配位策略制備的類漆酶納米酶及其分析應(yīng)用

摘要 漆酶是一種多酚氧化酶，可以催化酚類、芳香胺類和兒茶酚胺類等化合物的氧化，在污染物降解和分析檢測領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。但是，天然漆酶制備成本高，其活性受環(huán)境因素的影響較大，易變性失活，影響了其實(shí)際應(yīng)用效果。納米酶是一類具有類天然酶活性的納米材料，具有易于制備、活性可調(diào)和穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)。目前，研究者已經(jīng)開發(fā)出多種納米酶。天然漆酶活性位點(diǎn)的Cu2+與氨基酸配位，受此啟發(fā)，研究者將配位合成策略即基于金屬離子和配體相互作用的策略用于類漆酶納米酶的制備。在已報(bào)道的采用配位策略制備的類漆酶納米酶中，金屬節(jié)點(diǎn)通常為銅、錳和鈰等，配體涉及多類化合物（包括核苷酸、氨基酸、多肽和芳香酸等），可通過調(diào)控金屬與配體的比例、配體的還原能力、緩沖溶液、氯離子和溴離子等因素實(shí)現(xiàn)對類漆酶納米酶催化活性的調(diào)節(jié)。本文分類綜述了采用配位策略合成的類漆酶納米酶及其在檢測酚類化合物、疾病標(biāo)志物、抗生素、農(nóng)藥、含硫污染物以及時(shí)間-溫度指示等領(lǐng)域的應(yīng)用，討論了當(dāng)前類漆酶納米酶研究中存在的問題，并展望了其未來的發(fā)展趨勢。

關(guān)鍵詞 漆酶；類漆酶納米酶；配位策略；分析應(yīng)用；評(píng)述

漆酶（Laccase， EC 1.10.3.2）是一種多酚氧化酶，其活性中心包含4 個(gè)Cu2+，這4 個(gè)Cu2+分為3 種類型：1 個(gè)Ⅰ型、1 個(gè)Ⅱ型和2 個(gè)Ⅲ型。Ⅰ型Cu2+呈順磁性，與組氨酸（His）和半胱氨酸（Cys）配位，負(fù)責(zé)底物的氧化和電子的捕獲。Ⅱ型Cu2+呈順磁性，Ⅲ型Cu2+呈反磁性，這兩種類型的Cu2+形成的三核銅簇共與8 個(gè)組氨酸配位，在該三核銅簇位點(diǎn)，分子氧被還原為水分子[1]。漆酶可以氧化幾乎所有的多酚類底物，在酚類物質(zhì)的檢測中廣泛應(yīng)用[2]。但是，天然漆酶存在一些天然酶固有的缺點(diǎn)，例如制備和純化成本高、穩(wěn)定性差和再循環(huán)率低等，阻礙了其廣泛應(yīng)用。

納米酶是一類具有類酶催化性質(zhì)的納米材料，因其具有可規(guī)?；苽?、形貌和組分可調(diào)以及穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn)，受到了研究者的青睞，近年來發(fā)展迅速[3-6]。目前已開發(fā)了多種納米酶，包括具有類過氧化物酶、類超氧化物歧化酶、類漆酶納米酶和類水解酶活性的納米酶等。按照組成分類，類漆酶納米酶主要包括金屬氧化物[7]、金屬硫化物[8]、鈣鈦礦氫氧化物[9]以及金屬離子與小分子配體配位形成的納米材料等。小分子配體種類繁多，為制備類漆酶納米酶提供了多樣化的選擇，因此基于金屬離子（銅、鈰、鐵和錳等）與小分子配體配位的類漆酶納米酶近幾年發(fā)展尤其迅速。目前，已經(jīng)發(fā)表了許多關(guān)于納米酶的綜述，但聚焦于類漆酶納米酶的綜述卻很少[1，10]。

