施氮量對(duì)大豆氮同化和根際土壤氮轉(zhuǎn)化的影響

摘 要 為探究不同施氮量對(duì)大豆氮同化及根際氮素相互轉(zhuǎn)化的影響，明確大豆合理施氮水平，本研究以‘皖豆15’為試驗(yàn)材料，設(shè)置6個(gè)施氮水平：N0（0 kg·hm^-2）、N1（40 kg·hm^-2）、N2（80 kg·hm^-2）、N3（120kg·hm^-2）、N4（160 kg·hm^-2）、N5（200 kg·hm^-2），采用三室隔網(wǎng)根箱試驗(yàn)法，研究不同施氮量對(duì)分枝期和花莢期大豆氮素積累、根瘤固氮能力及土壤硝化和反硝化過程的影響。結(jié)果表明：大豆干物質(zhì)量和氮積累隨施氮量增加呈先升高后降低的趨勢(shì)。在根瘤發(fā)育方面，隨施氮量增加，兩時(shí)期根瘤數(shù)量與鮮質(zhì)量逐漸降低；分枝期根瘤菌nifH基因豐度先降低后升高，而花莢期根瘤菌nifH基因豐度先升高后降低。在根際硝化作用中，施氮會(huì)增加兩時(shí)期土壤硝化潛勢(shì)，氨氧化古菌（AOA）豐度呈先升高后降低的趨勢(shì)，對(duì)氨氧化細(xì)菌（AOB）豐度的影響不明顯。在反硝化方面，施氮對(duì)兩時(shí)期反硝化能力無顯著影響；隨施氮量增加，分枝期narG基因豐度呈先降低后升高的趨勢(shì)，花莢期narG基因豐度呈下降趨勢(shì)。相關(guān)性分析及PLS-SEM表明，分枝期氮素積累受施氮量影響較大，施氮量正向調(diào)控AOA豐度、根際硝化過程和根際固氮菌nifH豐度，最終影響植株氮素積累。綜上所述，適量施氮（120 kg·hm^-2）能有效增加根瘤菌豐度，改善根際硝化過程，提高大豆生長和植株氮積累。

關(guān)鍵詞 大豆；施氮；根瘤固氮；氮素轉(zhuǎn)化

氮肥利用率低下是中國大田作物生產(chǎn)中存在的突出問題^[1-2]。與禾本科大田作物相比，大豆因可自身固氮導(dǎo)致其氮素利用更為復(fù)雜。有觀點(diǎn)認(rèn)為大豆可通過根瘤固定氮素，因此在種植中無需外源施氮。但大量研究發(fā)現(xiàn)在一些高產(chǎn)大豆區(qū)域，根瘤提供的氮素僅占植株總氮吸收的 50%～60%^[3]，其余則主要由外源氮提供。大豆氮肥利用的復(fù)雜性主要體現(xiàn)在兩點(diǎn)，首先是施氮量和大豆根瘤固氮之間的平衡問題。適當(dāng)?shù)牡度肟梢源龠M(jìn)大豆結(jié)瘤固氮，但過低或過高的氮投入均不利于根瘤的生長發(fā)育^[4]。其次，施氮還會(huì)影響大豆根際氮素轉(zhuǎn)化，對(duì)大豆氮利用產(chǎn)生一定的擾動(dòng)^[5]。但當(dāng)前研究對(duì)這兩個(gè)方面的認(rèn)識(shí)還不明晰，因此深入研究施氮量對(duì)大豆氮同化、結(jié)瘤固氮及根際氮轉(zhuǎn)化的影響機(jī)制，對(duì)明確大豆氮肥用量區(qū)間，提高大豆氮肥利用效率具有重要意義。

施氮量對(duì)大豆根瘤固氮的影響較為復(fù)雜。一般認(rèn)為，在低氮水平下，外源施氮有利于光合作用產(chǎn)物優(yōu)先向根瘤分配，促進(jìn)根瘤生長和固氮能力^[6]。但在高氮水平下，外源氮會(huì)促進(jìn)大豆根部信號(hào)物質(zhì)“乙烯”的釋放，進(jìn)而抑制根瘤菌的侵染和結(jié)瘤^[7]。適量施氮?jiǎng)t會(huì)調(diào)控根瘤的形成和生長，平衡大豆碳氮分配，兼顧產(chǎn)量和氮肥高效利用^[8]。此外，適量施氮還會(huì)促進(jìn)根瘤固氮酶活性高峰期后延，減緩大豆根瘤的衰老，促進(jìn)大豆生育后期的養(yǎng)分積累^[9]。

除了影響結(jié)瘤固氮外，施氮還會(huì)影響根際氮素轉(zhuǎn)化過程。根際的自生固氮作用、硝化和反硝化是關(guān)鍵的氮素轉(zhuǎn)化過程，其強(qiáng)弱會(huì)影響作物對(duì)土壤氮素的吸收利用^[10]。首先在自生固氮作用上，根際自生固氮菌可直接將空氣中的N2還原成氮化合物，最終為根際提供養(yǎng)分^[11-12]。施氮量會(huì)對(duì)自生固氮產(chǎn)生較大影響。研究表明，高氮土壤環(huán)境會(huì)抑制固氮菌的生長以及繁殖，而低氮環(huán)境則會(huì)促進(jìn)自生固氮菌數(shù)量增加^[13]。根際固氮菌除了受到土壤氮濃度的影響，也會(huì)受到植株根系分泌物，比如碳的影響，因此適當(dāng)?shù)牡视昧靠梢云胶馔寥赖透堤嫉确置谖飳?duì)根際自生固氮菌的協(xié)同影響^[14]。

