基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選蒙古冰草抗旱相關(guān)基因

收稿日期：2024-03-20；修回日期：2024-04-29

基金項(xiàng)目：內(nèi)蒙古自治區(qū)種業(yè)科技創(chuàng)新重大示范工程“揭榜掛帥”項(xiàng)目（2022 JBGS0014）；財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-34）資助

作者簡(jiǎn)介：

樊璐（1997-），女，漢族，內(nèi)蒙古包頭人，碩士研究生，主要從事牧草種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用及植物抗逆基因挖掘研究，E-mail：f1915213249@163.com;*通信作者Author for correspondence，E-mail：zhaowei@haust.edu.cn；wangxuemin@caas.cn

摘要：為挖掘蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng）抗旱相關(guān)基因并探究蒙古冰草響應(yīng)干旱脅迫分子機(jī)制，本研究以蒙古冰草為材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。首先將不同生長(zhǎng)期及干旱脅迫處理后的盆栽蒙古冰草組織按照根、莖、葉、花（穗）4類分別進(jìn)行混樣并利用三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)建立蒙古冰草轉(zhuǎn)錄本參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得26 027條轉(zhuǎn)錄本，包含25 578個(gè)基因，利用BlastX在KEGG，KOG，Nr，Swissprot等數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)注釋，共有25 453個(gè)轉(zhuǎn)錄本得到注釋。其次利用二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)干旱脅迫處理前后水培蒙古冰草幼苗進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫處理2 h，6 h后與處理前相比分別有2669個(gè)，3668個(gè)差異表達(dá)基因。此外，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組及熒光定量PCR驗(yàn)證結(jié)果，發(fā)現(xiàn)基因ERF053，ERF055，NAC100，bZIP23，ERF5和NAM-B1在干旱處理后表達(dá)量較高且均上調(diào)可能是抗旱調(diào)控關(guān)鍵基因，為后續(xù)蒙古冰草抗旱相關(guān)候選基因克隆及功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：蒙古冰草；干旱；三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組；二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；轉(zhuǎn)錄因子

中圖分類號(hào)：S543.9""" 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A"""" 文章編號(hào)：1007-0435（2024）11-3344-14

Screening Genes Related to Drought Resistance in Agropyron mongolicum

Keng Based on Transcriptome

FAN Lu^1，2， TANG Jun2， MA Lin2， ZHANG Zhi-peng2， JIANG Qing-xue2，

LIE Ren-cuo3， MA Qiao-ling3， WANG Xue-min^2*， ZHAO Wei^1*

（1.College of Agriculture， Henan University of Science and Technology， Luoyang， Henan Province 471000， China;

2.Institute of Animal Sciences of Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China;

3.Qinghai Sanjiang Group Co.， LTD， Xining， Qinghai Province 810100， China）

Abstract：To dig drought-resistant genes and explore the molecular mechanism of Agropyron mongolicum Keng responding to drought stress，transcriptome analysis was carried out in this study using Agropyron mongolicum Keng as the material. In this study，the transcriptome sequencing was performed on Agropyron mongolicum Keng seedlings in pots during different growth periods and after drought stress treatment according to the four categories of roots，stems，leaves and flowers （spikes），and the reference sequence database of Agropyron mongolicum Keng was established by third-generation full-length transcriptome sequencing technology，which obtained a total of 26 027 transcripts，containing 25 578 genes. BlastX was used to compare the annotations in KEGG，KOG，Nr，Swissprot and other databases，using BlastX，25 453 transcripts were annotated. Secondly，the second-generation transcriptome sequencing technology was used to sequence the differentially expressed genes in hydroponically grown Agropyron mongolicum Keng seedlings before and after drought stress treatment，compared with before treatment，2669 and 3668 differentially expressed genes were detected after 2-hour and 6-hour drought stress treatment，respectively. In addition，based on transcriptome analysis and qRT-PCR validation results，the genes ERF053，ERF055，NAC100，bZIP23，ERF5，and NAM-B1 were found to have higher and up-regulated expression after drought treatment，which may be the key genes of drought regulation，and this lays a foundation for the subsequent cloning and functional validation of the drought-related candidate genes in Agropyron mongolicum Keng.

Key words：Agropyron mongolicum Keng;Drought;Third-generation full-length transcriptome sequencing;Second-generation transcriptome sequencing;Transcription factor

干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育最重要的非生物脅迫之一，可導(dǎo)致植物水平衡被直接或間接破壞，最終萎蔫或枯死。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)干旱半干旱地區(qū)約占國(guó)土面積的48%^［1］，占總耕地面積的51%^［2］，培育耐旱作物是利用干旱、半干旱土地的有效方法之一^［3］。蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng），又稱沙蘆草，禾本科（Gramingae）冰草屬（Agropyron Gaertn）異花授粉二倍體（2n=2x=14，PP），具有耐旱、耐寒、適口性好等特點(diǎn)，是一種優(yōu)質(zhì)的多年生牧草。主要分布于我國(guó)陜西、寧夏、內(nèi)蒙古、新疆、甘肅和山西等地^［4-6］，常作為伴生成分在干草原和荒漠草原等典型沙質(zhì)環(huán)境中出現(xiàn)，具有重要的飼用價(jià)值、遺傳價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。目前該物種已被列為國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生植物，在我國(guó)北方草地畜牧業(yè)及生態(tài)環(huán)境建設(shè)中具有十分重要的作用。因此鑒定并了解蒙古冰草干旱耐受機(jī)制對(duì)保護(hù)生態(tài)環(huán)境、指導(dǎo)選育抗旱冰草品種具有現(xiàn)實(shí)意義^［7］。

