海濱貓尾木葉綠體基因組特征及編碼基因psbB對冷脅迫的響應(yīng)

摘 要： "低溫是瀕危紅樹植物海濱貓尾木（Dolichandrone spathacea）生態(tài)修復(fù)的重要障礙，植物葉綠體及其編碼的基因密切響應(yīng)冷脅迫，解析葉綠體基因組特征及冷脅迫下編碼基因psbB的分子響應(yīng)規(guī)律有助于該物種的保護與修復(fù)。為揭示葉綠體基因組信息，該研究通過Illumina NovaSeq測序平臺對海濱貓尾木總DNA進行測序、組裝、注釋和功能分析，以及為探究冷脅迫下psbB基因的變化規(guī)律，并且檢測了海濱貓尾木幼苗在不同溫度處理下的總?cè)~綠素、丙二醛、脯氨酸、總酚、可溶性蛋白和可溶性糖等生理參數(shù)，同時利用熒光定量PCR實驗檢測了相應(yīng)處理下葉片psbB基因的表達水平。結(jié)果表明：（1）海濱貓尾木葉綠體具有典型四分體結(jié)構(gòu)，基因組大小為159 139 bp，GC含量為37.9%，編碼133個基因。其中，包括蛋白質(zhì)編碼基因（88個），tRNA基因（37個）和rRNA基因（8個）。（2）在系統(tǒng)發(fā)育分析中，海濱貓尾木未能形成單系，同其他8種紫葳科植物聚為一束，支持率達100%。（3）冷脅迫下，海濱貓尾木幼苗葉片總?cè)~綠素含量隨著處理溫度的降低呈下降趨勢，而總酚、丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的含量以及葉綠體編碼基因psbB的相對表達量均隨著處理溫度的降低呈上升趨勢。綜上認為，海濱貓尾木葉綠體基因組特征與其他紫葳科植物高度保守。在冷脅迫下，該植物總?cè)~綠素合成受到抑制，滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成受到影響，同時編碼基因psbB參與了植物冷脅迫下的分子調(diào)控。以上結(jié)果為提升瀕危紅樹植物抗冷能力分子輔助育種提供了前期基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 海濱貓尾木， 葉綠體基因組， 系統(tǒng)發(fā)育分析， 冷脅迫， 生理指標， psbB基因

中圖分類號： "Q943

文獻標識碼： "A

文章編號： "1000-3142（2025）01-0058-11

基金項目： "海南省重點研發(fā)計劃項目（ZDYF2021SHFZ259）； 湛江市科技計劃項目（2022A05013）； 海南省院士創(chuàng)新平臺科研專項（YSPTZX2022011）。

第一作者： 廖曉童（2002—），研究方向為瀕危紅樹植物種質(zhì)資源保護，（E-mail） 769426376@qq.com。

*通信作者： "張穎，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，從事瀕危紅樹植物種質(zhì)資源保護，（E-mail） Zhangyingred@lingnan.edu.cn。

Characteristics of chloroplast genome and response of

psbB

gene of Dolichandrone spathacea under cold stress

LIAO Xiaotong"ZHANG Taimin"LI Weijin"LI Danfeng"YANG Yong²，

CHEN Guangcheng"ZHANG Ying^1*

（ 1. Life Science and Technology College， Key Laboratory of Conservation and Restoration of Mangrove Ecosystem， Engineering and Technological

Research in Protection and Utilization of Mangrove Rare and Endangered Species， Lingnan Normal University， Zhanjiang 524048， Guangdong，

China; 2. College of Life Sciences， Ministry of Education Key Laboratory for Ecology of Tropical Islands， Key Laboratory of

Tropical Animal and Plant Ecology of Hainan Province， Hainan Normal University， Haikou 571158， China ）