其次，根際硝化和反硝化過程也會(huì)受到施氮的影響^[15]。氨氧化過程作為硝化過程的第一步，也是該過程的限速步驟，由氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）共同驅(qū)動(dòng)^[16]。施氮量首先會(huì)通過直接影響底物NH+4的濃度，影響硝化過程。一般來說低氮環(huán)境下，有利于AOA的生長，而在高氮環(huán)境中，AOB則是該過程的主要貢獻(xiàn)者^[17-18]。施氮量還會(huì)通過影響其他土壤理化性狀間接影響硝化過程。比如過量施氮會(huì)降低土壤pH，進(jìn)而增強(qiáng)AOA的貢獻(xiàn)^[19]。與硝化的氧化過程不同，反硝化是一種還原過程，主要是在厭氧條件下將硝酸鹽或亞硝酸鹽還原成N2O、NO和N2的過程，其中第一步由narG基因編碼的硝酸還原酶催化，是反硝化的關(guān)鍵步驟之一^[20]。外源施氮可直接或間接影響反硝化過程。首先施氮會(huì)直接為反硝化過程提供硝酸鹽等底物，提供了反硝化菌的電子受體，有利于其生長；此外還會(huì)間接通過影響土壤理化性狀或根際碳分泌，如pH和含鹽量等影響反硝化過程。盡管前人研究已表明，施氮量會(huì)深刻影響根系根瘤固氮、根際自生固氮、硝化和反硝化過程，進(jìn)而影響大豆植株的氮吸收，但目前將它們綜合一起的研究尚缺乏，亟待進(jìn)行研究。

本研究利用大豆主產(chǎn)區(qū)之一的典型土壤黃褐土，設(shè)置6個(gè)施氮量，采用三室隔網(wǎng)根箱試驗(yàn)法，測(cè)定大豆根系根瘤固氮、根際自生固氮、硝化和反硝化過程和相關(guān)微生物豐度等，同時(shí)結(jié)合大豆植株氮吸收和土壤理化形狀，明確影響植株氮素吸收的關(guān)鍵過程和相關(guān)原因，為調(diào)控大豆根際氮轉(zhuǎn)化，減少氮肥損失，提高大豆氮肥利用效率提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)

盆栽試驗(yàn)于2021年3月至2021年12月在安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科技樓人工氣候室進(jìn)行。試驗(yàn)采用改良版三室隔網(wǎng)根箱試驗(yàn)法，根箱長、寬、高分別為20 cm、14 cm和20 cm，用4塊尼龍布格板將其分為3個(gè)4 cm寬的大隔室， 2個(gè)1 cm寬的小隔室，小隔室穿插在大隔室中間。尼龍布孔徑為30 μm，可阻止根系的穿透，但不影響水分和養(yǎng)分的通過。大豆種在中間大隔室中，該隔室土壤認(rèn)作為根際土，兩側(cè)大隔室為非根際土，兩個(gè)小隔室為過渡區(qū)域。供試大豆品種為‘皖豆15’。試驗(yàn)用土取自安徽省合肥市安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)萃園（N 31°87′，E 117°25′）農(nóng)田0～20 cm耕作層，該農(nóng)田長期保持麥玉輪作，土壤類型為黃褐土，pH 6.94，含有機(jī)質(zhì)26.55 g·kg^-1、全氮1.53g·kg^-1、有效磷39.59 mg·kg^-1、速效鉀" 273.00 mg·kg^-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與樣品采集

試驗(yàn)設(shè)置6個(gè)施氮處理：N0（0 kg·hm^-2）、N1（40 kg·hm^-2）、N2（80 kg·hm^-2）、N3（120 kg·hm^-2）、N4（160 kg·hm^-2）、N5（200kg·hm^-2）。磷鉀施用量分別為P2O5 68kg·hm^-2和K2O 68 kg·hm^-2。供試化肥為尿素（N 46%）、過磷酸鈣（P2O5 12%）和氯化鉀（K2O 51%）。所有肥料全部基施，與土壤充分混合后，根據(jù)田間體積質(zhì)量，在中間隔室，過渡區(qū)域和兩邊隔室分別加入1.467 kg、0.367 kg和" 2.933 kg土樣。在中間隔室種3穴大豆，每穴2粒，在大豆三葉期進(jìn)行間苗和定苗，保留健康且均勻一致的豆苗3株，其他管理方式一致。

分別在大豆分枝期（4月12號(hào)）、花莢期（6月3號(hào)）進(jìn)行取樣。每時(shí)期每處理取 3 盆。對(duì)根箱進(jìn)行破壞性取樣，將地上部分與地下部分分離，用水浸泡根系并快速清洗干凈，后用濾紙將水分吸干。后將根瘤取下，記下單盆根瘤數(shù)和鮮質(zhì)量，存放于-80 ℃冰箱，用于測(cè)定固氮微生物豐度。根際土取自中間隔室，用鑷子小心去除殘存根系，并將土壤過 2 mm 篩，分兩部分貯存，一部分放在" -80 ℃冰箱，用于土壤微生物豐度的測(cè)定，另一部分放于 4 ℃冰箱，用于室內(nèi)培養(yǎng)試驗(yàn)和土壤理化性狀的測(cè)定。

1.3 植株干物質(zhì)量和全氮測(cè)定

將大豆植株放入烘箱105 ℃殺青30 min，" 85" ℃烘干至恒量并稱量，結(jié)果為干物質(zhì)量，將測(cè)過干質(zhì)量的植株樣分別研磨過篩后進(jìn)行全氮測(cè)定。全氮采用H2SO4-H2O2法消煮，凱氏定氮儀（KN520，阿爾瓦，中國）測(cè)定。