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factors，TFs）是一種可與真核生物基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用元件特異結(jié)合的蛋白，是植物中最重要的一類調(diào)節(jié)基因。根據(jù)結(jié)合DNA結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，將轉(zhuǎn)錄因子分為若干家族，如WRKY，AP2/EREBP，NAC，MYB，bZIP等^［8-12］。轉(zhuǎn)錄因子在植物非生物脅迫響應(yīng)過程中起著關(guān)鍵作用，了解蒙古冰草響應(yīng)干旱脅迫的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)培育抗旱品種、改善生態(tài)環(huán)境具有重要意義^［13］。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA sequencing，RNA-Seq）是利用高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)cDNA進(jìn)行測(cè)序的技術(shù)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及農(nóng)學(xué)等領(lǐng)域。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，可以對(duì)植物響應(yīng)逆境脅迫所有轉(zhuǎn)錄本變化進(jìn)行全面的分析，快速精準(zhǔn)地得到目的轉(zhuǎn)錄本序列及表達(dá)信息。因此，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)挖掘植物抗逆基因，明確植物對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)機(jī)制是一種理想的研究手段^［2］。目前干旱、鹽害及旱鹽復(fù)合脅迫等非生物脅迫對(duì)植物影響的研究多集中在小麥（Triticum aestivum L.）、玉米（Zea mays L.）等大宗作物上^［14］，在牧草植物方面的研究相對(duì)較少，在蒙古冰草這一重要牧草資源非生物脅迫方面更是鮮有研究^［4］；對(duì)蒙古冰草抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的研究除了在WRKY，bHLH，NAC，ERF，MYB等轉(zhuǎn)錄因子方面已有進(jìn)展，在其他轉(zhuǎn)錄因子方面尚無(wú)系統(tǒng)全面的介紹^［15-18］。

本研究通過三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序建立蒙古冰草轉(zhuǎn)錄本參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)，并以此為參對(duì)蒙古冰草干旱處理前后轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行測(cè)定，從而完成對(duì)蒙古冰草響應(yīng)干旱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的分析鑒定。通過對(duì)干旱脅迫處理下的水培蒙古冰草幼苗進(jìn)行表型觀測(cè)、生理指標(biāo)測(cè)定、差異表達(dá)基因篩選、差異表達(dá)基因GO功能富集和KEGG代謝通路富集分析、熒光定量PCR驗(yàn)證等篩選出蒙古冰草抗旱相關(guān)候選基因，從而為蒙古冰草抗旱相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的篩選及作用機(jī)制的研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗(yàn)供試材料為蒙古冰草（Agropyron mongolicum Keng），種子由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院趙彥教授惠贈(zèng)。

1.2 種子萌發(fā)及培養(yǎng)

挑選籽粒飽滿、大小一致的蒙古冰草種子置于放有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿置于室內(nèi)培養(yǎng)箱（溫度24℃，濕度75%，光強(qiáng)110 μmol·m^-2·s^-1，光周期16 h）中進(jìn)行水培生長(zhǎng)，為后續(xù)培養(yǎng)三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所需的盆栽苗及干旱脅迫處理、二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所需的水培苗做準(zhǔn)備。

1.3 三代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析

待培養(yǎng)皿中種子萌發(fā)，選取長(zhǎng)勢(shì)良好的蒙古冰草幼苗移栽入營(yíng)養(yǎng)土蛭石比例為1∶1的土壤中進(jìn)行盆栽培養(yǎng)，并將植株置于溫度22℃～25℃、濕度70%～80%、光周期16 h的人工智能溫室正常生長(zhǎng)，并分別在植株幼苗期、成熟期、開花期、開花期結(jié)束等不同時(shí)期對(duì)同株蒙古冰草的根、莖、葉、花（穗）等不同部位進(jìn)行取樣；待盆栽冰草整個(gè)生長(zhǎng)期取樣結(jié)束，用20%的PEG-2000對(duì)整棵植株進(jìn)行模擬干旱脅迫處理，并在干旱脅迫處理2 h，6 h后對(duì)植株不同部位進(jìn)行取樣；將取下的樣品迅速置于液氮中，用研缽充分研磨成粉末，按照根、莖、葉、花（穗）4類將不同生長(zhǎng)期及干旱脅迫處理后的樣品粉末進(jìn)行混合并交由基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行RNA提取及質(zhì)檢，質(zhì)檢合格后，使用美國(guó)太平洋生物技術(shù)公司（Pacific Biosciences）Sequel測(cè)序系統(tǒng)對(duì)根、莖、葉、花（穗）4個(gè)樣本RNA混合后得到的總樣本進(jìn)行第三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。使用SMRT Link V8.0.0^［19］對(duì)Sequel2產(chǎn)生的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從下機(jī)后數(shù)據(jù)中提取出高質(zhì)量環(huán)型一致性序列（Circular consensus sequence，CCS）并進(jìn)行引物、barcode、poly（A）和連環(huán)結(jié)構(gòu)的移除得到全長(zhǎng)非嵌合序列（fulllength non-concatemer，F(xiàn)LNC reads），對(duì)相似的FLNC reads進(jìn)行聚類合并，得到完整的isoform，從而得到樣本全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，對(duì)得到的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行基因功能注釋和結(jié)構(gòu)分析，從而建立蒙古冰草全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.4 干旱脅迫處理