Abstract： "Low temperature is an important obstacle to the ecological restoration of endangered mangrove plant Dolichandrone spathacea. Plant chloroplasts and their coding genes closely respond to cold stress. Analyzing chloroplast genome characteristics and understanding the molecular response patterns of psbB genes under cold stress can help protect and restore this species. To reveal the chloroplast genome information， this study sequenced the total DNA of D. spathacea using the Illumina NovaSeq sequencing platform， and then annotated and functionally analyzed the assembled chloroplast genome. In the meantime， the changes of psbB gene in D. spathacea seedlings under different temperatures were investigated， and physiological parameters such as total chlorophyll， malondialdehyde， proline， total phenols， soluble protein， and soluble sugar were detected in this study. Further the expression value of psbB gene was detected using fluorescence quantitative PCR experiment. The results were as follows： （1） The chloroplast genome of D. spathacea exhibited a typical tetrad structure with the length of 159 139 bp， and the "GC content of 37.9%. It encoded a total of 133 genes， including protein-coding genes （88）， tRNA genes （37） and rRNA genes （8）. （2） Phylogenetic analysis revealed that D. spathacea did not form a monophyletic group but instead clustered with 8 other Bignoniaceae species， with a support rate of 100%. （3） Under cold stress， the contents of total chlorophyll in the leaves of the D. spathacea seedlings decreased with the decrease of treatment temperature， while the contents of total phenols， malondialdehyde， proline， soluble protein and soluble sugar and "relative expression values of psbB gene in the seedling leaves increased with the decrease of treatment temperature. In summary， the chloroplast genome characteristic of D. spathacea is highly conservative in Bignoniaceae family. Under cold stress， the total chlorophyll synthesis of the plant is inhibited， and the synthesis of osmoregulatory substances is affected. At the same time， the psbB gene is involved in molecular regulation under plant cold stress. The above results provide a preliminary basis for molecular assisted breeding to improve the cold resistance of endangered mangrove plants.

Key words： Dolichandrone spathacea， chloroplast genome， phylogenesis analysis， cold stress， physiological indicators， psbB gene

海濱貓尾木（Dolichandrone spathacea）隸屬于紫葳科（Bignoniaceae）貓尾木屬（Dolichandrone），是我國典型的半紅樹植物（胡啟明等，1987）。其自然分布于海南和廣東兩省，2006年被列入《海南省重點保護野生植物名錄》（張穎等，2021）。該植物擁有重要的生態(tài)和藥用價值（田廣紅等，2011）。作為中國和東南亞地區(qū)傳統(tǒng)的藥用植物，海濱貓尾木在醫(yī)療上已被用作治療糖尿病、癌癥和其他疾病的藥物（Akashi amp; Gojobort， 2002）。但是，海濱貓尾木的瀕危狀態(tài)限制了其生態(tài)價值和藥用價值的深入利用。紅樹植物通常生長在熱帶和亞熱帶的海岸潮間帶。然而，近年來頻繁發(fā)生的低溫災(zāi)害，給包括海濱貓尾木在內(nèi)的紅樹植物帶來了短期、突然的低溫傷害（黃雪松，2021），增加了其生態(tài)修復(fù)工作的難度。

溫度是影響植物生長發(fā)育的重要影響因子（Wang XP et al.， 2022），低溫脅迫會對植物葉綠體結(jié)構(gòu)、光合色素含量產(chǎn)生影響（Li WJ et al.， 2022）。葉綠體擁有相對獨立的遺傳體系（邢少辰和Clarke，2008）是植物特有的細胞器，對植物的生長發(fā)育起著重要作用（Llorente et al.， 2021）。在植物分類與物種水平的系統(tǒng)發(fā)育等研究中，葉綠體基因組由于大小適中，編碼區(qū)序列相對保守，結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，進化速率相對較低等優(yōu)點而受到重視（Xu et al.， 2001）。隨著測序技術(shù)的快速發(fā)展，已公布了超過1 000種高等植物的葉綠體基因組全序列（Liu et al.， 2022）。其中，對紫葳科多種植物的葉綠體基因組特征進行了全面分析和報道（Nazareno et al.， 2015; Thode amp; Lohmann， 2019; Yaradua amp; Yessoufou， 2022; Li F et al.， 2022），但目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)海濱貓尾木的相關(guān)研究報道。

葉綠體編碼基因psbB屬光系統(tǒng)Ⅱ相關(guān)基因，在葉綠體發(fā)育中起著關(guān)鍵的作用。在受到逆境脅迫，如在高溫和干旱（Bi et al.， 2016）及鹽脅迫下（Sehar et al.， 2021）植物葉片中基因psbB的表達顯著升高，在重金屬脅迫下受到抑制（Li et al.， 2020），但在冷脅迫下該基因的表現(xiàn)如何鮮見報道。因此，本研究組裝、注釋獲得了海濱貓尾木完整葉綠體基因組并進行了特征分析。對海濱貓尾木幼苗進行冷脅迫處理，分析生理指標和葉綠體編碼基因psbB的表達特征，擬探討以下問題：（1）海濱貓尾木葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特征；（2）海濱貓尾木幼苗在冷脅迫下的生理響應(yīng)；（3）冷脅迫下葉綠體編碼基因psbB的表達特征。以期為揭示該植物冷脅迫分子響應(yīng)機制補充內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