1.4 土壤理化性狀測(cè)定

每次取樣后，對(duì)根際土壤理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。參照《土壤農(nóng)化分析》^[21]，土壤硝態(tài)氮（NO3^--N）和銨態(tài)氮（NH+4-N）含量用1 mol·L^-1 KCl溶液浸提，過濾后取上清液10 mL，采用全自動(dòng)化學(xué)分析儀（CleverChem380，德國）測(cè)定。土壤全氮（TN）用凱氏定氮法測(cè)定，全碳（TC）用水合熱重鉻酸鉀氧化滴定法測(cè)定。有效磷（AP）用鉬銻抗比色法測(cè)定，速效鉀（AK）通過火焰光度法測(cè)定?？扇苄杂袡C(jī)碳（DOC）用用0.5" mol·L^-1 K2SO4溶液浸提后，用重鉻酸鉀-硫酸亞鐵比色法測(cè)定。

1.5 土壤硝化潛勢(shì)和反硝化能力的測(cè)定

土壤硝化潛勢(shì)（NP）的測(cè)定采用懸浮液法^[22]，每小區(qū)取5 g新鮮土樣分別加入50 mL液體培養(yǎng)基（1.5" mmol·L^-1 NH+4），在30 ℃恒溫培養(yǎng)下，分別在6、12、24、36、48 h取樣，吸取4 mL懸浮液離心取上清用于測(cè)定NO3^--N、NO2^--N，使用流動(dòng)分析儀測(cè)定NO2^--N和NO3^--N的含量，硝化潛勢(shì)以單位時(shí)間內(nèi)每克干土產(chǎn)生的NO2^--N和NO3^--N的總量表示。土壤反硝化能力（DC）的測(cè)定參照Simek等^{[16，23]}的方法。用氣相色譜儀（GC-7890A，Agilent，美國）測(cè)定N2O濃度，反硝化能力用單位時(shí)間內(nèi)N2O變化率表示。

1.6 根際土壤氮轉(zhuǎn)化關(guān)鍵微生物基因豐度的測(cè)定

取0.5 g根際土壤，采用土壤DNA提取試劑盒（Fast DNA SPIN kit for soil，美國）提取80 μL的土壤總DNA。隨后采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量分析氮轉(zhuǎn)化關(guān)鍵微生物，包括與硝化作用相關(guān)的氨氧化細(xì)菌（AOB）、氨氧化古菌（AOA）的amoA基因，與反硝化作用相關(guān)的硝酸還原酶的narG基因的豐度差異。氨氧化細(xì)菌和氨氧化古菌功能基因amoA定量PCR采用Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng) （Stratagene，USA），選擇amoA1F/amoA2R和Arch-amoAF/Arch-amoAR引物分別擴(kuò)增氨氧化細(xì)菌和古菌，選擇narG-1960m2f / narG-2050m2r引物擴(kuò)增narG。選用25 μL的PCR反應(yīng)體系，包含：12.5 μL的2 × SG Green qPCR Mix，上下游引物各0.5 μL （10 μmol），0.5 μL DNA模板，剩下的用雙蒸水補(bǔ)齊至25 μL。氨氧化細(xì)菌PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)。氨氧化古菌PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min，95 ℃變性45 s，53 ℃退火60 s，72" ℃延伸60 s，30個(gè)循環(huán)。narG PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性15 s，" 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。

功能基因豐度 （copies·g^-1） =目標(biāo)基因數(shù)量×基因拷貝數(shù)/0.5×（1-含水率）×100

1.7 根瘤中固氮微生物基因豐度的測(cè)定

采用CTAB法^[24]提取根瘤總DNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量分析固氮基因nifH的豐度，選擇nifH For / nifH Rev引物擴(kuò)增nifH。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min，" 95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次。選用25 μL的PCR反應(yīng)體系，包含：12.5 μL的2 × SG Green qPCR Mix，上下游引物各0.5 μL （10 μmol），0.5 μL DNA模板，剩下的用雙蒸水補(bǔ)齊至25 μL。nifH PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)。

根瘤nifH基因豐度（copies·g^-1）= 目標(biāo)基因數(shù)量×基因拷貝數(shù)/0.1×100

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 26進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析； mantel test相關(guān)性熱圖使用R 4.2.1軟件中的“vegan”包制作，采用SmartPLS 4軟件作結(jié)構(gòu)方程模型。

2 結(jié)果與分析

2.1 施氮量對(duì)大豆干物質(zhì)量及氮素積累的影響

由圖1可知，施氮可以提高植株干物質(zhì)積累，各施氮處理花莢期干物質(zhì)量均高于N0處理。植株氮素積累與干物質(zhì)積累有類似趨勢(shì)。在分枝期，氮素的添加使植株氮素積累量提高，表現(xiàn)為N3gt;N4gt;N5gt;N2gt;N1gt;N0，N3與N4、N5處理間差異不顯著，除N1處理外其他施氮處理均顯著高于不施氮處理，其中N3較N0處理高出31.6%。花莢期各處理大豆植株氮積累量較分枝期大幅增加。植株氮積累量在N0～N3范圍內(nèi)表現(xiàn)出隨施氮量的增加而增加的趨勢(shì)，N4和N5較N3處理有所降低但不顯著，且均顯著高于其他處理，其中N3較N0處理顯著增加25.4%，N1與N2處理間差異不顯著且均顯著高于N0處理。

