低溫誘導(dǎo)基因表達(dá)與紫花苜蓿主要農(nóng)藝性狀間的關(guān)系

收稿日期：2024-02-23；修回日期：2024-05-05

基金項(xiàng)目：財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助（CARS-34），陜西省重點(diǎn)研發(fā)一般項(xiàng)目（2019 NY-074）資助

作者簡(jiǎn)介：

#彭嘉文（2000-），女，漢族，河南南陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事遺傳資源與牧草育種研究，E-mail：pengjiawen2021@nwsuaf.edu.cn；#夏厚胤（2000-），男，漢族，湖北十堰人，碩士研究生，主要從事遺傳資源與牧草育種研究，E-mail：xiahy27@163.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：gaojinghui@nwsuaf.edu.cn；yangpeizhi@126.com

摘要：低溫限制紫花苜蓿（Medicago sativa L.）生長(zhǎng)發(fā)育，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量。為在作物生長(zhǎng)早期篩選高產(chǎn)抗寒候選品種，本研究以4種紫花苜蓿為試驗(yàn)材料，利用甲基磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate，EMS）誘變建立T1突變?nèi)后w，結(jié)合優(yōu)良突變體高產(chǎn)相關(guān)農(nóng)藝性狀評(píng)價(jià)，擬探索低溫誘導(dǎo)基因表達(dá)量與高產(chǎn)農(nóng)藝性狀間的關(guān)系。結(jié)果表明：優(yōu)質(zhì)抗寒苜蓿突變體植株表現(xiàn)為植株高大、莖稈粗壯、分枝數(shù)多、葉面積大，同時(shí)低溫誘導(dǎo)基因MsG0180003510 （HIPP），MsG0880047253（LEA），MsG0880047531（TPS）和MsG0180005121（PM）表達(dá)水平在隸屬函數(shù)分析中排位最高；其中HIPP與莖粗顯著正相關(guān)（P＜0.05），LEA與莖粗顯著正相關(guān)、與分枝數(shù)和節(jié)間顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），PM和莖粗、分枝數(shù)和干鮮重顯著正相關(guān)（P＜0.05）。研究指出苜蓿中農(nóng)藝性狀表現(xiàn)為莖稈粗壯、枝繁葉茂，且分子水平HIPP，LEA，TPS和PM基因高表達(dá)，可作為在生長(zhǎng)早期篩選高產(chǎn)耐寒苜蓿品種的預(yù)測(cè)因子，為紫花苜蓿在低溫脅迫下的生存策略提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；低溫脅迫；農(nóng)藝性狀；低溫誘導(dǎo)基因

中圖分類號(hào)：S542""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）11-3358-13

The Correlation Between Gene Expression Induced by Low-Temperature

Stress and Key Agronomic Traits of Alfalfa

PENG Jia-wen#， XIA Hou-yin#， MA Zhi-chao， CUI Yi-lin， YUAN Wang， MIAO Yu-qi， TONG Yu-tao，

WU Jia-xin， ZHANG Meng-yao， YUAN Zi-ang， GAO Jing-hui*， YANG Pei-zhi*

（College of Grass and Grassland，Northwest A amp; F University，Yangling，Shaanxi Province 712100，China）

Abstract：Alfalfa （Medicago sativa L.） is a widely cultivated forage worldwide，while the growth and production of alfalfa in cold northern regions are primarily limited by low-temperature stress. The present study aimed to investigate the integration of cold resistance identification and screening for high-yield candidate varieties during the early selection phase. Four varieties of alfalfa as experimental materials were used to establish T1 mutant populations through ethyl methanesulfonate （EMS，C3H8O3S） mutagenesis. By combining this with the selection of exceptional mutants exhibiting high-yield agronomic traits，we sought to explore the relationship between gene expression levels induced by low temperature and major agronomic traits associated with high yield. The research here revealed that main agronomic characteristics of high-quality and cold-resistant mutant alfalfa include tall plants，robust stems，and abundant branches and leaves. And low-temperature stress induced high expression of MsG0180003510 （HIPP），MsG0880047253 （LEA），MsG0880047531 （TPS），and MsG0180005121 （PM），while their expression levels exhibited major roles according to membership function analysis. Specifically，HIPP showed a significant positive correlation with stem diameter （Plt;0.05），while LEA demonstrated significant positive correlations with stem diameter but negative correlations with branch number and internode number （Plt;0.05）. PM exhibited significant positive correlations with stem diameter，branch number，and dry/fresh weight （Plt;0.05）. The study reveals the correlation between low-temperature-induced gene expression and agronomic traits in alfalfa;and suggests that the combination of tall plants with robust stems and abundant branches and leaves，along with the high expression of low-temperature-induced genes HIPP，LEA，TPS and PM，can be used as a predictor for selecting high-yield and cold-resistant alfalfa varieties during early growth stages，providing a foundation for survival strategies under low temperature stress.

