測試片法在乳制品金黃色葡萄球菌快速檢測中的應(yīng)用研究

摘 要：本研究為探索金黃色葡萄球菌測試片定性檢測乳制品中金黃色葡萄球菌的可行性，依據(jù)國際標準ISO 16140-2：2016，以《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）第一法為參比方法，對測試片法的包容性和排他性、靈敏度和一致性進行驗證。結(jié)果表明，各參數(shù)指標均滿足ISO 16140-2：2016中對于定性方法驗證指標的要求。金黃色葡萄球菌測試片法的檢測效果與GB 4789.10—2016第一法的標準方法相當(dāng)，可作為替代方法，用于定性檢測乳制品中的金黃色葡萄球菌。

關(guān)鍵詞：測試片；金黃色葡萄球菌；乳制品

Application of the Count Plate Method in the Detection of Staphylococcus aureus of Dairy Products

DONG Bin

（Beijing Guangming Jianeng Dairy Co.， Ltd.， Beijing 101300， China）

Abstract： In this study， in order to explore the feasibility of Staphylococcus aureus count plate for qualitative detection of Staphylococcus aureus in dairy products， according to the international standard ISO 16140-2：2016， the first method of GB 4789.10—2016 was used as the reference method， and the inclusiveness， exclusivity， sensitivity and consistency indexes with the reference method were verified. The results show that all parameters meet the requirements of ISO 16140-2：2016 for qualitative method validation. In summary， the detection effect of Staphylococcus aureus count plate method is comparable to the standard method of GB 4789.10—2016， and can be used as an alternative method for qualitative detection of Staphylococcus aureus in dairy products.

Keywords： count plates; Staphylococcus aureus; dairy product

金黃色葡萄球菌是乳制品質(zhì)量安全的主要風(fēng)險因子之一。近年來，國內(nèi)外多次發(fā)生由金黃色葡萄球菌污染引發(fā)的乳制品食品安全事件[1]。乳制品在加工、包裝、運輸及儲藏等環(huán)節(jié)均有被金黃色葡萄球菌污染的可能[2]，如果該菌株攜帶有毒力基因，在適宜的條件下菌體會大量繁殖，同時產(chǎn)生金黃色葡萄球菌腸毒素，進而造成食物中毒。我國《食品安全國家標準 預(yù)包裝食品中致病菌限量》（GB 29921—2021）[3]對于巴氏殺菌乳、調(diào)制乳、發(fā)酵乳、加糖煉乳（甜煉乳）和調(diào)制加糖煉乳要求采用比較嚴格的二級采樣方案，金黃色葡萄球菌的限量為n=5，c=2，m=0/25 g（mL）。檢驗方法按照《食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）第一法[4]金黃色葡萄球菌定性檢驗執(zhí)行。

GB 4789.10—2016第一法雖然是“金標準”方法，但檢測周期長，一般為3～4 d，BP平板和血平板菌落形態(tài)的識別與判讀相對復(fù)雜，還容易受樣品基質(zhì)、培養(yǎng)基以及檢測條件的影響，無法滿足乳制品加工企業(yè)在實際工作中對“快速、易操作”的需求。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展和國際標準化的合作，越來越多的微生物檢驗方法標準中引入了測試片法。MicroFast?金黃色葡萄球菌測試片法（以下簡稱“測試片法”）是用一種預(yù)先制備的含有指示劑及冷水可溶性凝膠的培養(yǎng)基系統(tǒng)進行微生物培養(yǎng)的方法。培養(yǎng)基中含有金黃色葡萄球菌生長的主要營養(yǎng)物質(zhì)和功能性物質(zhì)。金黃色葡萄球菌在生長代謝過程中產(chǎn)生的酶與測試片中的顯色底物發(fā)生反應(yīng)，釋放顯色基團，累積后信號放大，在可見光下顯示紫色菌落。

測試片法以其良好的靈敏度、特異性、排他性等技術(shù)優(yōu)勢在各乳制品生產(chǎn)企業(yè)廣泛應(yīng)用。測試片法與GB 4789.10—2016第一法相比，在檢測時間上僅需48 h，而GB 4789.10—2016第一法最少需要77 h左右。測試片法可以幫助企業(yè)提高檢測效率、縮短檢測時間、加快產(chǎn)品放行，同時操作更為簡便、更加節(jié)省空間，從而減少了實驗誤差，并降低了能耗。