本文分類介紹了近年來基于配位策略合成的類漆酶納米酶，綜述了其在檢測酚類化合物、疾病標(biāo)志物、抗生素、農(nóng)藥和含硫污染物等領(lǐng)域中的應(yīng)用，并討論了當(dāng)前類漆酶納米酶研究中存在的問題和未來的發(fā)展方向，以期為合成新型類漆酶納米酶及拓展類漆酶納米酶的分析應(yīng)用提供參考。

1 類漆酶納米酶的催化性能

類漆酶納米酶具有與天然漆酶類似的活性，可以催化多種化合物的氧化。腎上腺素（Epinephrine，Epi）與2，4-二氯苯酚（2，4-Dichlorophenol， 2，4-DP）常被用作底物用于研究類漆酶納米酶的活性（圖1）[11]。類漆酶納米酶催化2，4-DP 氧化產(chǎn)生的自由基與4-氨基安替比林（4-Aminoantipyrine， 4-AP）發(fā)生顯色反應(yīng)生成紅色染料，該染料在510 nm 處具有較強(qiáng)的吸收；類漆酶納米酶催化Epi 氧化生成紅色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在485 nm 處具有較強(qiáng)的吸收。米氏動(dòng)力學(xué)模型是天然酶學(xué)研究中最常用的動(dòng)力學(xué)模型，廣泛用于研究納米酶的催化活性。通過測定類漆酶納米酶催化底物2，4-DP 或Epi 的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，可獲得類漆酶納米酶的米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速度（vmax），這兩個(gè)參數(shù)數(shù)值的大小可用于評(píng)價(jià)類漆酶納米酶的催化性能。

2 采用配位策略制備的類漆酶納米酶

用于制備類漆酶納米酶的配位策略主要有：（1）通過金屬離子與小分子配體直接配位合成類漆酶納米酶；（2）構(gòu)建具有M-N（M 指金屬原子， N 指氮原子）活性中心的單原子類漆酶納米酶。根據(jù)所用配位策略的不同，以下對基于金屬配位的類漆酶納米酶分別進(jìn)行介紹。

2.1 金屬離子與小分子配體直接配位的類漆酶納米酶

基于金屬離子與小分子配體直接配位制備的類漆酶納米酶中，銅基的類漆酶納米酶最多，錳基和鈰基類漆酶納米酶也有報(bào)道，配體涉及多種小分子。首先，鳥嘌呤核苷酸（GMP）[11-12]、三磷酸腺苷（ATP）[13]和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）[14-15]等均被報(bào)道用于制備類漆酶納米酶。例如， Liang 等[11]首次在HEPES 溶液（一種非離子兩性緩沖劑）中，以GMP 為配體、Cu2+為金屬離子，通過簡單的溶液混合并離心，制備了由Cu2+和GMP 配位形成的納米無定形金屬有機(jī)骨架材料，該納米材料對2，4-DP 和Epi 兩種底物均展現(xiàn)出優(yōu)異的類漆酶活性。實(shí)驗(yàn)證明該類漆酶納米酶中的銅以Cu+和Cu2+兩種形式存在，且該納米酶的類漆酶活性源于Cu2+與N 的配位而非與磷酸基團(tuán)的配位。Tang 等[12]利用Mn2+與鳥苷酸進(jìn)行配位，通過一鍋法合成了具有類漆酶活性的納米片Mn-GMPNS，該類漆酶納米酶在熱穩(wěn)定性和耐酸堿性等方面均優(yōu)于天然漆酶。