選取培養(yǎng)皿中發(fā)芽時(shí)間一致的蒙古冰草幼苗移入已提前準(zhǔn)備好的96孔板中，將96孔板置于培養(yǎng)皿中用營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水培并定期更換營(yíng)養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿置于溫度24℃、濕度75%、光強(qiáng)110 μmol·m^-2·s^-1、光周期16 h的室內(nèi)光照培養(yǎng)箱中正常生長(zhǎng)，待幼苗生長(zhǎng)至三葉一心期時(shí)用20%的PEG-2000對(duì)蒙古冰草幼苗進(jìn)行模擬干旱脅迫處理，在干旱脅迫處理0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，12 h，24 h，36 h，48 h，72 h后對(duì)葉片形態(tài)、顏色等表型進(jìn)行觀察并取樣^［20］，根據(jù)表型最終用0 h，2 h，4 h，6 h四個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品進(jìn)行生理指標(biāo)測(cè)定，0 h，2 h，6 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.5 生理指標(biāo)測(cè)定

將干旱脅迫處理0 h，2 h，4 h，6 h取下的三葉一心期蒙古冰草葉片迅速置于液氮中用研缽充分研磨成粉末，按照每管0.1 g分裝于2 mL EP管中，使用索萊寶活性檢測(cè)試劑盒對(duì)干旱處理0 h（CK），2 h（D2），4 h（D4），6 h（D6）后樣品過氧化氫酶（Catalase，CAT）、脯氨酸（Proline，Pro）、過氧化物酶（Peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、植物可溶性糖等生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)重復(fù)^［21］。

1.6 二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序RNA提取及cDNA文庫(kù)構(gòu)建

使用上海普洛麥格RNA提取試劑盒對(duì)干旱脅迫處理0 h（CK），2 h（D2），6 h（D6）3個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品進(jìn)行總RNA提取，用瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)RNA的完整性及是否受到DNA污染進(jìn)行檢驗(yàn)，將條帶邊界清晰完整沒有明顯彌散拖尾的RNA用干冰送往廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行后續(xù)的文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序。通過帶有Oligo（dT）的磁珠富集具有poly（A）尾巴的真核mRNA后用超聲波將mRNA打斷；用隨機(jī)寡核苷酸做引物，在M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶體系中將片段化的mRNA模板反轉(zhuǎn)為cDNA第一條鏈，隨后用RNaseH對(duì)RNA鏈進(jìn)行降解，并以dNTPs為原料在DNA polymerase I體系下合成cDNA第二條鏈；對(duì)純化后的雙鏈cDNA進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，用AMPure XP beads篩選出200 bp左右的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并再次使用AMPure XP beads對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，最終得到cDNA文庫(kù)^［22］，完成Illumina Nova測(cè)序系統(tǒng)進(jìn)行二代有參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所需文庫(kù)的構(gòu)建。

1.7 二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)分析

使用fastp^［23］過濾掉下機(jī)后原始數(shù)據(jù)中含adapter、含N比例大于10%、全部都是A堿基、質(zhì)量值Q≤20的堿基數(shù)占整條read 50%以上的低質(zhì)量reads得到clean reads（原始數(shù)據(jù)已上傳至GSA公共數(shù)據(jù)庫(kù)https：//ngdc.cncb.ac.cn/gsa/，登錄號(hào)CRA016178）。以三代測(cè)序所得轉(zhuǎn)錄本（isoform）作為參考，用RSEM進(jìn)行序列比對(duì)定量，統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本中基因檢測(cè)情況，將二代測(cè)序reads比對(duì)到isoform獲得各轉(zhuǎn)錄本豐度并在各大數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)得到基因注釋信息^［24］。

以｜log2（fc）｜＞1（fold change，fc），pvalue≤0.05，F(xiàn)DR≤0.05等為條件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，對(duì)篩選到的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集及KEGG代謝通路富集分析^［25］，根據(jù)富集分析結(jié)果、基因在不同處理時(shí)間點(diǎn)均發(fā)生響應(yīng)、屬于TF家族、發(fā)生響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子家族中所含基因數(shù)量排名及其他物種中已有研究的干旱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行綜合分析，初步篩選出蒙古冰草抗旱相關(guān)候選基因。

1.8 qRT-PCR驗(yàn)證與候選基因篩選

在全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢出候選基因全部轉(zhuǎn)錄本的預(yù)測(cè)CDS序列并進(jìn)行序列比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，按照定量引物設(shè)計(jì)原則運(yùn)用AlleleID 6.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，（見表1，表中僅對(duì)最終所選基因所用引物進(jìn)行了展示），查詢文獻(xiàn)所用內(nèi)參，委托生工生物公司進(jìn)行引物合成；使用諾唯贊公司提供的反轉(zhuǎn)錄試劑盒（HiScript III All-in-one RT SuperMix Perfect for qPCR）對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序返還樣品進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄所得cDNA稀釋至100 ng·μL^-1作為模板儲(chǔ)存于-20℃冰箱中備用；使用諾唯贊熒光定量試劑盒（Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix）進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，檢驗(yàn)反轉(zhuǎn)模板及所設(shè)引物是否合格^［26］。