海濱貓尾木種子采自中國海南島的三亞鐵爐港（109°32′50″ E、18°14′26″ N）且健康、無蟲害植株，同時在海南師范大學(xué)標本室保存相應(yīng)標本（DC-001）。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取與測序 先將種子在清水中浸泡24 h，再植入含60% 沙+40% 土壤培養(yǎng)基的塑料箱（20 cm × 30 cm）中，最后移入苗木培育室（光照14 h，黑暗10 h，濕度60%～80%，溫度25～28 ℃）進行培育。待4～6片葉時，采集幼嫩葉片，DNA提取試劑盒（TransGen，中國）提取基因組DNA。并在Illumina HiSeq平臺（杭州惠通生物技術(shù)有限公司）進行末端150 bp讀數(shù)測序。

1.2.2 葉綠體全基因組序列組裝、注釋及圖譜繪制 通過Fastqc軟件評估原始測序數(shù)據(jù)質(zhì)量。利用在線注釋工具DOGMA（Wyman et al.， 2004）對葉綠體基因組進行注釋。通過ORF預(yù)測以及NR數(shù)據(jù)庫比對，確定注釋結(jié)果（尚明越等，2023）。用OGDRAW軟件繪圖（Greiner et al.， 2019）。

1.2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 以擬南芥（Arabidopsis thaliana）和狹葉戀巖花（Echinacanthus attenuatus）作為外類群，從GenBank數(shù)據(jù)庫下載8種紫葳科植物楔葉杯領(lǐng)藤（Amphilophium cuneifolium）、黃葳（Anemopaegma chamberlaynii）、鷹爪滕（Dolichandra cynanchoides）、Tanaecium tetragonolobum、Adenoca-lymma aurantiacum、Neojobertia candolleana、白花母蘭（Pleonotoma albiflora）、硬骨凌霄（Tecoma capensis）的葉綠體基因組序列。提取11種植物葉綠體基因組45個共有CDS核苷酸序列，用MAFFT（v. 7）（Katoh amp; Standley， 2013）軟件進行序列比對，分析結(jié)果用MEGA 11（Koichiro et al.， 2021）軟件構(gòu)建最大似然（maximum likelihood，ML）樹。

1.2.4 冷脅迫實驗及生理指標的測定 待1.2.1培育的幼苗長到8～10片葉時，進行不同溫度脅迫處理，每個處理時長48 h，溫度梯度為28 ℃/25 ℃（CK）、15 ℃/12 ℃（T1）、10 ℃/5 ℃（T2）和恢復(fù)15 ℃/12 ℃（T3，其中溫度模式為光照/黑暗），每個處理5株植物。采集幼苗倒數(shù)2～3對葉測量生理指標，總?cè)~綠素由上?？瓢┥镏参锟?cè)~綠素ELISA檢測試劑盒測定，丙二醛、脯氨酸、總酚和可溶性糖由北京索萊寶科技有限公司相應(yīng)微量法試劑盒提取，可溶性蛋白用北京索萊寶科技有限公司植物蛋白試劑盒提取，再用考馬斯亮藍法測定蛋白含量。

1.2.5 基因psbB在冷脅迫植株中的表達"使用諾維贊公司試劑盒（FastPure plant Total RNA Isolation Kit）提取海濱貓尾木葉片總RNA。cDNA由Takara 公司（PrimeScript TM FAST RT）試劑盒合成。根據(jù)psbB基因序列使用Primer 6.0軟件設(shè)計引物如下：上游引物psbB-F為5′-AGAGATAAAGAAGGGCGTGAGC-3′，下游引物psbB-R為5′-CCATTGAGTTCGCCGCCAT-3′；內(nèi)參基因為擬南芥U6基因，上游引物"U6-F為5′-ACATCCGATAAAATTGGAACGA-3′，下游引物U6-R：5′-TTTTTTTGGACCATTTCTCGAT-3′。根據(jù)北京全式金Perfectstart Green qPCR試劑盒說明書三步法進行熒光定量PCR驗證實驗，方法如下：94 ℃ 30 s，1個循環(huán)；94 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 10 s，40個循環(huán)；反應(yīng)體系20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特征

如圖1所示的海濱貓尾木葉綠體基因組四分體結(jié)構(gòu)，全長159 139 bp，GC 含量37.9%，AT含量62.1%，具有明顯的AT偏向性。2個大小相同、方向相反的反向重復(fù)區(qū)（inverse repeats，IRs）分隔出大單拷貝區(qū)（large single copy，LSC） 和小單拷貝區(qū)（small single copy，SSC），IRs、LSC、SSC長度分別為30 234 、86 036、12 635 bp。