Key words：Alfalfa;Low-temperature stress;Agronomic traits;Low-temperature-induced genes

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是草食家畜重要的蛋白飼草，是世界范圍內(nèi)僅次于玉米（Zea mays L.）、大豆（Glycine max L.）和小麥（Triticum aestivum L.）的第四大最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值（7.8億～10億美元）的作物^［1-2］。2015年甘肅、內(nèi)蒙古、新疆、寧夏、黑龍江、河北等6?。▍^(qū)）的優(yōu)質(zhì)苜蓿種植面積占全國(guó)總量的89.8%^［3］。隨著我國(guó)北方寒冷地區(qū)苜蓿主栽區(qū)面積逐漸擴(kuò)大，低溫寒害嚴(yán)重影響苜蓿生長(zhǎng)并使其品質(zhì)顯著下降^［4-5］，制約著畜牧業(yè)的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。關(guān)于苜蓿中抗寒轉(zhuǎn)基因研究、秋眠性與抗寒性關(guān)系、苜蓿響應(yīng)低溫的生理生化機(jī)制等方面已經(jīng)進(jìn)行了深入探索和研究^［6］，在生長(zhǎng)早期結(jié)合抗寒基因表達(dá)，篩選具有高產(chǎn)農(nóng)藝性狀抗寒紫花苜蓿候選品種，將極大縮短育種年限，有利于加快我國(guó)抗寒苜蓿品種的選育。

植物通過(guò)合成低溫誘導(dǎo)蛋白（Low-temperature-induced protein，LTI）^［7］、積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)^［8］、提高保護(hù)酶活性等多種方式應(yīng)對(duì)低溫對(duì)細(xì)胞活性的脅迫^［9］。低溫條件下，胚胎晚期富集蛋白（Late embriogenesis abundant protein，LEA）具有維持植物膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、通過(guò)結(jié)合離子保持滲透壓平衡、保護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境和抗氧化的作用^［10］，CpLEA7轉(zhuǎn)基因擬南芥（Arabidopsis thaliana L.）^［11］、ZmLEA3過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotiana tabacum L.）低溫耐受性顯著增強(qiáng)^［12］。重金屬相關(guān)異戊二烯化植物蛋白（Heavy metal-associated isoprenylated plant protein，HIPP）通常與植物的脅迫反應(yīng)有關(guān)^［13-15］，研究表明低溫誘導(dǎo)AtHIPP26^［16］和OsHIPP41^［17］表達(dá)。海藻糖-6-磷酸合成酶（Trehalose-6-phosphate synthase，TPS）是海藻糖生物合成的關(guān)鍵酶^［19］，是冷脅迫下植物滲透調(diào)節(jié)的重要代謝途徑^［18］，蒺藜苜蓿中MtTPS響應(yīng)寒冷脅迫^［20］。另外，小麥TaTPS11在擬南芥中的異位表達(dá)可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐寒性，-2℃處理下野生型存活率僅有2%，過(guò)表達(dá)植株的存活率均達(dá)到60%以上^［21］。長(zhǎng)期低溫下植物進(jìn)入休眠保障生存^［22］，ABA誘導(dǎo)質(zhì)膜蛋白（ABA-induced plasma membrane protein，PM）作為滲透調(diào)節(jié)劑和伴侶蛋白保護(hù)植物免受脅迫傷害^［23］；細(xì)胞分裂進(jìn)程也是植物周期發(fā)育的限制性因素，后期促進(jìn)復(fù)合物/細(xì)胞周期體（Anaphase-promoting complex/Cyclosome，APC/C）能夠識(shí)別并通過(guò)26S蛋白酶體系統(tǒng)靶向降解底物^［24-25］，其遺傳失活對(duì)植物具有致死性^［26］。