使用ABI Q7 Flex 384孔熒光定量PCR儀，以β-Actin為內(nèi)參，參照諾唯贊熒光定量試劑盒（Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix）說明書，按10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，3個(gè)技術(shù)重復(fù)。通過QuantStudio軟件根據(jù)擴(kuò)增曲線、熔解曲線等對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選，最終采用2^-ΔΔCt法對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算并與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行對(duì)比完成對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性的檢驗(yàn)，并以表達(dá)量上調(diào)、差異倍數(shù)大于2為條件篩選出蒙古冰草抗旱相關(guān)候選基因^［27］。

1.9 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2020對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，運(yùn)用SPSS 27.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析^［25］。使用GraphPad Prism 8制圖，在基迪奧生物信息云平臺(tái)（www.omicsmart.com）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集、KEGG代謝途徑富集分析并繪圖^［28］。

2 結(jié)果與分析

2.1 三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序建立冰草參考基因組

2.1.1 三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組RNA樣品準(zhǔn)備及測(cè)序質(zhì)量評(píng)價(jià) 經(jīng)基迪奧生物公司對(duì)三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組樣品進(jìn)行RNA提取及質(zhì)量檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組樣品RNA濃度及質(zhì)量達(dá)到公司A類等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（滿足建庫(kù)測(cè)序要求且總量滿足2次或2次以上建庫(kù)需要），可上機(jī)進(jìn)行后續(xù)分析。選取轉(zhuǎn)錄本在零模波導(dǎo)孔（zero-mode waveguides，ZMW）中循環(huán)數(shù)（full passes）大于等于1的序列開展CCS分析獲得環(huán)型一致性序列（Circular consensus sequence，CCS）166 617條，通過Isoseq3.1軟件對(duì)獲得的高精確度CCS reads進(jìn)行全長(zhǎng)非嵌合序列（fulllength non-concatemer，F(xiàn)LNC reads）鑒定，用Minimap2對(duì)相似的FLNC reads進(jìn)行聚類分析得到一致性序列（Unpolished Consensus Isoforms）并利用Quiver算法對(duì)一致性序列進(jìn)行校正，最終根據(jù)輸出的序列準(zhǔn)確度分別得到高、低質(zhì)量序列31 607條和160條（高質(zhì)量序列預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度≥0.99，低質(zhì)量序列預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度lt;0.99），使用軟件cd-hit-v4.6.7對(duì)Reads聚類和校正之后得一致性序列進(jìn)行去冗余，將相似度在99%以上的序列合并，最終得到26 027個(gè)轉(zhuǎn)錄本，總長(zhǎng)度60 739 526 bp，其中最大的轉(zhuǎn)錄本序列長(zhǎng)度為8281 bp，最小的轉(zhuǎn)錄本序列長(zhǎng)度為136 bp，平均長(zhǎng)度2333.71，N50為2594 bp，GC含量50.71%。

2.1.2 三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組基因功能注釋 利用BlastX將篩選后得到的26 027條非冗余轉(zhuǎn)錄本序列在KEGG，KOG，Nr，Swissprot等數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)注釋，共有25 453個(gè)轉(zhuǎn)錄本得到注釋，占總數(shù)的97.79%，其中在Nr數(shù)據(jù)庫(kù)得到注釋的轉(zhuǎn)錄本最多，有25 403個(gè)，占比達(dá)97.60%，在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)、SwissProt數(shù)據(jù)庫(kù)、KOG數(shù)據(jù)庫(kù)中各有25 157個(gè)、21 239個(gè)、16 963個(gè)轉(zhuǎn)錄本得到注釋，占比分別為96.66%，81.60%和65.17%。（見表2）

如圖1所示，在26 027個(gè)基因中，有16 231個(gè)轉(zhuǎn)錄本在KEGG，KOG，Nr，Swissprot四個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均被成功注釋，在所有被注釋的轉(zhuǎn)錄本中僅由Nr數(shù)據(jù)庫(kù)注釋成功的轉(zhuǎn)錄本有218個(gè)，僅由KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋成功的轉(zhuǎn)錄本有30個(gè)，僅由KOG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋成功的轉(zhuǎn)錄本有3個(gè)，僅由Swissprot數(shù)據(jù)庫(kù)注釋成功的轉(zhuǎn)錄本有6個(gè)。

2.2 干旱脅迫處理及生理指標(biāo)測(cè)定

2.2.1 干旱脅迫處理下蒙古冰草幼苗表型 干旱脅迫會(huì)嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，如圖2所示，在20%的PEG-2000溶液干旱脅迫處理下，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，干旱脅迫處理開始幼苗葉片立刻發(fā)生萎蔫，2 h后幼苗葉片變軟下垂，2—24 h葉片逐漸變黃，24 h后葉片顏色明顯變暗，48 h后葉片顏色發(fā)灰且蜷縮變干，到72 h幼苗葉片變?yōu)橥耆捎矤顟B(tài)。

