算 半 數(shù) 抑 制 濃 度（IC 50 ）。 實 驗 重復3次。

1.3 平板克隆形成實驗檢測細胞增殖能力 HepG2細胞接種于6孔板（1×10 3 個/孔），培養(yǎng)24 h后分為對照組、5 μg/mL（1/4 IC 50 ） GA 組、10 μg/mL（1/2 IC 50 ） GA 組和20 μg/mL（IC 50 ） GA組，對照組加入完全培養(yǎng)基，實驗組加入終濃度為5、10和20 μg/mL GA。置于37 ℃、5% CO 2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至肉眼觀察到可見的克隆時終止培養(yǎng)，4%多聚甲醛溶液固定，結晶紫染色，晾干后相機拍照，利用Image J軟件對細胞集落數(shù)進行計數(shù)。實驗重復3次。

1.4 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 HepG2細胞接種于6孔板（1×10 6 個/孔），培養(yǎng)24 h后用200 μL移液器槍尖垂直六孔板底部劃線，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗去除懸浮細胞，實驗分組同“1.3”，劃痕24 h觀察劃痕愈合情況并計算各自細胞的相對遷移率。相對遷移率=（0 h劃痕寬度－培養(yǎng)24 h后劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。實驗重復3次。

1.5 Transwell 侵襲實驗檢測細胞侵襲能力 50 μL 的Matrigel基質凝膠（1∶8稀釋）涂布于Transwell小室上室膜面上，置于培養(yǎng)箱中固化4 h，上室接種5×10 4 個GA預處理24 h的HepG2細胞，下室加入600 μL含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h取出上室，棉簽擦去聚碳酸酯膜上的上層細胞，將Transwell小室4%多聚甲醛固定30 min，結晶紫染色，顯微鏡下觀察拍照并計數(shù)穿過膜細胞數(shù)。實驗重復3次。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 HepG2細胞接種于6孔板（2×10 5 個/孔），分組同“1.3”，干預48 h后收集各組細胞，嚴格按照試劑盒染色說明書收集細胞、染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。細胞凋亡率=（早期凋亡細胞數(shù)+晚期凋亡細胞數(shù)）/細胞總數(shù)×100%。實驗重復3次。

1.7 Western Blot法檢測HepG2細胞MMP-2、MMP-9和凋亡相關蛋白表達 HepG2細胞分組同“1.3”，干預48 h后收集各組細胞，使用含有磷酸酶和蛋白酶抑制劑的PIPA裂解液提取細胞蛋白。取20 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳并轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉4 h，加入一抗4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記二抗，室溫孵育2 h，ECL發(fā)光試劑顯色并拍照。目的蛋白的相對表達水平=目的蛋白條帶灰度值/內參β-actin條帶灰度值。實驗重復次3次。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以 x ˉ ±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用 LSD-t 檢驗。Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 GA 對 HepG-2 細胞活性的影響 經(jīng) 5、10、20、30、40、50 μg/mL GA作用24、48 h后，HepG2細胞活性明顯下降（F 值分別為 189.489、447.520，P 值均lt;0.001）（圖 1），GA作用HepG2細胞24、48 h的IC 50 均值分別為（38.02±2.58）μg/mL和（18.36±1.54）μg/mL；結合預實驗結果設置5、10、20 μg/mL GA作用48 h進行后續(xù)實驗。

2.2 GA對HepG2細胞增殖能力的影響 對照組和5、10、20 μg/mL GA 組 HepG2 細 胞 的 細 胞 集 落 數(shù) 分 別 為 ：（239.00±29.45）個、（210.00±19.00）個、（144.33±16.03）個、（57.00±9.55）個。與對照組比較，10、20 μg/mL GA組細胞集落形成數(shù)顯著減少（P值均lt;0.05）；與5 μg/mL GA組比較，10、20 μg/mL GA 組集落形成數(shù)顯著減少（P 值均lt;0.05），且呈濃度依賴性（圖2）。

2.3 GA 對 HepG2細胞遷移能力的影響 與對照組比較，5、10、20 μg/mL GA 組 HepG2 細胞遷移率明顯降低（P值均lt;0.05），且呈劑量依賴性（圖3，表1）。

2.4 GA 對 HepG2細胞侵襲能力的影響 與對照組比較，5、10、20 μg/mL GA組HepG2細胞中穿膜細胞數(shù)明顯減少（P值均lt;0.05），且呈劑量依賴性（圖4，表1）。

2.5 GA 對 HepG2 細胞凋亡的影響 對照組和 5、10、20 μg/mL GA組HepG2細胞凋亡率分別為：0.67%±0.08%、13.27%±1.07%、20.94%±2.45%、40.74%±2.63%。與對照組比較，不同劑量GA組細胞凋亡率明顯升高（P值均lt;0.05）；與5 μg/mL GA組比較，10、20 μg/mL GA組細胞凋亡率顯著升高（P值均lt;0.05）（圖5）。