本試驗(yàn)以甲基磺酸乙酯（Ethyl methanesulfonate，EMS）誘變構(gòu)建的紫花苜蓿突變?nèi)后w為材料，利用苜蓿越冬期寒冷自然響應(yīng)，測(cè)定低溫誘導(dǎo)蛋白、滲透調(diào)節(jié)關(guān)鍵基因表達(dá)、休眠與細(xì)胞發(fā)育間的關(guān)系以及與寒冷相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量，擬結(jié)合群體中篩選出優(yōu)良變異株的農(nóng)藝性狀，初步研究紫花苜蓿產(chǎn)量性狀與抗寒相關(guān)基因表達(dá)間的關(guān)系，并探索將高產(chǎn)苜蓿品種篩選與早期抗寒逆境發(fā)育相結(jié)合的可能性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究田間測(cè)定10個(gè)商業(yè)化品種紫花苜蓿出苗30 d內(nèi)日均生長(zhǎng)速度（表1），初步篩選苗期生長(zhǎng)快速的3個(gè)進(jìn)口品種‘Sardi7’‘WL363HQ’‘WL712HQ’以及本地品種‘武功’，共4個(gè)品種用于EMS誘變構(gòu)建突變體庫(kù)。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)場(chǎng)地和設(shè)計(jì) 100 mmol·L^-10.4% EMS磷酸緩沖液（pH 7.5）浸沒(méi)種子，遮光密封，搖床室溫緩慢振蕩8 h，使種子和誘變劑充分接觸。2020年9月播種于陜西省西北農(nóng)林科技大學(xué)曹新莊試驗(yàn)基地（34°29′N，108°07′E，海拔514 m，年均溫12.9℃，年降雨量660 mm），溫室內(nèi)育苗后移栽，移栽前對(duì)試驗(yàn)田進(jìn)行翻地、平整、鎮(zhèn)壓等處理。采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)小區(qū)種植面積為2 m×2 m，3～5個(gè)重復(fù)，小區(qū)間設(shè)置1 m保護(hù)行；人工條播進(jìn)行移栽，各小區(qū)種植6行，行距0.30 m，株距0.20 m。

1.2.2 紫花苜蓿突變體植株農(nóng)藝性狀測(cè)量 2021年04月12日，根據(jù)越冬后生長(zhǎng)狀況，每個(gè)品種篩選出農(nóng)藝性狀優(yōu)良的突變體單株并做標(biāo)記，用于進(jìn)一步篩選調(diào)查。2021年07月20日，分別測(cè)定標(biāo)記參試材料的株高（Plant height，PH）、葉面積（Leaf area，LA）、分枝數(shù)（Branch number，BN）、節(jié)間數(shù)（Internode number，IN）、莖粗（Stem diameter，SD）；完全成熟后按單株收獲，每株保留兩個(gè)分枝，留茬5 cm，進(jìn)行干鮮重（Dry weight，DW；Fresh weight，F(xiàn)W）等性狀的室內(nèi)考種；詳細(xì)測(cè)定項(xiàng)目及方法見(jiàn)表2。

1.2.3 紫花苜蓿突變體優(yōu)株篩選及取樣 同年冬季降溫期（最低溫度低于4℃），基于植株刈割后再生情況再次確定具有一定抗寒性的植株，從各品種標(biāo)記植株中篩選5～6株單株植株，共22株。于2021年11月11日、2021年11月24日、2021年12月08日分3次進(jìn)行田間樣品的采集。各參試單株均設(shè)3個(gè)平行重復(fù)組，每組由1～3片三出復(fù)葉組成，不包括最頂端新葉和有明顯非低溫?fù)p傷的葉片。取樣后立即置于液氮中速凍2 min，保存于—80℃，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 RNA提取和低溫誘導(dǎo)基因相對(duì)表達(dá)量測(cè)定 使用RNA提取試劑盒（Eastep Super Total RNA Extraction Kit，天根）提取植物總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fast Quant RT Kit with gDNase，天根）將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，—20℃保存?zhèn)溆?。采用瑞士羅氏480 II熒光定量PCR儀（Light Cycler 480 II PCR detection system，Roche）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)（qRT-PCR）。反應(yīng)體系（10 μL）：ChamQ SYBR qPCR Master Mix（諾唯贊）5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95℃ 300 s；循環(huán)反應(yīng)95℃ 10 s，循環(huán)45次，60℃ 30 s；熔解曲線65℃ 5 s，95℃ 5 s。用于試驗(yàn)的低溫誘導(dǎo)基因與引物序列信息見(jiàn)表3，紫花苜蓿Actin的轉(zhuǎn)錄水平用作對(duì)照，使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)并交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 用Excel 2016記錄整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 7 （GraphPad Software，USA）作圖。描述性統(tǒng)計(jì)、方差分析、相關(guān)性分析等使用SPSS Statistics 27.0（IBM Corp.，Armonk，NY，USA）和R語(yǔ)言計(jì)算。所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿突變體優(yōu)株的農(nóng)藝性狀分析