2.2.2 干旱脅迫處理下蒙古冰草幼苗生理指標(biāo)變化 干旱對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝等多種生物過程具有不利影響，植物能夠通過預(yù)防、減少或修復(fù)損傷等生理功能來(lái)響應(yīng)干旱脅迫。干旱脅迫下，植物細(xì)胞原有的活性氧自由基清除系統(tǒng)動(dòng)態(tài)平衡會(huì)被過度累積的活性氧自由基打破，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞膜過氧化、質(zhì)膜透性增加最終引起代謝紊亂甚至細(xì)胞死亡。CAT（過氧化氫酶）能夠有效清除H2O2，對(duì)于維持活性氧清除系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)平衡具有重要作用；SOD（超氧化物歧化酶）能催化超氧化物陰離子發(fā)生歧化作用生成H2O2和O2，是一種重要的氧自由基清除劑；Pro（脯氨酸）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是植物抗旱性評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，植物抗旱性越強(qiáng)Pro積累量越高；POD（過氧化物酶）可通過催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物來(lái)消除過氧化氫和酚類、胺類毒性；MDA（丙二醛）由氧自由基作用于脂質(zhì)的不飽和脂肪酸生成的過氧化脂質(zhì)分解而來(lái)，通過MDA含量可衡量細(xì)胞膜氧化程度，MDA含量越高植物對(duì)干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)越靈敏；糖類物質(zhì)是構(gòu)成植物體的重要組成成分之一，也是新陳代謝的主要原料和貯存物質(zhì)，可溶性糖在滲透調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮著重要作用。如圖3所示，蒙古冰草幼苗經(jīng)20%的PEG-2000溶液模擬干旱脅迫處理0 h，2 h，4 h，6 h后，CAT，MDA呈先降后升趨勢(shì)，說明干旱脅迫處理2 h后蒙古冰草細(xì)胞膜已受到嚴(yán)重?fù)p傷，Pro基本保持不變，POD，SOD呈先升后降趨勢(shì)，植物可溶性糖呈先升后降再升的趨勢(shì)，說明一定程度內(nèi)的干旱脅迫與植物葉片的POD，SOD酶活性及植物可溶性糖含量呈正相關(guān)。

2.3 二代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析

2.3.1 二代轉(zhuǎn)錄組RNA樣品準(zhǔn)備及測(cè)序質(zhì)量評(píng)價(jià) 對(duì)所提RNA進(jìn)行質(zhì)檢，發(fā)現(xiàn)RNA質(zhì)量達(dá)到生物公司樣品判定標(biāo)準(zhǔn)A級(jí)，可進(jìn)行后續(xù)分析。對(duì)干旱脅迫處理0 h（D0），2 h（D2），6 h（D6）后的蒙古冰草進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)，如表3所示，干旱脅迫處理后的9個(gè)樣本測(cè)序所得原始序列介于6 407 888 400 bp～7 907 353 800 bp之間，過濾后序列介于6 467 448 005 bp～7 812 040 531 bp之間，Q30介于91.45%～93.77%之間，GC含量在53.18%～53.75%之間，測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。將各個(gè)樣品比對(duì)至參考基因，比對(duì)率均大于71.99%，表明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較好、準(zhǔn)確性較高，可滿足后續(xù)生物信息學(xué)分析的要求。

基于表達(dá)量信息開展主成分分析（Principal component analysis，PCA），計(jì)算樣品間皮爾斯（pearson）相關(guān)系數(shù)，再將這些相關(guān)系數(shù)以熱圖形式直觀展示出樣品間相關(guān)性，如圖4a，4b所示，不同處理時(shí)間下的3個(gè)樣本重復(fù)性及相關(guān)性均較好，后續(xù)分析可信度高；如圖4c所示，干旱處理2 h與處理前相比（CKvsD2），有1539個(gè)基因上調(diào)，1130個(gè)基因下調(diào)；干旱處理6 h與處理前相比（CKvsD6），有2213個(gè)基因上調(diào)，1455個(gè)基因下調(diào)。

2.3.2 差異表達(dá)基因GO，KEGG富集分析 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO富集分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因在GO功能注釋中被注釋在生物過程（Biological process，BP）、細(xì)胞成分（Cellular component，CC）和分子功能（Molecular function，MF）3大類中，如圖5a所示，在BP中主要富集于細(xì)胞過程（Cellular process）、代謝過程（Metabolic process）、定位（Localization）、應(yīng)激反應(yīng)（Response to stimulus）、生物調(diào)節(jié)（Biological regulation）及生物過程調(diào)控（Regulation of biological process）等生物學(xué)過程中，在CC中主要富集于細(xì)胞解剖學(xué)完整性（Cellular anatomical entity）和含蛋白質(zhì)復(fù)合物（Protein-containing complex） 2個(gè)生物學(xué)過程中，在MF中主要富集于催化活性（Catalytic activity）、結(jié)合（Binding）和轉(zhuǎn)化活性（Transporter activity）3個(gè)生物學(xué)過程中；由圖5b，5c可知，差異表達(dá)基因顯著富集于對(duì)酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)（Response to acid chemical）、作用于糖基鍵的水解酶活性（Hydrolase activity，acting on glycosyl bonds）、對(duì)滲透脅迫的反應(yīng)（Response to osmotic stress）、水解氧糖基鍵化合物的水解酶活性（Hydrolase activity，hydrolyzing O-glycosyl compounds）、對(duì)含氧化合物的反應(yīng)（Response to oxygen-containing compound）、作用于單個(gè)供體并結(jié)合分子氧的氧化還原酶活性（Oxidoreductase activity，acting on single donors with incorporation of molecular oxygen）、對(duì)脫落酸的反應(yīng)（Response to abscisic acid）、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)（Response to inorganic substance）、谷氨酰胺族氨基酸生物合成過程（Glutamine family amino acid biosynthetic process）等與抗旱相關(guān)的代謝通路中。