2.2 葉綠體基因組功能及分類

共有133個基因被注釋到該葉綠體基因組中，包括蛋白編碼基因（88個）、rRNA基因（8個）和tRNA基因（37個），根據(jù)功能注釋基因可分為4大類（表1）。在這些基因中，有6個蛋白質(zhì)編碼基因、9個tRNA編碼基因和4個 rRNA編碼基因位于IR區(qū)。18個基因具有內(nèi)含子，其中基因rps12、clpP、ycf3含有"2個內(nèi)含子（表 1）。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

為確定海濱貓尾木的系統(tǒng)發(fā)育位置，以狹葉戀巖花和擬南芥為外類群，結(jié)合已公布的8種紫葳科植物，共計11個葉綠體基因組序列進行分析（圖2），顯示9個紫葳科植物構(gòu)成一個單系分支，顯著區(qū)分于外類群，具有100%支持率。海濱貓尾木與光梓藤屬植物Neojobertia candolleana、白花母蘭以及硬骨凌霄的親緣關(guān)系最近，但未聚為一支，支持率為100%。

2.4 冷脅迫對海濱貓尾木的影響

2.4.1 冷脅迫對植物表型的影響 由圖3可知，28 ℃/25 ℃（CK）處理后的海濱貓尾木幼苗株型健康挺拔，葉色濃綠，生長狀態(tài)最佳；15 ℃/12 ℃（T1）處理48 h后，葉色轉(zhuǎn)黃，部分植株葉片出現(xiàn)輕度萎蔫；10 ℃/5 ℃（T2）處理48 h時后所有植株葉片嚴重萎蔫；但經(jīng)過15 ℃/12 ℃（T3）恢復(fù)培養(yǎng)48 h后，植株表現(xiàn)不同程度的恢復(fù)。

2.4.2 低溫脅迫對生理指標的影響

由圖4可知，海濱貓尾木幼苗葉片的總?cè)~綠素含量隨著處理溫度的降低呈下降趨勢，在T2時達到最低值，經(jīng)過T3（15 ℃/12 ℃恢復(fù)培養(yǎng)48 h）時，總?cè)~綠素含量顯著升高；滲透性調(diào)節(jié)物質(zhì)總酚、丙二醛、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖的含量均隨著處理溫度的降低呈上升趨勢，當溫度在T2時達到最大值，在T3時顯著下降，但可溶性蛋白含量除外。

2.4.3 基因psbB在冷脅迫植株中的表達"由圖5可知，葉綠體編碼基因psbB的相對表達量在冷脅迫下隨著溫度降低呈上升趨勢，當植株經(jīng)歷T2溫度處理后再進行T3溫度恢復(fù)培養(yǎng)時，基因psbB的相對表達量顯著下降但仍高于第一次15 ℃/12 ℃（T1）處理時的相對表達量。

3 討論

3.1 葉綠體基因組序列特征

葉綠體基因組是可以獨立于核基因組外進行遺傳的一套基因組，有遺傳多樣性和單親遺傳限制以及異交重組等特點，近年來成為植物系統(tǒng)發(fā)育研究、藥用植物馴化、改良和基因工程的重要對象（Gao et al.， 2022；郭冉昊等，2023）。海濱貓尾木葉綠體基因組是第一個被揭示的紫葳科紅樹植物葉綠體基因組。高等植物葉綠體基因組長度通常在120～180 kp間，編碼基因一般為100～130個，其中編碼蛋白質(zhì)基因可達80 ～ 88個（Zhang et al.， 2019）。海濱貓尾木葉綠體基因組的長度、編碼基因數(shù)目和種類與其他紫葳科植物的研究結(jié)果一致，符合葉綠體基因組高度保守的特性（Nazareno et al.， 2015; Thode amp; Lohmann， 2019; Yaradua amp; Lessoufou， 2022; Li F et al.， 2022）。通過共有 CDSs構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，海濱貓尾木與其他紫葳科植物聚為一枝，此結(jié)果與經(jīng)典分類結(jié)果相同（胡啟明等，1987），說明葉綠體基因組可以提供比傳統(tǒng)分子標記更多的信息，能夠提供更高分辨率的遺傳分析，成為傳統(tǒng)植物分類的有力支撐（Zhang et al.， 2023）。

3.2 海濱貓尾木在冷脅迫下的生理響應(yīng)

葉綠素作為光合作用的基礎(chǔ)可以反映植物整體的光合速率，而光合速率是反映植物抗逆性以及生長狀況的重要因素（馮峻等，2024），低溫脅迫的加劇會導(dǎo)致最大凈光合速率及光飽和點下降（武輝等，2014），因此葉綠素含量變化可以一定程度反映植物的抗逆性情況。在冷脅迫下葉綠素合成受到抑制，同時分解速度加快，光合速率下降導(dǎo)致光合作用變?nèi)酰ㄈ窝泳傅龋?020）。本研究發(fā)現(xiàn)，海濱貓尾木幼苗在冷脅迫下，隨著溫度的降低，葉綠素含量隨之下降，當溫度回升時，葉綠素含量隨之回升，這也表明短時間（48 h內(nèi)）的冷害對紅樹植物的傷害可以恢復(fù)，這一發(fā)現(xiàn)對該瀕危紅樹植物的遷地保護具有指導(dǎo)意義。