2.2 施氮對(duì)大豆根際土壤理化性質(zhì)的影響

由表1可知，在分枝期，N0處理根際土壤pH顯著低于其他施氮處理，N1處理pH最高，N0處理AP為32.58 mg·kg^- 顯著高于施氮處理，N4處理的AK顯著低于其他處理，其他處理間差異不顯著，N2～N5處理的DOC含量無顯著性差異，且均顯著高于N0和N1處理，其中N3處理最高。各處理土壤NO3^--N含量隨施氮量的增加呈先上升后降低的趨勢(shì)，除N1處理外，其他施氮處理均顯著高于不施氮處理，其中N3處理最高， N5處理的土壤NH+4-N含量顯著高于其他處理，其他處理間差異不顯著，N2處理最低。

花莢期各處理根際土壤的pH無顯著性差異。N4和N5處理的AP顯著低于其他處理，其他處理間差異不顯著，其中N0處理最高。施氮處理間的AK無顯著性差異，且均顯著低于N0處理。各處理DOC隨施氮水平的提高呈先升后降的趨勢(shì)，其中N3處理達(dá)到最大值；各處理土壤NO3^--N和NH+4-N含量均隨施氮量的增加呈先上升后降低的趨勢(shì)，均在N3處理達(dá)到最大值。

2.3 施氮量對(duì)大豆根瘤數(shù)量和鮮質(zhì)量的影響

由圖2可知，分枝期大豆根瘤數(shù)量和鮮質(zhì)量均在N1處理達(dá)到最大值，N5處理顯著低于其他處理。此外，花莢期根瘤數(shù)量變化為N1gt;N0gt;N3gt;N4gt;N5，鮮質(zhì)量變化為N1gt;N2gt;N3gt;N0gt;N4gt;N5，N1處理根瘤數(shù)量與鮮質(zhì)量達(dá)最大值，根瘤鮮質(zhì)量較N0處理相比增幅21.02%，N5處理較N0處理降低46.59%。

2.4 施氮量對(duì)大豆根瘤及土壤固氮能力的影響

由圖3可知，分枝期根瘤菌nifH豐度隨著施氮量的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，其中N5處理略高于N0處理但無明顯差異，其他處理均顯著低于N0處理，N3處理最低，較N0處理降低42.37%；土壤固氮菌nifH豐度在N0～N2處理間無顯著差異，N3處理時(shí)顯著升高，比N0處理相比增幅74.20%。在花莢期，N3處理的根瘤菌nifH豐度顯著高于其他處理，較N0處理相比增幅為40.34%，N1、N2、N4、N5處理較N0處理分別降低16.42%、11.20%、63.87%、56.91%；隨著施氮量的增加土壤固氮酶nifH豐度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。N0處理高于其他處理，除N1處理和N3處理外，其他處理均顯著低于N0處理。

2.5 施氮量對(duì)大豆根際土壤硝化潛勢(shì)及氨氧化古菌和氨氧化細(xì)菌豐度的影響

由圖4可知，大豆分枝期N3處理硝化潛勢(shì)最高，較N0處理相比增幅為61.36%；N3～N5處理間無顯著性差異，均顯著高于N0～N2處理。在花莢期，N2～N5處理間硝化潛勢(shì)無顯著差異，且均顯著高于N0和N1處理。此外，對(duì)各處理間的硝化潛勢(shì)分析可以發(fā)現(xiàn)分枝期硝化潛勢(shì)顯著高于花莢期，花莢期平均硝化潛勢(shì)較分枝期平均降低46.29%。

由圖5可知，在分枝期， AOA-amoA拷貝數(shù)隨施氮量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。其中N3處理最高，是N0處理的2.55倍；除N0與N1處理無顯著差異外，其他處理均顯著高于N0處理。分枝期AOB-amoA拷貝數(shù)表現(xiàn)為N0處理最高，除N1處理顯著低于N0處理外，其他處理較N0處理有所降低但不顯著。在花莢期， N2處理AOA-amoA拷貝數(shù)最高，除與N5處理間無顯著差異外，均顯著高于其他處理，其中N2處理較N0處理相比增幅為51.08%。施氮處理的AOB-amoA拷貝數(shù)均高于N0處理；N5處理顯著高于其他處理，較N0處理相比增幅52.68%，除N5處理外其他處理間無顯著差異。

2.6 施氮量對(duì)大豆根際土壤反硝化能力和反硝化菌豐度的影響

由圖6可知，分枝期和花莢期根際土壤反硝化能力在各施氮處理間無顯著差異，但花莢期反硝化能力均高于分枝期土壤反硝化能力。分枝期不同施氮量對(duì)narG豐度的影響差異較大，其中N0處理顯著高于N1和N2處理，顯著低于N3～N5處理，N3處理是N0處理的2.17倍。在花莢期，所有施氮處理間無顯著差異，其中N2和N4處理顯著低于N0處理，N2處理最低，較N0處理相比降低19.16%；其他施氮處理較N0處理略微降低但無顯著差異。

2.7 根際測(cè)定變量間的相關(guān)性分析

硝化反硝化微生物豐度的變化受土壤理化性狀的影響，由圖7可知，相關(guān)性分析表明AOA豐度與土壤可溶性有機(jī)碳（DOC）（r=0.424，Plt;" 0.05）含量顯著正相關(guān)；AOB豐度與AP（r=" 0.026，Plt;0.01）極顯著正相關(guān)；narG基因豐度與AK（r=0.173，Plt;0.05）顯著正相關(guān)，與NO3^--N（r=0.489，Plt;0.01）極顯著正相關(guān)，與反硝化能力（DC）（r=-0.33 Plt;0.05）顯著負(fù)相關(guān)，與NH+4-N（r=-0.170，Plt;0.01）極顯著負(fù)相關(guān)。