其次，半胱氨酸（Cys）[16]、半胱氨酸-組氨酸（Cys-His）[17-19]、谷胱甘肽（GSH）[20]和苯丙氨酸（Phe）[21-22]也被用于制備類漆酶納米酶。例如， Yan 等[18]以Cys-His 為配體、Cu2+為金屬離子，采用溶劑熱法制備了類漆酶納米酶Cys-His-Cu，而改變配體為單個(gè)氨基酸（Cys或His）、二肽（Cys-Cys或His-His）以及三肽（His-His-Cys、Cys-His-Cys、Cys-Cys-His 和His-Cys-His）所合成的納米材料的類漆酶活性均低于Cys-His-Cu。Hu 等[23]選擇Phe 和His 兩種氨基酸，采用溶劑熱法制備了雙配體類漆酶納米酶Cu-Phe/His，其類漆酶活性高于使用單一配體Phe 制備的類漆酶納米酶Cu-Phe。Li 等[24]以His 為配體、Cu2+為金屬離子，并以葡萄糖為還原劑，制備了直徑超小的類漆酶納米酶Cu2O@His，采用同樣的方法以甘氨酸、酪氨酸、精氨酸和賴氨酸為配體的類漆酶對照組的類漆酶活性均低于Cu2O@His。

此外，其它許多小分子包括芳香羧酸[25-28]（圖2A～2D）、雜環(huán)小分子包括咪唑[29]、2-甲基咪唑（圖2E）[30]、4-4′-聯(lián)吡啶（圖2F）[31]、三聚氰胺[32]、2-氨基-1，3，4-噻二唑[33]（圖2G）、4-吡唑醇羧酸[34]（圖2H）、煙酸（圖2I）[35]和三聚氰酸[36]中因具有羧基、氨基和巰基等基團(tuán)，也被用于制備類漆酶納米酶。不同配體制備的類漆酶納米酶表現(xiàn)出不同的特點(diǎn)。例如，以2-氨基對苯二甲酸[27]為配體制備的銅基類漆酶納米酶不僅具有類漆酶活性，同時(shí)兼具配體的發(fā)光性質(zhì)；以2-氨基-1，3，4-噻二唑[33]為配體制備的銅基類漆酶納米酶中Cu+的含量高達(dá)84.5%，是已經(jīng)報(bào)道的銅基類漆酶納米酶中Cu+含量最高的；Li 等[37]以組氨酸和氨基對苯二甲酸兩種小分子為配體，制備的雙配體銅基納米材料不僅具有良好的類漆酶活性，也具有良好的熒光性質(zhì)。Liang等[38]合成了以對苯二甲酸和均苯三甲酸為配體的鈰基類漆酶納米酶，并推測該納米酶的活性來源于金屬有機(jī)骨架中六核Ce團(tuán)簇中Ce3+/Ce4+的內(nèi)在氧化還原反應(yīng)性。

表1 歸納了上述以不同小分子為配體制備的類漆酶納米酶的形貌特征及其酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)。除以苯丙氨酸為配體的類漆酶納米酶[21-22]外，其它類漆酶納米酶的米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速度（vmax）與天然漆酶相比均處于同一數(shù)量級(jí)，表明這些類漆酶納米酶均具有與天然漆酶相當(dāng)?shù)拇呋钚浴akam 等[21]指出雖然以Km 值和vmax 值作為比較參數(shù)時(shí)，天然漆酶的催化活性優(yōu)于合成的具有超薄二維層狀的類漆酶納米酶Cu-Phe，但若以催化效率（kcat/Km）為評(píng)價(jià)參數(shù)， Cu-Phe 的催化效率（kcat/Km=62.65 mmol/（L·s））比天然漆酶的催化效率（kcat/Km=0.03 mmol/（L·s））高4 個(gè)數(shù)量級(jí)。此外，不同文獻(xiàn)中天然漆酶的Km 和vmax 值存在明顯差異，這可能與漆酶的來源、供應(yīng)商以及實(shí)驗(yàn)操作等因素不同有關(guān)。