研究對(duì)供試的4個(gè)紫花苜蓿品種的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行分析評(píng)定（表4）。結(jié)果表明‘WL363HQ’生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、植株矮小，平均株高僅62.87 cm，低于平均水平15.80%；莖稈細(xì)弱且分枝數(shù)少，分別低于平均水平18.16%和18.98%；鮮重和干重分別低于平均水平54.79%和53.63%?！甒L712HQ’生長(zhǎng)狀況最好，株高在73.4～122.5 cm之間，平均株高為88.55 cm，高于平均水平18.76%；平均葉面積為1.96 mm2，高于平均水平16.98%；植株高大且葉面積大使其最終產(chǎn)量最高，平均單株鮮重和干重高于平均水平28.39%和27.93%?！甋ardi 7’的特點(diǎn)是葉片較小，平均葉面積僅有1.31 mm2，低于平均水平18.85%；但分枝數(shù)和節(jié)間數(shù)最多，高于平均水平11.42%和5.15%，植株呈現(xiàn)較為密集的長(zhǎng)勢(shì)?！涔Α旮咻^平均水平低5.02%，但鮮重和干重較大，分別高于平均水平9.94%和10.78%，這是由于其莖稈粗壯，高于平均水平12.20%，且葉面積較大，從而保證了較高的最終產(chǎn)量。

供試的紫花苜蓿種質(zhì)材料9個(gè)農(nóng)藝性狀的變異系數(shù)（Coefficient of variation，CV）范圍為10.33%～56.01%，變幅較大；植株性狀中，分枝數(shù)、葉面積的變異幅度較大，分別為39.93%和31.66%；變異系數(shù)最小的是葉長(zhǎng)寬比和節(jié)間數(shù)，分別為16.66%和18.77%。

2.2 紫花苜蓿突變體優(yōu)株的模糊隸屬函數(shù)評(píng)價(jià)

隸屬函數(shù)法是在多指標(biāo)的測(cè)定的基礎(chǔ)上對(duì)作物品種資源的耐脅迫能力進(jìn)行客觀分析評(píng)價(jià)的重要方法之一。利用公式R（Xi）=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）計(jì)算各個(gè)指標(biāo)的隸屬值，式中Xi為指標(biāo)測(cè)定值，Xmin和Xmax為所有參試材料某一指標(biāo)的最小值和最大值。通過(guò)比較22份紫花苜蓿突變體種質(zhì)材料9個(gè)農(nóng)藝性狀的隸屬值總平均值大小，最終確定其農(nóng)藝性狀排序（表5）。4個(gè)品種的生長(zhǎng)狀況從優(yōu)至劣為‘WL712HQ’＞‘武功’＞‘Sardi 7’＞‘WL363HQ’；其中712-4，WG-3，SD7-2的生長(zhǎng)狀況最好，隸屬值最高，分別為0.7629，0.6695，0.6624。

2.3 紫花苜蓿突變體優(yōu)株的低溫脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)量分析

2.3.1 低溫脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)量分析 將3個(gè)取樣時(shí)間按先后分為前期（2021年11月11日）、中期（2021年11月24日）、后期（2021年12月08日）。在持續(xù)低溫脅迫下，MsG0180000988（PYL9）表達(dá)量逐漸下降，其余6個(gè)低溫脅迫誘導(dǎo)基因均呈上調(diào)趨勢(shì)（圖1A）。PYL9表達(dá)量持續(xù)顯著下降（P＜0.05），中期較前期表達(dá)量下降了84.16%，后期較中期表達(dá)量繼續(xù)下降了85.51%。MsG0180003510（HIPP）表達(dá)量持續(xù)上調(diào)，中期較前期表達(dá)量提高4.8倍，后期較中期表達(dá)量繼續(xù)顯著提高98.4倍（P＜0.05）。MsG0880043140（APC）和MsG0880047253（LEA）進(jìn)入后期表達(dá)量分別較中期顯著上調(diào)37.4倍和39.4倍（P＜0.05）；APC總體顯著上調(diào)22.1倍，LEA顯著上調(diào)6.8倍（P＜0.05）。MsG0180005449（LTI）后期上調(diào)6.1倍，總體上調(diào)3.1倍。MsG0880047531 （TPS）和MsG0180005121（PM）中期時(shí)分別上調(diào)9.3倍和5.5倍，后期逐漸恢復(fù)到前期水平；總體上TPS表達(dá)量基本不變，PM上調(diào)2.8倍。