2.8 PLS-SEM分析

施氮量通過影響固氮微生物豐度變化調(diào)控土壤的氮素轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而影響大豆植株的氮素積累。由圖8可知，施氮主要影響分枝期大豆氮素積累，花莢期土壤氮素轉(zhuǎn)化過程與植株氮素積累間無顯著相關(guān)。在分枝期，土壤氮素轉(zhuǎn)化相關(guān)微生物豐度變化受施氮量的正向影響，施加氮肥是影響AOA豐度、反硝化微生物narG及土壤固氮菌nifH豐度（Plt;0.001）變化的主要原因。

AOA豐度變化是影響硝化潛勢(shì)改變的主要原因（Plt;0.001），反硝化能力的改變受narG基因的負(fù)向影響（Plt;0.01），氮素積累受硝化潛勢(shì)（Plt;0.01）和固氮微生物（Plt;0.01）的正向影響。在花莢期，土壤氮素轉(zhuǎn)化過程與植株氮素積累無顯著相關(guān)，AOB豐度變化受施氮量的正向影響" （Plt;0.001），反硝化微生物narG（Plt;0.05）及土壤固氮菌nifH豐度（Plt;0.001）受施氮量的負(fù)向影響，AOA豐度變化是解釋硝化潛勢(shì)（Plt;0.05）改變的主要原因。PLS-SEM分別解釋了分枝期和花莢期氮素積累受氮轉(zhuǎn)化過程影響的" 76.6%和62.4%，表明土壤氮轉(zhuǎn)化過程與大豆植株氮素積累呈正相關(guān)。分枝期與花莢期AOA豐度與土壤硝化勢(shì)均呈顯著正相關(guān)，路徑系數(shù)分別為0.84和0.412。此外，分枝期施氮量對(duì)narG豐度和nifH基因豐度間呈顯著負(fù)相關(guān)，而花莢期施氮量對(duì)narG豐度和nifH基因豐度間呈顯著正相關(guān)。

3 討" 論

3.1 施氮量對(duì)大豆根瘤形成和根瘤菌豐度的" 影響

在根瘤形成方面，本研究發(fā)現(xiàn)， 低施氮量" （≤40 kg·hm^-2）會(huì)提高大豆根瘤數(shù)量和鮮質(zhì)量，但隨著施氮量提高至120 kg·hm^-2以后開始對(duì)根瘤有明顯的抑制作用（圖2），這與前人的研究結(jié)果類似^[25-26]。一般認(rèn)為，低施氮水平會(huì)提高大豆植株光合作用，促使光合產(chǎn)物優(yōu)先向根瘤分配。高施氮水平會(huì)促進(jìn)細(xì)胞分裂素合成突變體，進(jìn)而增強(qiáng)硝酸鹽對(duì)根瘤發(fā)育的抑制，限制根瘤生長^[27]。

在根瘤菌豐度方面，分枝期和開花期對(duì)氮素響應(yīng)存在差異。在分枝期，根瘤菌nifH基因豐度隨施氮量增加呈先降低后升高的趨勢(shì)（圖3），這可能與土壤自身的固氮菌nifH基因豐度變化有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)土壤中的固氮菌nifH基因豐度隨施氮量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)（圖3），與根瘤中的豐度變化趨勢(shì)恰好相反，兩者呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（表2）。這說明在根瘤形成關(guān)鍵的分枝期，根瘤中固氮菌的豐度與土壤中固氮菌豐度存在較強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，土壤本底固氮菌的動(dòng)態(tài)變化是決定根瘤中固氮菌豐度的關(guān)鍵^[28-29]。在花莢期，根瘤菌nifH基因豐度隨施氮量增加呈先增加后降低的趨勢(shì)（圖3），而此時(shí)與土壤固氮菌豐度之間沒有顯著相關(guān)性，這說明此時(shí)的根瘤形成已較為成熟，受土壤固氮菌影響較小。一般認(rèn)為，根瘤穩(wěn)定時(shí)期，根瘤中固氮菌的豐度受到植株有機(jī)碳投入量的強(qiáng)烈影響^[30-31]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著施氮量的增加，大豆植株干物質(zhì)積累量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)（圖1）。由此推測(cè)植株向根瘤中輸入的碳的含量也會(huì)因此降低，在此情況下，根瘤菌中固氮菌豐度也隨碳輸入量的變化而適當(dāng)改變。由此可見，根瘤中固氮菌的豐度受到植株碳代謝的深刻影響，在未來關(guān)注氮素對(duì)其影響的同時(shí)，應(yīng)關(guān)注碳代謝的協(xié)同變化。

3.2 施氮量對(duì)土壤硝化、反硝化作用和植株氮素積累的影響

氨氧化古菌和氨氧化細(xì)菌驅(qū)動(dòng)土壤硝化過程，施加氮素會(huì)改變其豐度進(jìn)而影響土壤硝化潛勢(shì)。本研究中，與不施氮肥相比，施氮會(huì)提高土壤的硝化潛勢(shì)。這是由于尿素會(huì)在脲酶的催化作用下水解為硝化作用的底物NH+4-N， 硝化微生物將NH+4-N氧化為NO3^--N，進(jìn)而提高土壤硝化潛勢(shì)^[32]。施氮會(huì)造成硝化微生物豐度變化，本研究中AOA-amoA基因拷貝數(shù)顯著高于AOB-amoA基因拷貝數(shù)（圖5），且施氮對(duì)AOB豐度變化影響不大，可能說明AOA較AOB發(fā)揮著更重要的作用，這與前人研究結(jié)果類似^[33]。這可能與氨氧化古菌含有脲酶基因可促進(jìn)尿素水解，進(jìn)而增強(qiáng)氨氧化作用^[34]。本研究發(fā)現(xiàn)，AOA豐度在兩時(shí)期均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)（圖5）。AOA除了一部分是自養(yǎng)代謝外，還有一部分是異養(yǎng)代謝，需要從其他底物中獲得能量和碳源，土壤有機(jī)碳含量可以為AOA提供碳源，提高其豐度和活性^[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著施氮量增加，土壤有機(jī)碳含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)（表1），在N3處理下土壤有機(jī)碳含量最高，施氮量繼續(xù)增加，土壤有機(jī)碳含量降低，這與前人研究結(jié)果類似^[36]。這是由于氮素進(jìn)入土壤后需被水溶解成離子才能被作物吸收，過量氮素會(huì)消耗過多水分，降低土壤含水率，不利于土壤團(tuán)聚體形成，并降低土壤碳氮比值，使土壤結(jié)構(gòu)逆向發(fā)展，抑制了土壤有機(jī)碳的保持^[37]。本研究研究發(fā)現(xiàn)，AOA基因拷貝數(shù)與土壤有機(jī)碳呈顯著正相關(guān)（圖7），說明氮素添加還會(huì)間接改變土壤有機(jī)碳含量來影響AOA豐度。