2.2 單原子類漆酶納米酶

單原子納米酶憑借其超高的原子利用率和優(yōu)異的催化性質(zhì)成為納米酶研究的的前沿領(lǐng)域。已報(bào)道的單原子類漆酶納米酶中錨定金屬原子的基質(zhì)通常為氮摻雜碳材料（N/C），金屬與氮配位的位點(diǎn)（M-N）通常是其類酶催化活性中心。熱解金屬與配體配位形成的前驅(qū)體是制備N/C 錨定單原子納米酶的主要方法之一[39-42]。例如， Li 等[39]通過熱解Cu2+、Zn2+與2-甲基咪唑配位形成的前驅(qū)體制備了單原子類漆酶納米酶CuZn-N/C; Lin 等[40]通過熱解Fe2+、Zn2+與2-甲基咪唑配位形成的前驅(qū)體制備了單原子類漆酶納米酶Fe1@CN-20；Zhu 等[41]通過熱解Co2+與聚乙烯吡咯烷酮（PVP）配位形成的前驅(qū)體制備了單原子納米酶Co/CoOx-N/C；Guan 等[42]通過熱解Rh3+、Zn2+與2-甲基咪唑配位形成的前驅(qū)體制備了單原子納米酶Rh-N/C，該納米酶具有多種類酶活性，其中類漆酶和類氧化酶的活性最佳。

3 影響類漆酶納米酶活性的因素

除溫度和pH 值外，配位策略制備的類漆酶納米酶的催化活性會(huì)受到金屬與配體比例、緩沖溶液的種類、氯離子和溴離子濃度以及其它金屬摻雜等多種因素的影響。Cu2+與Cys 比例為5∶1 時(shí)，類漆酶納米酶Cu-Cys 的類漆酶催化活性最強(qiáng)[16]；Cu2+與GSH 的比例為2∶1 時(shí)，類漆酶納米酶Cu-GSH 表現(xiàn)出最佳類漆酶活性[20]；Cu2+與三聚氰酸（CA）的原料比為1∶2 時(shí)，類漆酶納米酶Cu-CA 類漆酶催化活性最強(qiáng)[36]。類漆酶納米酶Cu-Cys 在MES 緩沖溶液中其類漆酶活性最高[16]；Cu-腺嘌呤類漆酶納米酶在Tris-HAc緩沖液中表現(xiàn)出優(yōu)異的類漆酶活性，而在MES 緩沖液中活性顯著降低，在HEPES 緩沖液中則進(jìn)一步降低[43]。研究發(fā)現(xiàn)，在類漆酶納米酶催化的顯色體系中添加合適濃度的Cl– 時(shí)，類漆酶納米酶的催化活性會(huì)顯著增加[15，17，29]， Yan 等[18]研究指出Br– 對類漆酶納米酶的催化性能的提高要強(qiáng)于Cl–。Huang 等[44]發(fā)現(xiàn)硫化物的引入能使Cu-GMP 的類漆酶催化活性顯著提高約3.5 倍，這種類漆酶活性增強(qiáng)的機(jī)制涉及Cu2+的還原反應(yīng)和Cu—S 鍵的形成。Xu 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在Cu 與ATP 配位合成的納米酶中摻雜Fe3+會(huì)使其具有類過氧化氫酶活性，但是類漆酶活性降低，在此基礎(chǔ)上繼續(xù)引入Mn2+可以在保持類過氧化氫酶活性的同時(shí)，顯著增強(qiáng)類漆酶活性。

4 類漆酶納米酶的分析應(yīng)用

基于類漆酶納米酶的分析檢測方法已被用于多種目標(biāo)物包括酚類化合物（包括酚類污染物和茶多酚）、疾病標(biāo)志物、含硫污染物、抗生素和農(nóng)藥等的檢測及時(shí)間-溫度指示應(yīng)用，從原理上大致可以分為以下兩類：第一類是待測目標(biāo)物具有酚羥基官能團(tuán)，能直接在類漆酶納米酶的催化下發(fā)生顯色反應(yīng)，其顏色深淺與分析物濃度有關(guān)，這一原理被用于酚類化合物以及兒茶酚胺的檢測；第二類是待測目標(biāo)物對類漆酶納米酶催化活性具有抑制或增強(qiáng)作用，即該類目標(biāo)物影響類漆酶納米酶催化的顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色的變淺或加深程度，對待測目標(biāo)物進(jìn)行定量檢測，這一原理被用于含硫污染物、抗生素以及農(nóng)藥等的檢測。此外，類漆酶納米酶還經(jīng)常用于構(gòu)建陣列傳感器[27-28，43，45-47]，結(jié)合數(shù)學(xué)判別模型，以實(shí)現(xiàn)對多種類似待測目標(biāo)物的區(qū)分。根據(jù)待測目標(biāo)物的不同，本節(jié)對類漆酶納米酶在分析檢測中的應(yīng)用進(jìn)行分類介紹。