2.6 GA對HepG2細胞MMP-2、MMP-9和凋亡相關蛋白表達的影響 與對照組比較，5、10、20 μg/mL GA組HepG2細胞遷移相關蛋白MMP-2、MMP-9表達水平顯著下調（P值均lt;0.05）；10、20 μg/mL GA組凋亡相關蛋白Bcl-2表達水平顯著下調（P值均lt;0.05）；5、10、20 μg/mL GA組Bax、Cleaved caspase-3 蛋白表達水平顯著上調（P 值均lt;0.05）（圖6）。

3 討論

在中國，肝癌發(fā)病率位居惡性腫瘤第4位，病死率居腫瘤致死病因的第2位，2020年我國肝癌新發(fā)病例達到41 萬人，死亡 39 萬人，占全球的 45.1% 和 46.9%，嚴重威脅人民的生命安全［10］。對于早期肝癌患者，手術治療是較為有效的治療手段，但臨床數(shù)據(jù)分析顯示，僅5%～15% 的患者發(fā)現(xiàn)較早有機會行手術切除［11］。肝癌起病隱匿，進展迅速，大多數(shù)患者就診時已失去根治性手術治療機會，化療是晚期肝癌治療的主要手段。治療肝癌的一線靶向藥物主要包括索拉非尼、侖伐替尼，二線藥物主要包括瑞戈非尼、卡博替尼及雷莫蘆單抗等［12-13］。我國肝癌患者多數(shù)具有乙型肝炎及肝硬化背景，就診時大多數(shù)為中晚期，患者肝內腫瘤負荷大且合并門靜脈癌栓、肝功能較差，導致療效有限且不良反應明顯，HCC的總生存率仍然很低，尋找高效低毒的抗肝癌藥物是研究熱點［14］。吳昊等 ［15］研究表明，GA 能夠抑制食管癌細胞的增殖、遷移和集落形成，并通過調控細胞內活性氧水平促進食管癌細胞凋亡；Zhang等［9］研究表明，GA通過調控Janus激酶/信號轉導與轉錄激活因子 3 信號通路增強順鉑的抗非小細胞肺癌作用。目前關于 GA 對肝癌細胞遷移、侵襲的影響尚未見報道。本研究結果表明，GA 在體外實驗中可以抑制HepG2細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡，可能具有抗肝癌活性。

腫瘤細胞浸潤和轉移到其他組織增殖形成新的侵襲轉移瘤，是惡性腫瘤的一個重要生物學特性。腫瘤細胞轉移與患者病死率密切相關，是決定患者預后的因素之一［16］。MMP能夠特異性降解細胞間基質，調節(jié)細胞間基質代謝的主要限速酶，其中MMP-2和MMP-9能夠降解明膠、層黏連蛋白和Ⅳ型膠原等，參與腫瘤的遷移和侵襲［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，GA在體外顯著降低HepG2細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達，GA通過降低MMP表達抑制基底膜和細胞外基質的降解，進而抑制HepG2細胞的遷移和侵襲。

誘導細胞凋亡是多數(shù)抗腫瘤藥物發(fā)揮抗腫瘤效應的重要手段，細胞凋亡是多基因調控的細胞程序性死亡，線粒體通路、死亡受體通路和內質網(wǎng)通路是三條主要的介導細胞凋亡信號轉導通路［18-19］。Bcl-2家族是線粒體凋亡通路的主要調控因子，通過阻止線粒體細胞色素C的釋放發(fā)揮抗凋亡作用，Bax是一個關鍵的促凋亡蛋白，Bax活化后在線粒體膜中形成多聚體孔洞，釋放細胞色素C、Smac等凋亡相關因子，進入細胞質，激活下游Caspase家族蛋白，啟動細胞凋亡程序［20-22］。本研究結果顯示，GA作用HepG2細胞后，與對照組比較，GA組HepG2細胞抑凋亡蛋白Bcl-2表達顯著降低，促凋亡蛋白Bax和Cleaved caspase-3表達水平顯著升高，GA可能通過調控凋亡蛋白的表達促進HepG2細胞凋亡，凋亡率明顯升高。

綜上所述，GA在體外對HepG2細胞增殖、遷移和侵襲具有明顯的抑制作用，并促進其凋亡，其機制可能與調控細胞MMP-2、MMP-9及凋亡相關蛋白表達有關，具體如何調控，仍需更多的實驗證實。研究結果可為GA抗肝癌的應用提供理論基礎，但肝癌發(fā)生機制復雜，涉及多靶點、多通路，因此GA抗肝癌作用及其機制仍需進一步深入研究。

倫理學聲明：本研究方案于2023年9月11日經(jīng)由吉林省肝膽病醫(yī)院倫理委員會審批，批號：2023-科研倫理審查-004。

利益沖突聲明：本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明：王志茹負責課題設計，資料分析，撰寫論文；陳曦參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；趙文靜負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。

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收稿日期：2024-07-09；錄用日期：2024-09-19

本文編輯：王瑩引 證 本 文 ：WANG ZR， ZHAO WJ， CHEN X. Effect and mechanism of gallic acid on the proliferation， migration， invasion，and apoptosis of human hepatocellular carcinoma HepG2cells[J]. J Clin Hepatol， 2025， 41（3）： 493-498.

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