反硝化作用作為土壤氮素?fù)p失的主要途徑，會(huì)受到氮素濃度的深刻影響。在本研究中施氮未對(duì)大豆土壤反硝化能力產(chǎn)生影響，但在大豆生長后期，施氮對(duì)土壤反硝化過程產(chǎn)生了促進(jìn)作用，花莢期土壤反硝化能力高于分枝期土壤反硝化能力（圖 6-A），這一現(xiàn)象與前人研究結(jié)果類似^[38]。其次，反硝化微生物直接參與反硝化過程，其豐度變化可能會(huì)對(duì)反硝化能力產(chǎn)生一定影響^[39]。本研究發(fā)現(xiàn)，施氮量會(huì)對(duì)narG基因豐度產(chǎn)生不同的影響。在分枝期，narG基因豐度隨施氮量增加呈先降低后升高的趨勢(shì)（圖6-B）。這可能因?yàn)榈偷较轮参锔H碳氮較低，限制了narG基因豐度，但隨施氮量增加，根際土壤中可溶性有機(jī)碳和NO3^--N含量上升，這為反硝化細(xì)菌提供較多碳源和氮源，進(jìn)而提高narG基因的豐度^[40-41]。在花莢期，施氮量未對(duì)narG基因豐度產(chǎn)生顯著影響（圖6A），這與鄭燕等^[42]的研究結(jié)果相似。這可能因?yàn)樵诨ㄇv期，根際碳氮較為充足，此時(shí)土壤氮素施用干擾不會(huì)對(duì)narG基因豐度產(chǎn)生顯著影響^[43]。本研究也發(fā)現(xiàn)，雖然施氮顯著影響narG基因豐度變化，但對(duì)反硝化能力的影響并不顯著，這可能是由于narG基因僅參與反硝化過程的一部分，而反硝化能力還會(huì)受其他反硝化微生物的影響^[44]。因此，在未來研究可適當(dāng)對(duì)更多反硝化微生物進(jìn)行分析。

PLS-SEM表明植株氮素積累主要受分枝期根際硝化作用的正向影響，花莢期固氮作用與硝化反硝化過程均無顯著相關(guān)性（圖8）。在分枝期，隨著根際硝化作用增強(qiáng)植株氮積累量升高，這可能是由于硝化作用的最終產(chǎn)物NO3^--N能被植株吸收固定，大豆作為喜硝作物，硝化作用生成的NO3^--N越多，其植株吸收利用的效率也因此提高^[45]。

4 結(jié)" 論

適量施氮可以促進(jìn)根瘤生長發(fā)育，增強(qiáng)根際硝化作用，提高大豆植株花莢期前的干物質(zhì)量，改善植株氮素積累。本研究中，分枝期和花莢期AOA數(shù)量比AOB高出1個(gè)數(shù)量級(jí)，表明AOA可能是本試驗(yàn)土壤氨氧化反應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)者。適量施氮會(huì)增加AOA豐度，促進(jìn)根際硝化過程的進(jìn)行。施氮不會(huì)對(duì)根系土壤反硝化能力無顯著影響。綜上，適量施氮（120 kg·hm^-2）提高大豆根瘤數(shù)量和鮮質(zhì)量，促進(jìn)根際硝化作用，提高大豆干物質(zhì)及氮素積累。

參考文獻(xiàn) Reference：

［1］ REN B，WANG X，DUAN J，et al. Rhizobial tRNA-derived small RNAs are signal molecules regulating plant" nodulation[J]. Science，2019，365（6456）：919-922.

[2]CASSMAN K G，DOBERMANN A. Nitrogen and the future of agriculture：20 years on：This article belongs to Ambio’s 50th Anniversary Collection. Theme：Solutions-oriented research[J].Ambio A" Journal of Environment and Society，2022，51（1）：17-24.

[3]劉玉庫，張瑞朋，談 偉. 大豆氮素營養(yǎng)研究進(jìn)展[J]. 雜糧作物，2006（3）：200-203.

[4]AFZA R，HARDARSION G，ZAPATA" F，et al. Effects of delayed soil and foliar N fertilization on yield and N2 fixation of soybean[J].Plant and Soil，1897，97（3）：361-368.

[5]王丹英，汪自強(qiáng). 播期、密度、氮肥用量對(duì)菜用大豆產(chǎn)量和品質(zhì)的效應(yīng)[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），200 27（1）：69-72.

[6]WANG Q，WANG J，LI Y，et al. Influence of nitrogen and phosphorus additions on N2-fixation activity，abundance，and composition of diazotrophic communities in a Chinese fir plantation[J]. Science of" the Total Environment，2018（619）：1530-1537.