4.1 酚類化合物的檢測

類漆酶納米酶可以催化一些酚類化合物與4-AP 發(fā)生顯色反應(yīng)，基于該原理， Lin 等[40]利用合成的類漆酶納米酶Fe1@CN-20 建立了檢測不同酚類污染物包括苯酚、4-氯苯酚、2，4-DP、2，6-二甲氧基苯酚和鄰苯二酚等的方法，且這幾種酚類化合物的檢出限均低于3.5 μmol/L。為了進(jìn)一步鑒別不同種類的酚類污染物，研究者開發(fā)了基于類漆酶納米酶的傳感陣列。Tian 等[43]利用Cu2+與腺嘌呤配位的類漆酶納米酶在3 種不同緩沖溶液中對酚類化合物與4-AP 反應(yīng)催化活性的不同，構(gòu)建了3 通道比色陣列，并將其用于鑒別6 種具有代表性的酚（包括2，4-DP、鄰氯酚（o-CP）、間氯酚（m-CP）、對氯酚（p-CP）、苯酚和鄰苯二酚）。用數(shù)據(jù)降維方法線性判別分析處理該陣列獲得的信號(hào)，結(jié)果顯示，該陣列可在10～1000 μmol/L的較寬濃度范圍內(nèi)有效區(qū)分6 種酚類化合物。

Yang 等[48]利用類漆酶納米酶Cu-GMP 催化不同茶多酚與4-AP 反應(yīng)的吸收光譜的變化，結(jié)合遺傳算法篩選了特征光譜，構(gòu)建了一個(gè)包含15 通道（5 個(gè)波長×3 個(gè)時(shí)間點(diǎn)）的傳感器陣列。使用支持向量機(jī)判別模型處理所得數(shù)據(jù)，該傳感陣列對綠茶中不同濃度茶多酚的判別率達(dá)到100%，檢出限為5 μmol/L。此外，該陣列對8 種綠茶的分類準(zhǔn)確率為96.88%，對不同摻假比例碧螺春的識(shí)別準(zhǔn)確率為100%，為綠茶品牌和摻假的快速鑒別提供了一種高效、可靠的技術(shù)手段。

4.2 疾病相關(guān)標(biāo)志物的檢測

Epi、去甲腎上腺素（NE）和多巴胺（DA）是人體中3 種重要的兒茶酚胺類物質(zhì)，它們在健康人體內(nèi)的含量水平是相對恒定的，在某些病理?xiàng)l件下，體內(nèi)這幾種兒茶酚胺的含量水平會(huì)發(fā)生變化，因此準(zhǔn)確檢測兒茶酚胺類物質(zhì)的含量有助于健康監(jiān)測和臨床診斷。嗜鉻細(xì)胞瘤（PCC）是一種起源于腎上腺髓質(zhì)的腫瘤，其顯著特點(diǎn)是Epi 和NE 含量升高，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的多種退行性疾病與DA 含量密切相關(guān)。類漆酶納米酶能夠催化Epi 和DA 氧化并生成有色產(chǎn)物，基于此，許多類漆酶納米酶被應(yīng)用于Epi 的比色檢測[11-12，17，21，24-25，40-42，49-50]及DA 的檢測[22]。如圖3A 所示， Tang 等[12]基于類漆酶納米酶Mn-GMPNS 對Epi的氧化顯色，結(jié)合智能手機(jī)拍照并提取顏色通道中的R 值和G 值，構(gòu)建了檢測Epi 的方法，檢出限為0.87 μg/mL。Kulandaivel 等[34]報(bào)道了一種可以對同時(shí)含有Epi 和NE 樣品中的Epi 和NE 進(jìn)行連續(xù)檢測的方法（圖3B）。該方法的具體原理為：類漆酶納米酶Cu-Cp 催化Epi 氧化生成在485 nm 處具有較強(qiáng)吸收的紅色產(chǎn)物， 485 nm 處的吸光度值與體系中的Epi 含量相關(guān)，由此實(shí)現(xiàn)了對樣品中Epi 的檢測，檢出限為0.36 μmol/L；然后調(diào)節(jié)體系pH 為堿性，堿性條件下NE 與加入的PEI 可生成熒光聚合物，基于此，實(shí)現(xiàn)了對NE 的熒光傳感，檢出限為0.068 μmol/L。