本研究擬采用MicroFast?金黃色葡萄球菌測試片，以GB 4789.10—2016第一法[4]為參考方法，參考國際標準ISO 16140-2：2016[5]的性能指標驗證要求，對測試片法進行包容性、排他性、靈敏度和相對檢出限等進行驗證。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

選擇30株金黃色葡萄球菌目標菌和30株金黃色葡萄球菌非目標菌，菌株來自ATCC、CICC、CMCC、CDMCC以及實驗室保存的分離株。

1.2 設(shè)備和試劑

MicroFast?金黃色葡萄球菌測試片（型號：LR1305，批號：20240309），美正公司；磷酸鹽緩沖液（批號：240408）、7.5%氯化鈉肉湯（批號：231118）、血瓊脂平板（批號：240330）、腦心浸出液肉湯（BHI）（批號：220107）和凍干血漿（批號：240109），北京陸橋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；Baird-Parker瓊脂平板（批號：240415），無錫市賽微生物技術(shù)有限公司；勻質(zhì)器（型號：Interscience 400cc），法國Interscience公司；恒溫培養(yǎng)箱（型號：BSP-400），上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；天平（型號：ME2002/02），梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司；移液器（型號：100～1 000 μL），艾本德公司；生物安全柜（型號：Thermo-1389），賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 參考方法

參考《食品安全國家標準 微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）第一法。

1.3.2 研究方法

參照GB 4789.10—2016，無菌稱取樣品25 g（mL）加入盛有225 mL 7.5%氯化鈉肉湯的無菌均質(zhì)杯或均質(zhì)袋內(nèi)，均質(zhì)后（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h。將增菌后的培養(yǎng)物，劃線接種到測試片上，（36±1）℃培養(yǎng)18～24 h。培養(yǎng)后，金黃色葡萄球菌菌落顯紫色或粉色，非金黃色葡萄球菌菌落會呈現(xiàn)藍色、灰色或白色。

1.3.3 菌懸液制備

從-80 ℃冰箱中取出保存的菌株，融化后使用無菌接種環(huán)將各菌株劃線接種于NA瓊脂平板中，在其最適宜的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)18～24 h。用無菌接種環(huán)挑取單菌落，接種于BHI液體培養(yǎng)基，恒溫搖床（36±1）℃，160 r·min-1，振搖培養(yǎng)18 h。用無菌PBS進行梯度稀釋，用菌落總數(shù)測試片進行菌落計數(shù)。

1.3.4 包容性和排他性研究

選擇表1中30株金黃色葡萄球菌目標菌和30株非目標菌，按照1.3.3制備成菌懸液，按照1.3.2的方法進行檢測，記錄其檢測結(jié)果，以驗證其特異性。

1.3.5 靈敏度研究

（1）菌懸液制備。按照1.3.3制備成適宜的金黃色葡萄球菌菌液。

（2）人工污染樣本制備及樣品前處理。選取巴氏殺菌乳、濃縮乳制品（馬蘇里拉奶酪）、乳粉3種類型的乳制品，每類稱取20份樣品，每份樣品稱取25 g，接種0.1 mL適宜濃度的金黃色葡萄球菌菌液，制備成3個不同濃度水平的接種樣品，不同水平的接種濃度和數(shù)量見表1（因樣品中自然含有背景菌，不再另外接種其他非目標菌）。陰性樣品接種0.1 mL的無菌生理鹽水。接種后的每份樣品中加入225 mL 7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min。

（3）檢驗。將1.3.5（1）制備好的人工污染樣本置于（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h。培養(yǎng)后，按照GB 4789.10—2016第一法和測試片法進行分離鑒定。對于GB 4789.10—2016第一法，選擇性平板上出現(xiàn)的典型菌落，按照國家標準要求進行革蘭氏染色鏡檢和血漿凝固酶試驗，然后按照國家標準要求進行結(jié)果判定。測試片法按照1.3.2進行結(jié)果判定。