‘WL363HQ’‘WL712HQ’和‘武功’3個(gè)品種苜蓿突變?nèi)后w的低溫脅迫誘導(dǎo)基因在低溫脅迫下響應(yīng)迅速，但‘Sardi7’的低溫脅迫誘導(dǎo)基因響應(yīng)較弱（圖1B-C）。進(jìn)入12月后，‘WL712HQ’‘Sardi7’和‘武功’中TPS和PM表達(dá)量下降，其余5個(gè)基因表達(dá)情況較中期增強(qiáng)（圖1D）；‘WL363HQ’中HIPP持續(xù)響應(yīng)，其余低溫脅迫誘導(dǎo)基因基本不響應(yīng)。HIPP在各品種中持續(xù)響應(yīng)且上調(diào)，PYL9表達(dá)量則響應(yīng)較弱且下降；‘WL712HQ’的低溫脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)量總體逐漸提高，‘WL363HQ’‘Sardi7’和‘武功’總體逐漸下降。

2.3.2 最佳突變體優(yōu)株的低溫脅迫誘導(dǎo)基因相對(duì)表達(dá)量分析 紫花苜蓿優(yōu)株突變體中，根據(jù)隸屬函數(shù)分析結(jié)果，農(nóng)藝性狀表現(xiàn)最好的單株依次為712-4，WG-3，SD7-2，低溫脅迫誘導(dǎo)基因在這3株中的表達(dá)情況見(jiàn)圖2。712-4中HIPP表達(dá)量最高（126.19），LEA，APC，PM，TPS的表達(dá)量也較高，分別為18.44，14.55，10.97，9.66（圖2A）。WG-3中HIPP表達(dá)量最高（32.15），其次為TPS（4.47）和PM（3.85）（圖2B）。SD7-2中低溫脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)差異均不顯著，TPS表達(dá)量最高，為0.60；LTI表達(dá)量其次，為0.49（圖2C）。

2.3.3 同源基因蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域不同在表達(dá)量上的差異 LEA是生物體中廣泛存在的一類與滲透調(diào)節(jié)有關(guān)的家族蛋白，具有高親水性和熱穩(wěn)定性，在胚胎發(fā)育后期廣泛表達(dá)于植物根、莖、葉等組織以及種子中。紫花苜蓿MsG0880047253被預(yù)測(cè)為蒺藜苜蓿Medtr4g123950（LEA3）的同源基因，二者表達(dá)模式類似、功能相近，但在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域上存在一定差異（圖3A）；Medtr4g123950的保守結(jié)構(gòu)域包含PTZ00121超家族的唯一成員CL31754，MsG0880047253中則包含PTZ00456超家族的CL40706。持續(xù)低溫脅迫下Medtr4g123950在4個(gè)紫花苜蓿品種中表達(dá)量均較低（圖3B），在‘WL363HQ’，‘WL712HQ’和‘Sardi 7’中表達(dá)量均不超過(guò)1，在‘武功’中表達(dá)量略高，為1.43。‘WL712HQ’和‘武功’中MsG0880047253表達(dá)水平較高，分別為32.97和5.33，與Medtr4g123950的表達(dá)量差異極顯著（P＜0.01）。

2.3.4 低溫脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)量的模糊隸屬函數(shù)評(píng)價(jià) 將低溫脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)量作為抗寒種質(zhì)的篩選依據(jù)，HIPP，LEA，TPS和PM在隸屬函數(shù)分析中排位最高（表6），對(duì)篩選具有較高抗寒性的紫花苜蓿優(yōu)質(zhì)種質(zhì)材料有著重要的意義。