神經(jīng)遞質(zhì)水平的失調(diào)會(huì)導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生，而乙酰膽堿酯酶（AChE）對維持神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的水平至關(guān)重要。AChE 可催化巰基乙酰膽堿水解產(chǎn)生巰基膽堿，巰基膽堿可以抑制類漆酶納米酶的催化活性，基于此， Guan 等[42]建立了基于類漆酶納米酶Rh-N/C 的AChE 活性的檢測方法（圖3C），該方法的線性檢測范圍為0.001～1.0 mU/mL，檢出限為3.2×10–4 mU/mL。

程序性死亡配體1（PD-L1）是腫瘤早期診斷和預(yù)后的標(biāo)志物。Hu 等[23]在類漆酶納米酶（Cu-F/Hs）表面修飾PD-L1 抗體（PD-L1 Ab），在電極表面修飾PD-L1 的核酸適配體（PD-L1 Apt），當(dāng)待測體系中存在PD-L1 時(shí)， PD-L1 與PD-L1 Apt 和抗體修飾的類漆酶納米酶結(jié)合，形成三明治結(jié)構(gòu)，電極附近的類漆酶納米酶濃度增大，其催化產(chǎn)生的電活性物質(zhì)聚多巴胺（PDA）濃度也增大，據(jù)此可實(shí)現(xiàn)對PD-L1 的靈敏檢測（圖3D）。該方法的線性檢測范圍為0.5～200 ng/mL，檢出限為0.11 ng/mL。

4.3 含硫污染物的檢測

含硫污染物包括SO2、無機(jī)硫化物以及一些有機(jī)小分子（例如二硫化四甲基秋蘭姆和巰基苯并噻唑等），在食品及環(huán)境中廣泛存在，檢測含硫污染物對于加強(qiáng)環(huán)境監(jiān)測和保證食品安全具有重要的意義。Huang 等[44]發(fā)現(xiàn)當(dāng)S2– 存在時(shí)，可顯著增強(qiáng)Cu-GMP 的類漆酶活性，使Cu-GMP 催化的2，4-DP 和4-AP 的反應(yīng)體系在510 nm 處的吸光度顯著上升，基于此發(fā)展了一種檢測硫化物的比色方法（圖4A），檢測體系在510 nm 處的吸光度與S2– 濃度在0～220 μmol/L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，可定量檢測食品中的硫化物濃度，檢出限為0.67 μmol/L。Liang 等[38]利用巰基苯并噻唑?qū)︻惼崦讣{米酶Ce-UiO-66 和Ce-MOF-80 催化3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（TMB）顯色反應(yīng)的抑制（圖4B），成功實(shí)現(xiàn)了對巰基苯并噻唑的檢測，檢出限分別為5.34 和4.26 μmol/L。