1.3.6 相對檢出限研究

（1）菌懸液制備。按照1.3.3制備成適宜的金黃色葡萄球菌菌液。

（2）制備人工污染樣品及樣品前處理。稱取30份UHT滅菌乳，每份樣品量為25 g。接種0.1 mL適宜濃度的金黃色葡萄球菌菌液，制備成3個不同濃度水平的接種樣品。不同水平的接種濃度和數(shù)量見表2。陰性樣品接種0.1 mL的無菌生理鹽水。接種后的每份樣品中加入225 mL 7.5%氯化鈉肉湯培養(yǎng)基，用拍擊式均質(zhì)器拍打1～2 min。

（3）檢驗。將1.3.6（1）制備好的人工污染樣本置于（36±1）℃培養(yǎng)（24±2）h。培養(yǎng)后，按照GB 4789.10—2016第一法和測試片法進行分離鑒定。對于GB 4789.10—2016第一法 選擇性平板上出現(xiàn)的典型菌落，按照國家標準要求進行革蘭氏染色鏡檢和血漿凝固酶試驗，然后按照國標要求進行結(jié)果判定。測試片法按照1.3.2進行結(jié)果判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 包容性和排他性研究結(jié)果

30株目標菌在測試片上均長出典型的紫色菌落，30株非目標菌中3株長出非典型的藍色或藍紫色菌落，其他23株在測試片上未觀察到菌落生長，檢測結(jié)果見表3和表4。根據(jù)試驗結(jié)果可以看出，MicroFast?金黃色葡萄球菌測試片的包容性和排他性良好。

2.2 靈敏度研究結(jié)果

對參考方法和測試片方法的檢測結(jié)果進行統(tǒng)計，見表5。MicroFast?金黃色葡萄球菌測試片與GB 4789.10—2016參考方法測試結(jié)果一致性的匯總數(shù)據(jù)為PA=36，PD=1，ND=0，NA=24。按照ISO 16140-2：2016中相關(guān)指標的計算公式，各性能指標計算結(jié)果見表6，滿足ISO 16140-2：2016中|ND-PD|不高于3，|ND+PD|不高于6的限值要求。

2.3 相對檢出限研究結(jié)果

本研究采用3種不同濃度水平的人為污染樣本進行重復(fù)測試，陰性水平5個樣本，低水平即部分檢出水平20個樣本，高水平5個樣本。檢出情況匯總見表7。利用ISO 16140-2：2016提供的Excel表計算相對檢出限（Relative Limit of Detection，RLOD）為1.000，滿足ISO 16140-2：2016中對于RLOD值不高于1.5的要求。

3 結(jié)論

本文對乳制品中金黃色葡萄球菌測試片法的應(yīng)用進行比對研究，針對研究的方法，驗證過程選擇參照ISO 16140-2：2016驗證規(guī)則對方法進行充分驗證。結(jié)果表明，該方法的特異性為100%，相對檢出限為1.000，與GB 4789.10—2016方法具有很好的一致性。測試片方法操作和結(jié)果判定比較簡便，已經(jīng)在多家乳制品企業(yè)中進行應(yīng)用，不僅為企業(yè)內(nèi)部節(jié)省了各項成本，創(chuàng)造了經(jīng)濟效益，還為乳制品行業(yè)微生物快速篩查提供了新的選擇，整體提高了乳制品致病菌檢測技術(shù)能力。

參考文獻

[1]SCHLECHT L M，PETERS B M，KROM B P，et al.Systemic Staphylococcus aureus infection mediated by Candida albicans hyphal invasion of mucosal tissue[J].Microbiology，2015，161（1）：168-181.

[2]HENNEKINNE J A，BUYSER M L D，DRAGACCI S.Staphylococcus aureus and its food poisoning toxins：characterization and outbreak investigation[J].FEMS Microbiology Reviews，2012，36（4）：815-836.

[3]中華人民共和國國家衛(wèi)生健康委員會，國家市場監(jiān)督管理總局.食品安全國家標準 預(yù)包裝食品中致病菌限量：GB 29921—2021[S].北京：中國標準出版社，2021.

[4]中華人民共和國國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗：GB 4789.10—2016[S].北京：中國標準出版社，2016.

[5]International Organization for Standardization.Microbiology of the food chain–method validation–part 2： protocol for the validation of alternative（proprietary） methods against a reference method：ISO 16140-2：2016[S/OL].（2016-06-01）[2025-01-15].https：//www.iso.org/standard/54870.html.

作者簡介：董彬（1979—），男，吉林白城人，本科，工程師。研究方向：乳制品安全體系建設(shè)、精益生產(chǎn)。