2.3.5 低溫脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)量的主成分分析 對(duì)22份紫花苜蓿突變體種質(zhì)材料的7個(gè)低溫脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)量進(jìn)行主成分分析，計(jì)算其特征值的方差貢獻(xiàn)率和累積貢獻(xiàn)率，并根據(jù)累積貢獻(xiàn)率≥85%的原則提取主成分個(gè)數(shù)。本研究共取得3個(gè)主成分Y1，Y2，Y3（表7），其對(duì)應(yīng)的方差貢獻(xiàn)率分別為53.3%，25.1%和13.67%；以上3個(gè)主成分的累積貢獻(xiàn)率為91.95%，基本包含了所測(cè)紫花苜蓿突變體種質(zhì)材料低溫脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)量的全部信息。其中Y1包含APC，LEA，HIPP和LTI，Y2包含TPS和PM，Y3主要是由PYL9構(gòu)成。主成分表達(dá)式中各因子系數(shù)的大小可以反映因子對(duì)該主成分的貢獻(xiàn)大小，在主成分分析中，一般認(rèn)為大于0.3的載荷就是顯著的。從因子載荷系數(shù)表（表8）可以看出，第一主成分中APC表達(dá)量的系數(shù)大于其他因子，第二主成分中TPS的系數(shù)較大。

2.4 紫花苜蓿農(nóng)藝性狀及低溫脅迫誘導(dǎo)基因相關(guān)性

2.4.1 農(nóng)藝性狀相關(guān)性分析 在農(nóng)藝性狀中產(chǎn)量性狀組及植株性狀組組間進(jìn)行相關(guān)分析，性狀間的相關(guān)系數(shù)反映了各性狀與產(chǎn)量以及每?jī)蓚€(gè)性狀間的關(guān)聯(lián)性，圖4為紫花苜蓿9個(gè)農(nóng)藝性狀間的相關(guān)性。株高、分枝數(shù)、莖粗3個(gè)性狀與干、鮮重間極顯著正相關(guān)（P＜0.01），分枝數(shù)和莖粗與株高間也分別存在極顯著（P＜0.01）或顯著（P＜0.05）正相關(guān)關(guān)系。葉片形狀（長(zhǎng)寬比、葉面積）與其他性狀間沒(méi)有顯著的相關(guān)性，但莖粗與葉面積之間為顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），莖粗可能通過(guò)增加葉片生物量提高紫花苜蓿最終產(chǎn)量。但由于各性狀間存在一定的相關(guān)關(guān)系，單靠與其產(chǎn)量的相關(guān)系數(shù)來(lái)判別貢獻(xiàn)大小，不能從本質(zhì)上揭示其內(nèi)部的聯(lián)系規(guī)律，容易忽略各性狀間的互作效應(yīng)。

2.4.2 低溫脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)量相關(guān)性分析 前期（圖5A），4個(gè)低溫脅迫誘導(dǎo)基因APC，TPS，LEA，PM表達(dá)量間互相影響，存在極顯著（P＜0.01）或顯著（P＜0.05）正相關(guān)關(guān)系；APC，TPS，LEA表達(dá)量間互為顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），PM表達(dá)量和APC，TPS，LEA表達(dá)量間都呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）；HIPP表達(dá)量和APC表達(dá)量呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。中期（圖5B），APC，TPS，PM表達(dá)量間依舊存在顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）正相關(guān)關(guān)系；APC表達(dá)量和TPS，PM表達(dá)量顯著正相關(guān)，TPS表達(dá)量和PM表達(dá)量間為極顯著正相關(guān)關(guān)系；HIPP表達(dá)量和LTI，PM表達(dá)量顯著正相關(guān)，與TPS表達(dá)量極顯著正相關(guān)；PYL9表達(dá)量和APC，TPS，PM表達(dá)量間存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。后期（圖5C）由于各基因表達(dá)量較低，互相間都呈極顯著正相關(guān)關(guān)系。

3個(gè)低溫脅迫誘導(dǎo)基因APC，TPS，PM表達(dá)量在不同時(shí)期都互相呈極顯著（P＜0.01）或顯著（P＜0.05）正相關(guān)關(guān)系，在各個(gè)時(shí)期協(xié)同表達(dá)；這3個(gè)低溫脅迫誘導(dǎo)基因在前期與LEA的表達(dá)正相關(guān)，在中期與PYL9的表達(dá)負(fù)相關(guān)。HIPP在前期正向影響APC的表達(dá)，中期與LTI，TPS，PM的表達(dá)正相關(guān)。