4.4 抗生素的檢測

抗生素是一類能夠抑制或殺死細(xì)菌的化合物，被廣泛用于臨床治療細(xì)菌感染類疾病以及用于畜禽類和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)，但其濫用和不合理使用會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的耐藥性以及抗生素的過度排放，危害人體健康和生態(tài)環(huán)境?？敲顾兀↘an）是一種含羥基和氨基的糖苷類抗生素， Li 等[37]研究發(fā)現(xiàn)， Kan 可增強(qiáng)制備的熒光類漆酶納米酶（Cu-BH）的催化活性，基于此建立了一種檢測Kan 的比色/熒光雙模檢測方法，兩種模式對應(yīng)的檢出限分別為0.26 和0.033 nmol/L。該方法的原理如圖5A 所示，制備的銅基雙配體類漆酶納米酶Cu-BH 是一種熒光納米酶，最大發(fā)射波長在440 nm 處；Cu-BH 可以催化鄰苯二胺（OPD）氧化生成黃色產(chǎn)物二氨基酚（DAP），該產(chǎn)物在566 nm 處有最大發(fā)射，且在440 nm 處有較強(qiáng)吸收，會(huì)淬滅Cu-BH 在440 nm 處的藍(lán)色熒光；當(dāng)體系中存在Kan時(shí)， Cu-BH的類漆酶催化活性增強(qiáng)，即催化生成的DAP增多，體系黃色加深， 566 nm處的熒光（F566）增強(qiáng)而440 nm處的熒光（F440）減弱，比率熒光信號(hào)（F566/F440）進(jìn)一步增大。四環(huán)素類抗生素（TCs）是一類含酚羥基的抗生素。Li 等[24]發(fā)現(xiàn)將TCs 加入類漆酶納米酶Cu2O@His催化的2，4-DP 與4-AP 的顯色反應(yīng)體系后，由于TCs 和2，4-DP 均可被Cu2O@His 催化氧化即TCs 與2，4-DP 存在競爭關(guān)系，會(huì)使反應(yīng)體系在510 nm 處的吸光度下降，且在不同pH 下的下降程度也不同，基于此，Li 等[24]構(gòu)建了用于識(shí)別TCs 的陣列，并結(jié)合數(shù)據(jù)處理方法主成分分析（PCA），實(shí)現(xiàn)了4 種TCs（即四環(huán)素（TC）、金霉素（CTC）、土霉素（OTC）以及多西環(huán)素（DOX））在1～60 μmol/L濃度范圍內(nèi)的區(qū)分（圖5B）。

4.5 農(nóng)藥的檢測

農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常被用于病蟲害的防治，但過量或者不合理使用會(huì)導(dǎo)致農(nóng)藥在環(huán)境和農(nóng)作物中殘留，危害食品安全及環(huán)境安全[18，27，46，51，52]。目前，類漆酶納米酶已被用于多種農(nóng)藥的檢測。

Yan 等[18]建立了基于類漆酶納米酶檢測有機(jī)磷農(nóng)藥及評(píng)價(jià)有機(jī)磷解毒劑的方法。該方法的原理為：巰基膽堿的存在會(huì)抑制類漆酶納米酶催化的顯色反應(yīng)，而巰基膽堿可由AChE 催化水解乙酰巰基膽堿產(chǎn)生；有機(jī)磷農(nóng)藥（OPs）對AChE 具有很強(qiáng)的親和力，可以與AChE 形成磷酸化酶加合物從而抑制AChE 催化產(chǎn)生巰基膽堿的反應(yīng)，即有機(jī)磷農(nóng)藥的存在有利于類漆酶納米酶催化的顯色反應(yīng)；而有機(jī)磷農(nóng)藥的解毒劑碘解磷定（PAM）可以與有機(jī)磷農(nóng)藥反應(yīng)從而消除有機(jī)磷農(nóng)藥對AChE 活性的影響，即當(dāng)有機(jī)磷解毒劑PAM 存在時(shí)，由AChE 催化產(chǎn)生的巰基膽堿含量增加，類漆酶納米酶催化的顯色反應(yīng)被抑制（圖6A）。該方法在對氧磷濃度為0～0.25 μg/mL 范圍內(nèi)檢測效果良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 1.2 mmol/L 的PAM 在10 min 內(nèi)可以使對氧磷抑制的AChE 活性恢復(fù)到初始活性的90%。Song 等[46]將4 種具有類漆酶活性的銅基納米酶用于構(gòu)建4 通道的比色陣列，用于OPs 的鑒別（圖6B）。結(jié)果表明，該陣列可檢測0.1～20 μg/mL 的水胺硫磷和0.1～10 μg/mL 的草銨膦，且對OPs 的鑒別不受非氨基甲酸酯農(nóng)藥（CPs）或其它潛在干擾物的影響。該研究還結(jié)合智能手機(jī)的成像功能，構(gòu)建了用于檢測水果和蔬菜中的OPs 的便攜裝置，該方法相比基于AChE 的方法抗干擾性更強(qiáng)。