冷脅迫會使植物細胞膜受到破壞，從而使膜脂過氧化而產(chǎn)生脯氨酸，同時產(chǎn)生的丙二醛含量越高，膜脂過氧化程度加?。ò残摰?，2024）。丙二醛具有細胞毒性，本研究發(fā)現(xiàn)冷脅迫程度越劇烈，丙二醛含量就越高，與柏科植物隨著逆境脅迫程度的加深，丙二醛含量的變化趨勢一致（姚紅，2013）。受到冷脅迫時，植物體內(nèi)脯氨酸會增加，以減輕細胞所受侵害（Wang J et al.， 2022）。脯氨酸可以增強植物抗逆性，起到清除自由基、保護酶和細胞結(jié)構(gòu)以及調(diào)節(jié)胞質(zhì)滲透壓的作用（Zhu et al.， 2024）。在冷脅迫下，海濱貓尾木植株葉片脯氨酸含量呈上升趨勢，隨著溫度的回升脯氨酸含量下降，這與茶樹受低溫脅迫后脯氨酸含量的變化趨勢相同（薄曉培等，2016），說明起源于熱帶的植物擁有相似的通過調(diào)節(jié)脯氨酸含量來促進植物冷脅迫適應(yīng)的能力?？扇苄蕴?、可溶性蛋白與植物細胞的滲透壓濃度成正相關(guān)，與水勢成負相關(guān)，較高濃度的可溶性糖和可溶性蛋白能降低植物受冷害的程度（Ren et al.， 2023）。海濱貓尾木葉片中的可溶性糖和可溶性蛋白含量隨著溫度的降低而呈上升趨勢，與3種護坡植物的研究結(jié)果一致（何云等，2012），可溶性蛋白含量的變化趨勢與澳洲堅果（Macadamia integrifolia）的研究結(jié)果一致（岳海等，2010），以上植物表現(xiàn)出相似的溫度適應(yīng)調(diào)控機制。海濱貓尾木對一定程度的冷脅迫有較好的適應(yīng)能力，這可能也是該瀕危紅樹植物能夠在溫度低于原生地的珠海淇澳島紅樹林濕地遷地保護成功的內(nèi)部原因（田廣紅等，2011）。

3.3 海濱貓尾木在冷脅迫下葉綠體基因組編碼基因的響應(yīng)

葉綠體基因組編碼的光合系統(tǒng)基因、自我復(fù)制基因、生物合成基因等功能基因在植物適應(yīng)溫度變化中起著重要作用，而這些基因的表達在冷脅迫下發(fā)生了改變。轉(zhuǎn)錄組分析顯示，紫花苜蓿（Medicago sativa）冷敏感品種中tRNA基因顯著上調(diào)，rps7、rpl32和ndhB基因下調(diào)，耐寒品種中葉綠體編輯基因ycf1、ycf2和ndhF的編輯效率降低，這可能與葉綠體通過光合作用儲存養(yǎng)分來抵御寒冷有關(guān)（Zhang et al.， 2024）。海濱貓尾木葉片中基因psbB的表達量隨著冷脅迫程度的加深而上調(diào)，同是熱帶植物的油茶（Camellia oleifera）基因psbS的表達量也有類似的表現(xiàn)（Wu et al.， 2020）。說明基因psbB在海濱貓尾木冷脅迫響應(yīng)中起到較為重要的作用，該基因有望被應(yīng)用到該物種提升抗冷能力的分子輔助育種工作中。

4 結(jié)論

海濱貓尾木葉綠體基因組特征在紫葳科植物中高度保守。生理響應(yīng)實驗表明，冷脅迫會抑制海濱貓尾木總?cè)~綠素的合成，促進滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)總酚、脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白含量的增加，促進毒性物質(zhì)丙二醛含量的增多。通過熒光定量PCR實驗發(fā)現(xiàn)，海濱貓尾木葉片中葉綠體編碼基因psbB的相對表達量會隨著冷脅迫程度的加深而升高。以上研究結(jié)果可為科學(xué)制定海濱貓尾木葉綠體基因工程選育耐冷植物材料提供前期支撐。

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（責(zé)任編輯 周翠鳴）