2.4.3 農(nóng)藝性狀與低溫脅迫誘導(dǎo)基因間相關(guān)性分析 農(nóng)藝性狀和低溫脅迫誘導(dǎo)基因表達(dá)量間存在一定的相關(guān)性（表9）。干鮮重與APC和PM間顯著正相關(guān)（P＜0.05）；莖粗與多個(gè)低溫脅迫誘導(dǎo)基因LEA，APC，HIPP，PM顯著（P＜0.05）或極顯著（P＜0.01）正相關(guān)；分枝數(shù)與LEA極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），和PM顯著正相關(guān)（P＜0.05）；節(jié)間數(shù)與LEA顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

3 討論

植物普遍存在生長(zhǎng)-防御拮抗機(jī)制（Growth-defense trade-off）^［27］，抗性的提高往往會(huì)影響產(chǎn)量^［28-30］；如何在苜蓿生長(zhǎng)與抗逆之間取得平衡，是抗寒苜蓿品種高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)（抗逆）育種的重要科學(xué)問(wèn)題。

3.1 優(yōu)質(zhì)抗寒紫花苜蓿植株的農(nóng)藝性狀與基因表達(dá)特征

植物增強(qiáng)耐冷性的冷馴化過(guò)程通常伴隨著各種生理生化變化，以及復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制^［31］；植物在面對(duì)低溫脅迫時(shí)，大量低溫響應(yīng)基因被誘導(dǎo)表達(dá)并啟動(dòng)低溫應(yīng)答^{［7，32-34］}，而非單個(gè)或少數(shù)基因調(diào)控。在篩選出的22株供試紫花苜蓿突變體優(yōu)株群體中，植株高大、莖桿粗壯、枝葉繁茂是其主要農(nóng)藝性狀特征，或可作為高產(chǎn)苜蓿的篩選特征；分枝數(shù)和葉量作為牧草產(chǎn)量的衡量依據(jù)，其廣泛的變異為篩選產(chǎn)量較高的抗寒苜蓿種質(zhì)提供了豐富的材料來(lái)源。低溫脅迫誘導(dǎo)群體中MsG0180003510（HIPP），MsG0880047253（LEA），MsG0880047531（TPS），MsG0180005121（PM）的高表達(dá)，其中TPS，LEA，HIPP起主導(dǎo)作用。在3株農(nóng)藝性狀最佳的優(yōu)株突變體單株中，HIPP和TPS也均表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平，表明HIPP和TPS基因能夠在維持苜蓿理想農(nóng)藝性狀的同時(shí)，賦予植株抵御低溫脅迫的抗性。此外，LEA和PM與紫花苜蓿突變體優(yōu)株的農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)緊密：LEA與植株的莖粗、分枝數(shù)和節(jié)間數(shù)間存在正相關(guān)關(guān)系，但對(duì)最終產(chǎn)量并無(wú)明顯影響；PM則可以直接通過(guò)影響紫花苜蓿的莖粗和分枝數(shù)，最終提高植株的產(chǎn)量。

3.2 低溫脅迫誘導(dǎo)基因與農(nóng)藝性狀存在潛在調(diào)控關(guān)系

LEA蛋白家族在植物低溫脅迫的響應(yīng)中起到重要作用^［35-36］，ABA可以顯著誘導(dǎo)LEA的表達(dá)，通過(guò)促進(jìn)LEA蛋白和脯氨酸的積累保護(hù)植物免受干旱脅迫^［37］。本研究中LEA與PM在表達(dá)量上存在正相關(guān)關(guān)系且均影響植株的莖粗和分枝數(shù)，可能證明了脅迫下ABA對(duì)LEA的調(diào)控作用。此外，紫花苜蓿中蒺藜苜蓿Medtr4g123950及其同源基因MsG0880047253的表達(dá)量存在顯著差異，說(shuō)明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的不同可能導(dǎo)致同源基因的差異表達(dá)，在采用異位表達(dá)的相關(guān)研究時(shí)尤其需要注意。TPS參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)^［38］，過(guò)表達(dá)ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游轉(zhuǎn)錄因子ScAREB4可以誘導(dǎo)TPS9表達(dá)，提高TPS酶活性并積累海藻糖^［31］。本研究表明TPS在表達(dá)上與PM協(xié)同作用、關(guān)系緊密，同時(shí)也與LEA存在正相關(guān)關(guān)系，三者可能都是通過(guò)ABA通路的作用對(duì)植物的抗寒性產(chǎn)生影響，TPS則通過(guò)LEA與PM間接對(duì)紫花苜蓿在低溫脅迫下的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。