[7]OLDROYD G E，ENGSTROM E M，AND LONG S R.Ethylene inhibits the Nod factor signal transduction pathway of Medicago truncatula [J].The Plant Cell，200 ""13（8）：1835-1849.

[8]劉樸方. 農(nóng)肥和化肥施用對(duì)大豆根瘤菌和土壤固氮菌多樣性的影響[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[9]吳海寧，黃志鵬，唐秀梅，等. 氮肥減施對(duì)花生根際土壤固氮微生物多樣性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（16）：93-97.

[10] ZHAO J，NI T，LI Y，et al. Responses of bacterial communities in arable soils in a rice-wheat cropping system to different fertilizer regimes and sampling times[J]. PLoS One，2014，9（1）：e85301.

[11]JONES R T，ROBESON M S，LAUBER C L，et al. A comprehensive survey of soil acidobacterial diversity using pyrosequencing and clone library analyses[J]. The ISME Journal：Isme Journal Multidisciplinary Journal of Microbial Ecology，2009，3（4）：442-453.

[12]周寶庫. 長期施肥條件下黑土肥力變化特征研究[D]. 北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2012.

[13]孟繁華，李桂花，盧昌艾，等. 長期不同施肥黑土碳氮庫的組分特征[J]. 中國土壤與肥料，2015（2）：12-16.

[14]KE X，XIAO H，PENG Y，et al. Phosphoenolpyruvate reallocation links nitrogen fixation rates to root nodule energy state[J].Science，2022，378（6623）：971-977.

[15]TAYLOR A E，ZEGLIN L H，WANZEK T A，et al. Dynamics of ammonia-oxidizing archaea and bacteria populations and contributions to soil nitrification potentials[J].The" ISME Journal，2012，6（11）：2024-2032.

[16]SIMEK M，HOPKINS D W. Regulation of potential denitrification by soil pH in long-term fertilized arable soils[J].Biology and Fertility of Soils，1999，30（1）：41-47.

[17]劉晶靜，馬文丹，和 松，等. 酸性土壤氨氧化微生物及其影響因素研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2023，50（1）：413-426.

[18]劉正輝，李德豪. 氨氧化古菌及其對(duì)氮循環(huán)貢獻(xiàn)的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2015，42（4）：774-782.

[19]ZHANG Q，CHEN M，LENG Y，et al. Organic substitution stimulates ammonia oxidation-driven N2O emissions by distinctively enriching keystone species of ammonia-oxidizing archaea and bacteria in tropical arable soils[J].Science of the Total Environment，2023（872）：1-11. https：//doi.org/10.1016/j.scitotenv.2023.162183.

[20]PHILIPPOT L，PIUTTI S，MARTIN-LAURENT F，" et al. Molecular analysis of the nitrate-reducing community from unplanted and maize-planted soils[J]. Applied and Environmental Microbiology，2002，68（12）：6121-6128.

[21]鮑士旦. 土壤農(nóng)化分析（第三版）[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2000.

[22]TAYLOR A E，ZEGLIN L H，DOOLEY S，et al. Evidence for different contributions of archaea and bacteria to the ammonia-oxidizing potential of diverse oregon soils[J]. Applied and Environmental Microbiology，2010，" 76（23）：7691-7698.

[23]SIMEK M，KALCIK J. Carbon and nitrate utilization in soils：the effect of long-term fertilization on potential denitrification[J].Geoderma，1998，83（3）：269-280.

[24]BENSON D R，STEPHENS D W，CLAWSON M L，et al. Amplification of 16S rRNA genes from Frankia strains in root nodules of Ceanothus griseus，Coriaria arborea，Coriaria plumosa，Discaria toumatou，and Purshia tridentata[J]. Applied and Environmental Microbiology，1996，" 62（8）：2904-2909.

[25]NISHIDA H，SUZAKI T. Nitrate-mediated control of root nodule symbiosis[J].Current Opinion in Plant Biology，2018（44）：129-136.

[26]SAITO A，TANABATA S，TANABATA T，et al. Effect of nitrate on nodule and root growth of soybean （Glycine max （L.） Merr.）[J]. International Journal of Molecular Sciences，2014，15（3）：4464-4480.

[27]高瑞敏，嚴(yán) 君，鄒 獅.氮肥對(duì)大豆根際土壤微生物群落和代謝的影響[J]. 土壤與作物，2023，12（4）：373-384.

[28]LIN J，ROSWANJAYA Y P，KOHLEN W，et al. Nitrate restricts nodule organogenesis through inhibition of cytokinin biosynthesis in Lotus japonicus[J]. Nature Communication，202 12（1）：6544.

[29]孫棋棋，鄭永美，于天一，等. 施氮對(duì)不同結(jié)瘤特性花生土壤固氮菌多樣性和群落組成的影響[J]. 作物學(xué)報(bào)，2022，48（10）：2575-2587.

[30]CHENG Z，MENG L，YIN T，et al. Changes in soil rhizobia diversity and their effects on the symbiotic efficiency of soybean intercropped with maize[J]. Agronomy，2023，" 13（4）：997.

[31]LAGUNAS B，RICHARDS L，SERGAKI C，et al. Rhizobial nitrogen fixation efficiency shapes endosphere bacterial communities and Medicago truncatula host growth[J]. Microbiome，2023，11（1）：146.

[32]DE VRIES W，A. BREEUWSMA. The relation between soil acidification and element cycling[J].Water Air Soil Pollution，1987（35）：293-310.

[33]ZHANG L，OFFRE P R，HE J，et al. Autotrophic ammonia oxidation by soil thaumarchaea[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences - PNAS，2010，" 107（40）：17240-17245.