如圖6a所示，根據(jù)KO注釋可將差異表達(dá)基因參與的KEGG代謝通路分為代謝（Metabolism）、遺傳信息處理（Genetic information Processing）、環(huán)境信息處理（Environmental information Processing）、有機(jī)系統(tǒng)（Organismal Systems）和細(xì)胞過程（Cellular Processes）5大類，其中代謝類占比最高。在代謝類中，主要富集在全局概述地圖（Global and overview maps）、碳水化合物代謝（Carbohydrate Metabolism）、氨基酸代謝（Amino Acid Metabolism）、脂質(zhì)代謝（Lipid Metabolism）及其他次生代謝物合成途徑（Biosynthesis of other Secondary Metabolites）等通路中，其中全局概述地圖類占比最高；在遺傳信息處理類中主要富集于折疊分類和降解（Folding，sorting and degradation）、翻譯（Translation）、轉(zhuǎn)錄（Transcription）、復(fù)制和修復(fù)（Replication and repair）等途徑；在環(huán)境信息處理類中主要富集于信號(hào)傳導(dǎo)（Signal Transduction）和膜運(yùn)輸（Membrane transport）途徑；在有機(jī)系統(tǒng)類和細(xì)胞過程類中，分別富集于環(huán)境適應(yīng)（Environmental adaptation）和運(yùn)輸分解代謝（Transport and catabolism）2個(gè)代謝通路。如圖6b，6c所示，差異表達(dá)基因顯著富集于精氨酸與脯氨酸代謝（Arginine and proline metabolism）、淀粉和蔗糖代謝（Starch and sucrose metabolism）、內(nèi)吞作用（Endocytosis）、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)（Plant hormone signal transduction）、α-亞麻酸代謝（alpha-Linolenic acid metabolism）、類胡蘿卜素生物合成（Carotenoid biosynthesis）、碳代謝（Carbon metabolism）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）與植物-病原體互作（Plant-pathogen interaction）等與抗旱相關(guān)的代謝通路。

2.4 干旱響應(yīng)關(guān)鍵基因篩選

以三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參，利用二代有參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)干旱脅迫處理前后的蒙古冰草進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得25 578個(gè)基因，干旱脅迫處理2 h，6 h后與處理前相比分別有2669個(gè)、3668個(gè)差異表達(dá)基因，以｜log2（fc）｜＞1、pvalue≤0.05、FDR≤0.05、屬于TF家族等為條件對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，在CKvsD2中有109個(gè)轉(zhuǎn)錄本滿足條件，在CKvsD6中有120個(gè)轉(zhuǎn)錄本滿足條件，其中干旱脅迫處理2 h與6 h后同時(shí)發(fā)生響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子有73個(gè)；按照轉(zhuǎn)錄因子家族中所含基因數(shù)量進(jìn)行排名，排名前四的分別是WRKY，NAC，ERF與bZIP四個(gè)家族；根據(jù)在不同處理時(shí)間點(diǎn)均發(fā)生響應(yīng)、發(fā)生響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子家族排名及其他物種中已有研究的干旱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等最終篩選出19個(gè)（共44個(gè)轉(zhuǎn)錄本）基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證并完成進(jìn)一步篩選。

2.5 候選基因的篩選與驗(yàn)證

為檢驗(yàn)RNA-Seq數(shù)據(jù)可靠性并對(duì)候選基因進(jìn)行二次篩選，查詢相關(guān)文獻(xiàn)，選定GAPDH，G6PD，U6，ACTIN11，β-Actin，MwActin等文獻(xiàn)中所用內(nèi)參作為候選內(nèi)參^{［5-6，13，18］}，根據(jù)擴(kuò)增曲線、熔解曲線等最終選定β-Actin作為內(nèi)參，如圖7所示（圖中僅對(duì)最終所選候選基因的驗(yàn)證情況進(jìn)行了展示），qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與RNA-Seq中差異基因變化趨勢(shì)大體一致，證明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠，部分組間的基因表達(dá)趨勢(shì)存在一定差異，可能是檢驗(yàn)的基因表達(dá)水平較低或基因序列特征復(fù)雜等原因。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果、差異表達(dá)基因分析、差異表達(dá)基因富集分析結(jié)果及其他物種中已有研究的干旱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等最終以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢驗(yàn)結(jié)果中表達(dá)量上調(diào)且差異倍數(shù)gt;2為條件篩選出ERF053，ERF055，NAC100，bZIP23，ERF5，NAM-B1等基因可作為抗旱相關(guān)候選基因進(jìn)行后續(xù)分析。