DNA復(fù)制過(guò)程決定著基因組的穩(wěn)定性，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育^［39］。APC/Cs是細(xì)胞周期進(jìn)程和植物生長(zhǎng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，可能將細(xì)胞周期進(jìn)程與環(huán)境信號(hào)傳導(dǎo)聯(lián)系起來(lái)^［26］，其基因表達(dá)水平在水稻高增殖率的組織中更高^［40］。在紫花苜蓿突變體優(yōu)株群體中，APC在表達(dá)上與TPS和PM協(xié)同作用、關(guān)系緊密，同時(shí)也與LEA存在正相關(guān)關(guān)系；TPS，PM和LEA可能通過(guò)影響APC的表達(dá)，對(duì)紫花苜蓿的細(xì)胞周期進(jìn)程產(chǎn)生間接影響。此外APC可能與ABA通路存在間接關(guān)聯(lián)，其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

HIPP在本研究中表現(xiàn)出了對(duì)突變體植株耐寒性和農(nóng)藝性狀的促進(jìn)作用，推測(cè)可能通過(guò)其他通路間接影響紫花苜蓿低溫脅迫下的生長(zhǎng)；多樣化的HIPP家族生物學(xué)功能尚不明晰^［41］，其在苜蓿應(yīng)對(duì)低溫脅迫中的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。低溫脅迫還誘導(dǎo)ABA通路中的PYL9表達(dá)持續(xù)下調(diào)，過(guò)表達(dá)PYL9會(huì)使植物對(duì)ABA高度敏感^［42］，其表達(dá)的下調(diào)可以解除ABA對(duì)植株生長(zhǎng)的抑制，從而使突變體優(yōu)株在抗寒的同時(shí)表現(xiàn)出較好的農(nóng)藝性狀，這可能是紫花苜蓿中平衡生長(zhǎng)-防御拮抗機(jī)制的關(guān)鍵基因。

低溫下保障植物的生產(chǎn)性能，一直是寒地苜蓿品種選育的關(guān)鍵^［43］。低溫下苜蓿生長(zhǎng)發(fā)育的差異及后期的表型分離，影響著高產(chǎn)抗寒候選種質(zhì)在生長(zhǎng)早期的篩選，確定并篩選出優(yōu)良種質(zhì)周期長(zhǎng)、成本高。研究初步分析發(fā)現(xiàn)結(jié)合早期抗寒基因表達(dá)，可實(shí)現(xiàn)在保障生產(chǎn)性能的同時(shí)篩選抗寒苜蓿品種，為后續(xù)借助現(xiàn)代表型組學(xué)與分子生物技術(shù)，在篩選早期實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)苜蓿品種抗寒性無(wú)損分析及鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

優(yōu)質(zhì)抗寒苜蓿突變體植株表型表現(xiàn)為植株高大、莖桿粗壯、分枝數(shù)多、葉面積大，同時(shí)在分子水平上MsG0180003510（HIPP），MsG0880047253（LEA），MsG0880047531（TPS）和MsG0180005121（PM）基因的表達(dá)水平較高。研究揭示了苜蓿中低溫誘導(dǎo)基因表達(dá)與主要農(nóng)藝性狀的相關(guān)性。具有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的植株結(jié)合其低溫誘導(dǎo)基因HIPP，LEA，TPS和PM的高水平表達(dá)，可作為生長(zhǎng)早期高產(chǎn)耐寒苜蓿品種選擇的預(yù)測(cè)因子。此外ABA通路中的PYL9在低溫脅迫誘導(dǎo)下持續(xù)下調(diào)，可以解除ABA對(duì)植株生長(zhǎng)的抑制，可能是紫花苜蓿中平衡抗性與生長(zhǎng)的關(guān)鍵基因。通過(guò)闡明低溫脅迫誘導(dǎo)基因與農(nóng)藝性狀之間的調(diào)控機(jī)制，不僅為紫花苜蓿在低溫脅迫下的生存策略提供了依據(jù)，也為培育優(yōu)良抗逆性紫花苜蓿提供了可能。

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（責(zé)任編輯 閔芝智）