栽培小麥Brock中轉(zhuǎn)錄因子基因WRKY的克隆與表達分析

肖瑩+劉君+劉曉穎+范寶莉+王振英

摘 ? ?要： WRKY 類轉(zhuǎn)錄因子在植物抵抗外界脅迫上起重要作用。本研究在小麥中分離到一個WRKY類轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY，該基因序列全長1 242 bp，推測編碼蛋白含354個氨基酸， 相對分子量為86 kD， 理論等電點為4.96，與小麥中WRKY8序列同源性為97%。進化樹分析表明，TaWRKY與小麥中WRKY8親緣關(guān)系較近。基因的誘導(dǎo)表達模式分析顯示，TaWRKY受白粉菌誘導(dǎo)， 染菌8 h達到表達最高值。上述試驗結(jié)果初步說明，TaWRKY基因在小麥抵抗白粉菌侵染過程中可能發(fā)揮著重要作用。

關(guān)鍵詞：小麥;白粉菌;轉(zhuǎn)錄因子;WRKY

中圖分類號：S512.1 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.02.001

Cloning and Function Analysis of a Transcription Factor TaWRKY Gene in Common Wheat Cultivar Brock

XIAO Ying， LIU Jun， LIU Xiao-ying， FAN Bao-li， WANG Zhen-ying

（College of Life Science， Tianjin Normal University， Tianjin 300387，China）

Abstract： WRKY transcription factors play an important role in plant stress tolerance. In this study， a WRKY-like gene， named TaWRKY， was cloned from common wheat cultivar Brock . TaWRKY cDNA was 1 242 bp in length， and encoded protein of 354 amino acids with an predicted molecular weight of 86 kD and a isoelectric point of 4.96 . On the basis of phylogenetic analysis， TaWRKY shared 97% similarity with WRKY8 from wheat. The expression patterns analysis indicated that TaWRKY was induced by Blumeria graminis f. sp. Tritici（Bgt） and reached the maxium at 8 h in Brock. These results indicated that TaWRKY may play an important role in wheat-Bgt interaction.

Key words： wheat; powdery mildew; transcription factor; WRKY

收稿日期：2014-11-25;修訂日期：2015-01-04

基金項目：國家自然科學基金（31071671）;天津市科委青年基金（14JCQNJC14900）

作者簡介：肖瑩（1990—），女，天津人，在讀碩士生，主要從事植物抗病分子育種方面研究。通訊作者為王振英。

植物在漫長的進化過程中形成一系列復(fù)雜而精確的機制，來抵御生長發(fā)育過程中受到的各種生物和非生物脅迫。逆境脅迫下，植物通過一系列生理、生化和分子水平上的改變來適應(yīng)逆境脅迫。大量研究表明，植物對逆境的響應(yīng)是自身多個基因和基因家族共同作用的結(jié)果，這些基因主要分為功能基因和調(diào)節(jié)基因兩類。轉(zhuǎn)錄因子是植物中非常重要的一類調(diào)節(jié)基因。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是近年來在植物中被廣泛研究的一類轉(zhuǎn)錄因子家族，因其含有一段高度保守的WRKYGQK氨基酸序列而得名[1]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物的抗逆脅迫和衰老等生理生化過程，機械損傷、病原菌侵害、植物激素類物質(zhì)刺激都會引起WRKY基因的表達變化。煙草WRKY3和WRKY6能夠響應(yīng)昆蟲取食造成的傷害[2]。水稻中，OsWRKY13可以提高其對細菌和真菌疫病的抗性[3]。擬南芥中轉(zhuǎn)錄因子WRKY2介導(dǎo)了依賴于ABA的種子萌發(fā)以及萌發(fā)后發(fā)育的阻滯過程[4]。HvWRKY38 在大麥中受干旱、低溫脅迫的誘導(dǎo)[5]。在水稻中，干旱誘導(dǎo)水稻的葉中OsWRKY80的表達量顯著增加[6]。1994年，Ishiguro和Nakamura[7]首次從甘薯（Ipomoea batatas）中克隆出第一個WRKY蛋白SPF1，此后人們相繼在野生燕麥、歐芹、擬南芥、煙草和水稻等多種植物中都得到了WRKY基因。目前，在擬南芥和水稻中分別發(fā)現(xiàn)了72個和107個WRKY基因[8]，Wu等[9]和Niu等[10]也分別在小麥中克隆了15個和43個WRKY基因。

前期工作中，筆者在利用cDNA-AFLP技術(shù)分析Brock中白粉菌誘導(dǎo)下基因表達譜時，發(fā)現(xiàn)一個367 bp的片段 F16，經(jīng)Blast比對，該片段與NCBI GenBank中小麥WRKY8（Genbank 登錄號：DQ323885.1），小麥WRKY71（Genbank 登錄號：EF368356.1），小麥WRKY80（Genbank 登錄號：JX679079.1），小麥cDNA文庫序列（Genbank 登錄號：AK331823.1），大麥WRKY1（Genbank 登錄號：AJ536667.1），大麥WRKY38（Genbank 登錄號：AY541586.1）分別有94%，93%，93%，92%，85%和80%的同源性。筆者根據(jù)上述基因序列設(shè)計兼并引物，在抗白粉病小麥Brock中克隆了一個WRKY基因cDNA全長序列，命名為TaWRKY。利用熒光定量PCT技術(shù)對該基因的表達模式進行了分析，初步認為該WRKY基因參與了小麥抗白粉病早期防御反應(yīng)過程。