3 討論

作為影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要逆境因素之一，干旱對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝、生殖發(fā)育等過程均有影響^［29-31］，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)植物受到干旱脅迫后會(huì)在生理生化和分子水平方面做出脅迫響應(yīng)來(lái)抵御逆境損傷，從而降低環(huán)境對(duì)自身的傷害^［32-33］，同時(shí)其基因表達(dá)模式和表達(dá)水平也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可快速全局的了解這種變化并篩選出抗旱相關(guān)基因，這為了解植物適應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也為研究植物適應(yīng)逆境脅迫提供了新的思路和方法^［25］。

近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在鑒定差異表達(dá)基因、篩選抗逆基因等領(lǐng)域被大量應(yīng)用^［34-35］。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠量化基因表達(dá)，挖掘生物重要功能基因^［36］，目前二代測(cè)序已在挖掘模式植物擬南芥及非模式植物甘藍(lán)型油菜、蘿卜、白菜、擬南芥等干旱脅迫應(yīng)答基因中發(fā)揮重要作用^［26］。與二代測(cè)序相比，三代測(cè)序cDNA讀長(zhǎng)更長(zhǎng)，無(wú)需拼接即可直接獲取完整的全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本，得到的轉(zhuǎn)錄本質(zhì)量更高，獲得的長(zhǎng)RNA序列更為準(zhǔn)確，更利于對(duì)mRNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究^［27］。以三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參進(jìn)行二代有參轉(zhuǎn)錄組測(cè)定，可極大提高逆境脅迫下應(yīng)答基因挖掘的準(zhǔn)確性。

轉(zhuǎn)錄因子在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫過程中具有復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，可以通過在轉(zhuǎn)錄水平上激活或抑制基因表達(dá)來(lái)幫助植物應(yīng)對(duì)干旱等非生物脅迫^［37］。根據(jù)DNA結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄因子可分為若干家族，如WRKY，AP2/EREBP，NAC，MYB，bZIP等，根據(jù)AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的不同又分為AP2，RAV，DREB，ERF和Soloist五個(gè)亞族^［13］。不同的轉(zhuǎn)錄因子亞家族甚至同一亞家族的成員在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫過程中發(fā)揮著不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能^［38］，其中WRKY，ERF，NAC，MYB，bHLH，bZIP等是常見的調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和應(yīng)對(duì)逆境脅迫的轉(zhuǎn)錄因子家族。WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物應(yīng)對(duì)干旱、鹽漬等非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。多項(xiàng)研究表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控ABA信號(hào)通路來(lái)參與植物應(yīng)對(duì)干旱脅迫的分子機(jī)制。ERF轉(zhuǎn)錄因子是AP2/EREBP家族中最大的一類亞族，往往通過參與乙烯、脫落酸、茉莉酸和水楊酸等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)調(diào)控下游基因表達(dá)，從而提高植物的抗逆性。吳婧等基于蒙古冰草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)篩選出41個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)其中4個(gè)可能具有抗旱功能的ERF基因進(jìn)行差異表達(dá)分析及qRT-PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)基因AmERF053，AmERF1B和AmERF4-1起正調(diào)控作用，AmERF4-2呈現(xiàn)負(fù)調(diào)控作用^［13］。NAC家族作為植物特有的、最大的TF家族之一，可以顯著提高植物逆境生存能力。范菠菠等^［15］從蒙古冰草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中篩選鑒定出26個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子，得到15個(gè)有完整結(jié)構(gòu)域的NAC蛋白，通過進(jìn)化關(guān)系比對(duì)及保守基序、保守結(jié)構(gòu)域和NAC蛋白二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析，獲得2個(gè)抗旱相關(guān)的AmNAC100和AmNAC102-2基因，對(duì)其進(jìn)行差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)其在干旱脅迫中起正調(diào)控作用。bZIP轉(zhuǎn)錄因子是高等植物中功能較為復(fù)雜的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物響應(yīng)逆境脅迫過程中發(fā)揮著重要作用，Ma等對(duì)玉米中的ZmbZIP4進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)ZmbZIP4能夠通過增加側(cè)根數(shù)量、促進(jìn)初生根生長(zhǎng)來(lái)提高玉米對(duì)非生物脅迫的耐受性^［39］。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)作為鑒定差異表達(dá)基因、篩選抗逆基因的重要研究手段，不僅能夠幫助研究者快速全局的了解植物響應(yīng)逆境脅迫過程中的所有轉(zhuǎn)錄本變化，還能精準(zhǔn)地得到目的轉(zhuǎn)錄本序列及表達(dá)信息，進(jìn)而快速準(zhǔn)確地篩選出響應(yīng)逆境脅迫相關(guān)基因。季香林等以高抗旱二倍體馬鈴薯A90為試驗(yàn)材料，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)PEG-6000脅迫下不同時(shí)間的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)53個(gè)基因注釋到RLKs，AP2/ERF和Tify等15個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中^［40］。王瑋等以斧翅沙芥（Pugionium dolabratum）葉片為材料，采用Illumina HiSeq高通量測(cè)序技術(shù)鑒定到HSF，ERF，WRKY，MYB，bHLH等47個(gè)干旱誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子家族^［41］。翟永青等以蒙古冰草為材料，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)25% PEG-6000模擬干旱脅迫處理不同時(shí)間下的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，篩選得到6個(gè)參與逆境脅迫的脫水素基因，干旱誘導(dǎo)脅迫下DN19347_c0_g7基因呈下調(diào)表達(dá)，起負(fù)調(diào)控作用；DN18948_c1_g4，DN14936_c0_g6，DN18948_c1_g1，DN27921_c1_ g1和DN23361_c0_g4在干旱誘導(dǎo)脅迫下呈上調(diào)表達(dá)，起正調(diào)控作用^［42］。本研究以蒙古冰草為材料，利用三代測(cè)序技術(shù)建立蒙古冰草轉(zhuǎn)錄本參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)，共獲得26 027條轉(zhuǎn)錄本，以此為參進(jìn)行二代有參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測(cè)定，發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫處理2 h與6 h后同時(shí)發(fā)生響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子有73個(gè)，其中所含基因數(shù)量排名前四的轉(zhuǎn)錄因子家族分別是WRKY，NAC，ERF與bZIP四個(gè)家族，結(jié)合差異表達(dá)基因富集分析結(jié)果及其他物種中已有研究的響應(yīng)干旱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，最終以實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果中表達(dá)量上調(diào)且差異倍數(shù)gt;2為條件篩選出ERF，NAC，bZIP等轉(zhuǎn)錄因子家族中的ERF053，ERF055，NAC100，bZIP23，ERF5，NAM-B1等基因可能是抗旱調(diào)控關(guān)鍵基因，可進(jìn)一步進(jìn)行基因克隆及功能驗(yàn)證。