此外， Song 等[51]基于農(nóng)藥對Cu-Asp 的類漆酶、類過氧化物酶和類超氧化物歧化酶活性的直接影響，構(gòu)建了3 通道的比色傳感陣列，并成功用于草甘膦、亞磷酸鹽、異碳磷、西維因和五氯硝基苯等8 種農(nóng)藥的鑒別，且在復(fù)雜未知樣品中鑒別的準(zhǔn)確度為100%。

4.6 時(shí)間-溫度指示器

時(shí)間-溫度指示器（Time-temperature indicator， TTI）是一種能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測產(chǎn)品熱變化的裝置，在多個(gè)領(lǐng)域特別是在食品安全和藥品保鮮等方面具有重要意義，其基本原理是通過監(jiān)測受時(shí)間和溫度影響的反應(yīng)來反映產(chǎn)品的熱變化。類漆酶納米酶可催化愈創(chuàng)木酚氧化并顯棕色，顏色深淺與時(shí)間、溫度相關(guān)，且該反應(yīng)需要氧氣參與，基于此， Hu 等[53]設(shè)計(jì)了一種基于類漆酶納米酶的時(shí)間-溫度指示器（圖7）。通過擠壓可使包覆氧氣的氣囊破裂，釋放氧氣，觸發(fā)愈創(chuàng)木酚氧化顯色反應(yīng)。這種設(shè)計(jì)使用戶能夠自主選擇激活時(shí)機(jī)，提高TTI 的靈活性和實(shí)用性。

5 結(jié)論與展望

本文對基于配位策略制備的類漆酶納米酶近年來在分析檢測中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行了綜述。類漆酶納米酶在分析檢測領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，但其相關(guān)研究仍然存在一系列問題亟待解決。（1）非銅基類漆酶納米酶的研究較少，其催化機(jī)理尚不明確；（2）配位策略制備的類漆酶納米酶中的配體選擇主要依靠嘗試，其選擇規(guī)律并未闡明；（3）單原子類漆酶納米酶的結(jié)構(gòu)調(diào)控仍有很多問題需要解決，其負(fù)載基質(zhì)、配位微環(huán)境和負(fù)載密度等的調(diào)控還需進(jìn)一步探索；（4）在比較漆酶活性的實(shí)驗(yàn)中存在差異性的問題，由于不同實(shí)驗(yàn)室使用的漆酶來源、濃度各異，以及催化底物選擇的不同，使得各研究得出的漆酶活性結(jié)果難以直接比較，因此，漆酶活性的標(biāo)準(zhǔn)化測試方法亟待統(tǒng)一。此外，類漆酶納米酶在分析檢測中展現(xiàn)出可替代天然酶的潛力，但其與機(jī)器學(xué)習(xí)的深度融合仍處于早期階段，機(jī)器學(xué)習(xí)在基于類漆酶納米酶的分析檢測信號(hào)優(yōu)化以及新應(yīng)用場景方面的研究仍需進(jìn)一步深入。

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