[34]LU L，HAN W，ZHANG J，et al. Nitrification of archaeal ammonia oxidizers in acid soils is supported by hydrolysis of urea[J]. The ISME Journal，2012，6（10）：1978-1984.

[35]SHI S，RICHARDSON A E，O'CALLAGHAN M，et al. Effects of selected root exudate components on soil bacterial communities[J]. FEMS Microbiology Ecology，201 77（3）：600-610.

[36]李小涵，李富翠，劉金山，等. 長期施氮引起的黃土高原旱地土壤不同形態(tài)碳變化[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，" 47（14）：2795-2803.

[37]HUANG S，ZHANG W J，YU X C，et al. Effects of long-term fertilization on corn productivity and its sustainability in an Ultisol of southern China[J].Agriculture，Ecosystems amp; Environment，2010，138（1）：44-50.

[38]史艷姝，陳書濤，胡正華，等. 模擬酸雨對(duì)冬小麥-大豆輪作農(nóng)田土壤呼吸、硝化和反硝化作用的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，201 30（12）：2503-2510.

[39]BAIS H P，WEIR T L，PERRY L G，et al. The role of root exudates in rhizosphere interactions with plants and other organisms[J]. Annual Review of Plant Biology，2006（57）：233-266.

[40]WEI X，HU Y，PENG P，et al. Effect of P stoichiometry on the abundance of nitrogen-cycle genes in phosphorus-limited paddy soil[J].Biology and Fertility of Soils，2017，53（7）：767-776.

[41]YANG X，TANG S，NI K，et al. Long-term nitrogen addition increases denitrification potential and functional gene abundance and changes denitrifying communities in acidic tea plantation soil[J]. Environmental Research，2023（216）：1-10. https：//doi.org/10.1016/j.envres.2022.114679.

[42]鄭 燕，侯海軍，秦紅靈，等. 施氮對(duì)水稻土N2O釋放及反硝化功能基因（narG/nosZ）豐度的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2012，32（11）：3386-3393.

[43]ALLEN C，BURR M，CAMPER A，et al. Seasonality，C∶N ratio and plant species influence on denitrification and plant nitrogen uptake in treatment wetlands[J]. Ecological Engineering，2023（191）：1-10.https：//DOI：10.1016/j.ecoleng.2023.106946.

[44]陳 哲，袁紅朝，吳金水，等. 長期施肥制度對(duì)稻田土壤反硝化細(xì)菌群落活性和結(jié)構(gòu)的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，" 29（11）：5923-5929.

[45]ZHONG W，BIAN B，GAO N，et al. Nitrogen fertilization induced changes in ammonia oxidation are attributable mostly to bacteria rather than archaea in greenhouse-based high N input vegetable soil[J]. Soil Biology and Biochemistry，2016（93）：150-159.

Effect of" Nitrogen Application on Nitrogen Assimilation and Rhizosphere Soil Nitrogen Transformation in Soybean

LIANG Shuang，ZHANG Can，ZHOU Yanan，HU Leilei，LUO Huaying，CHE Zhao，DONG Zhaorong，WANG Xiaobo" and" SONG He

（School of Agronomy，Anhui Agriculture University，Hefei 230036，China）

Abstract To investigate the effects of different nitrogen application rates on soybean nitrogen assimilation and rhizosphere nitrogen conversion，and to clarify the rational nitrogen application level of soybean，‘Wandou 15’ was used as the experimental material，six nitrogen application levels were set：N0 （0 kg·hm^-2），N1 （40" kg·hm^-2），N2 （80 kg·hm^-2），N3 （120 kg·hm^-2），N4 （160" kg·hm^-2），and N5 （200 kg·hm^-2）.The three-chamber rhizobox experiment method was used to analyze the effect of different nitrogen application rates on nitrogen accumulation，root nodule nitrogen fixation，and soil nitrification and denitrification processes during the soybean branching and podding stages.The results showed that soybean dry matter mass and nitrogen accumulation increased initially and then decreased as nitrogen application increased.In rhizoma development，the number of rhizomes and fresh mass gradually decreased with increasing N application.The abundance of Rhizobium" nifH genes firstly decreased and then increased during the branching stage，while it increased first and then decreased during the flowering and podding stages.Nitrogen application increased the soil’s" nitrification potential during both periods.The abundance of AOA increased at first and then decreased，while the effect on AOB abundance was minimal.Nitrogen application had no significant effect on denitrification capacity during both periods.As nitrogen application increased，the abundance of the narG gene decreased，then increased，and finally decreased during the branching stage，while it showed a continuous decrease during the flowering and podding stages.Correlation analysis and PLS-SEM showed that nitrogen accumulation significantly affected nitrogen accumulation during the branching stage.This positively regulated AOA abundance，indirectly affecting soil nitrification，and also increased the abundance of nitrogen-fixing nifH bacteria，indirectly promoting plant nitrogen accumulation.In summary，moderate N application （120 kg·hm^-2） effectively increases rhizomes，nitrification，and enhances soybean growth and plant N accumulation.

Key words Soybean; Nitrogen application; Nodule fixation of nitrogen; Nitrogen transformation

Received" 2024-04-05 Returned 2024-06-19

Foundation item The Key Project of Natural Science in Scientific Research of Higher Education Institutions in Anhui Province （No.2023AH050989）.

First author LIANG Shuang，female，masterstudent.Research area：cultivation and ecology." E-mail：864248217@qq.com

Correspondingauthor ZHANG Can，female，master，assistant experimentist.Research area：cultivation and ecology.E-mail：zhangcan@ahau.edu.cn

SONG He，male，Ph.D，professor.Research area：cultivation and ecology.E-mail：songhesonghe@foxmail.com

（責(zé)任編輯：史亞歌 Responsible editor：SHI Yage）