目前尚無(wú)蒙古冰草基因組信息公布，在轉(zhuǎn)錄組水平對(duì)蒙古冰草干旱脅迫分子響應(yīng)機(jī)制的研究也相對(duì)較少，可供參考的遺傳信息不足，這在一定程度上限制了蒙古冰草功能基因的挖掘。本研究以抗旱性優(yōu)良的蒙古冰草為材料，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)盆栽蒙古冰草完整生長(zhǎng)期的各個(gè)組織、水培蒙古冰草干旱脅迫處理前后的葉片進(jìn)行高通量測(cè)序，通過三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)建立蒙古冰草轉(zhuǎn)錄本參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)，以三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參進(jìn)行二代有參轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)測(cè)定，結(jié)合二代三代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組分析，篩選得到大量差異表達(dá)基因，根據(jù)差異表達(dá)基因富集分析結(jié)果、在干旱脅迫處理不同時(shí)間后均發(fā)生響應(yīng)、發(fā)生響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子家族所含基因數(shù)量排名及其他物種中已有研究的響應(yīng)干旱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子等，初步篩選出蒙古冰草干旱脅迫應(yīng)答基因并進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，為后續(xù)篩選蒙古冰草抗旱相關(guān)候選基因、驗(yàn)證蒙古冰草響應(yīng)干旱脅迫關(guān)鍵基因功能、解析蒙古冰草抗旱分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。下一步將對(duì)候選基因進(jìn)行克隆，構(gòu)建基因過表達(dá)載體，將基因轉(zhuǎn)入模式植物，通過對(duì)干旱脅迫下轉(zhuǎn)基因植株株高、根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)等表型及生理指標(biāo)變化進(jìn)行分析，在形態(tài)、生理、分子方面對(duì)植株進(jìn)行抗旱性評(píng)價(jià)，進(jìn)一步確定候選基因功能。

4 結(jié)論

本研究首先利用三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序建立蒙古冰草轉(zhuǎn)錄本參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)，得到26 027條轉(zhuǎn)錄本，其中有25 453個(gè)轉(zhuǎn)錄本在KEGG，KOG，Nr，Swissprot等數(shù)據(jù)庫(kù)中得到注釋，有16 231條轉(zhuǎn)錄本在4個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中均被成功注釋；以三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參，對(duì)干旱處理下蒙古冰草幼苗進(jìn)行二代轉(zhuǎn)錄組分析，得到25 578個(gè)基因，在CKvsD2、CKvsD6中分別獲得2669個(gè)、3668個(gè)差異表達(dá)基因；在GO功能富集分析中差異表達(dá)基因顯著富集于“對(duì)滲透脅迫的反應(yīng)”“對(duì)含氧化合物的反應(yīng)”“作用于單個(gè)供體并結(jié)合分子氧的氧化還原酶活性”以及“對(duì)脫落酸的反應(yīng)”等與抗旱相關(guān)的過程；在KEGG代謝通路富集分析中差異表達(dá)基因顯著富集于“精氨酸與脯氨酸代謝”“淀粉和蔗糖代謝”“植物激素信號(hào)傳導(dǎo)”“內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)加工”以及“植物-病原體互作”等抗旱相關(guān)代謝通路；結(jié)合三代全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，根據(jù)GO及KEGG富集分析結(jié)果、基因在干旱脅迫不同處理時(shí)間點(diǎn)均發(fā)生響應(yīng)、發(fā)生響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子家族排名、響應(yīng)干旱脅迫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在其他物種中的研究及qPCR驗(yàn)證結(jié)果等，最終篩選出ERF053，ERF055，NAC100，bZIP23，ERF5，NAM-B1等6個(gè)基因可能是蒙古冰草參與抗旱的關(guān)鍵基因。

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（責(zé)任編輯 劉婷婷）