1 ? ?材料和方法

1.1 ? ?試驗材料與試劑

白粉菌抗性品種Brock，由Ray Johnson博士惠贈。

小麥白粉菌15號生理小種，由中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所提供。

1.2 ? ?TaWRKY基因的克隆

參照Roche公司TriPure Isolation Reagent試劑盒操作手冊提取總RNA。利用Nanodrop1000和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量及濃度。然后以4 μg總RNA為模板，利用Oligo（dT）18，在Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit（Roche）的作用下合成cDNA。根據(jù)F16的Blast比對結(jié)果，設(shè)計一對兼并引物，WRKYCDS-F： 5-ATGGATCCATGGRTSRGCAGCC-3; WRKYCDS-R： 5-TTAATTGATGTCCCTGGTCGGCGAK-3進行PCR擴增，擴增體系為5×HF Buffer 10.0 μL，100 mmol·L-1 dNTP Mixture 1.0 μL，WRKYCDS-F 2.5 μL，WRKYCDS-R 2.5 μL，cDNA 1.0 μL，DNA polymerase 0.5 μL，ddH2O補齊至50 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)：98 ℃預(yù)變性5 min;98 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min;反應(yīng)進行35個循環(huán)。72 ℃終延伸7 min。將目標條帶回收純化，純化產(chǎn)物連接到pGEM-T easy Vector上， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌，藍白斑篩選陽性克隆， 經(jīng)PCR 驗證和酶切驗證后， 陽性克隆送公司測序，測序結(jié)果提交NCBI GenBank 進行同源性分析。

1.3 ? ?TaWRKY基因表達模式分析

在小麥幼苗長至一葉一心期時采用抖落法高密度接種新鮮白粉菌孢子，接種0，2，4，8，12，24和48 h后取葉片用于提取RNA和表達趨勢分析。

根據(jù)小麥TaWRKY基因的特異區(qū)段設(shè)計一對熒光定量引物QTaWRKYF：5-AGTCCAATCCCGTCATCTCC-3和QTaWRKYR：5-GTCGCCACGAGTATGGTCTT-3，大小為154 bp。使用FastStart universal SYBR green master （Roche）在熒光定量PCR儀（Corbett rotor gene 6000）上進行基因擴增、熒光信號檢測和溶解曲線分析。內(nèi)參基因為小麥Tubulin基因（GenBank： U76744.1），該基因擴增引物為TubulinF：5-CCGTCTCCTTCTGGCTGCTT-3和TubulinR：5-GCCCGATGTGGATGCTTAT-3，擴增片段大小為186 bp。PCR擴增體系及程序參照試劑盒說明書進行，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)，采用2-△△CT法進行數(shù)據(jù)分析[11]。

2 ? ?結(jié)果與分析

2.1 ? ?TaWRKY基因的克隆

分離白粉菌誘導(dǎo)8 h的小麥Brock葉片總RNA，以O(shè)ligo（dT）18為引物進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，以該cDNA為模版，WRKYCDS-F和WRKYCDS-R為引物，PCR擴增出一個約1.3 kb的基因片段，將該片段連接到T-easy克隆載體，克隆并測序，該片段長1 242 bp，包含F(xiàn)16序列區(qū)段，與小麥WRKY8基因（GenBank登陸號：DQ323885.1）有97%同源性。利用ORF funder軟件搜索，發(fā)現(xiàn)其第109至1 174為ORF區(qū)，共1 065 bp，推測編碼354個氨基酸， 理論預(yù)測該蛋白的分子量為86 kD， 等電點4.96。氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，TaWRKY中后部包含WRKY基因超家族保守結(jié)構(gòu)域WRKYGQK，故將該基因命名為TaWRKY（圖1）。利用ClustalW 軟件進行系統(tǒng)譜系分析發(fā)現(xiàn)， 本研究中克隆的TaWRKY基因與WRKY家族中A1 組親緣關(guān)系較近（圖2）。

2.2 ? ?TaWRKY基因表達模式分析

為了研究TaWRKY基因?qū)Π追劬T導(dǎo)的應(yīng)答情況，筆者利用熒光定量分析法（qRT-PCR） 分析白粉菌誘導(dǎo)后TaWRKY基因mRNA累計情況。Brock中，TaWRKY基因受白粉菌誘導(dǎo)后的表達趨勢呈“W”型曲線特征，在白粉菌誘導(dǎo)2 h達到最低點;隨后基因表達水平逐漸上升，侵染8 h時達到最高;之后開始下降但24 h后又開始上升（圖3）。以上結(jié)果說明，TaWRKY的表達水平與白粉菌的誘導(dǎo)密切相關(guān)。

3 ? ?結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控多個與同類性狀有關(guān)的基因表達， 因此通過改良或增強一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控能力， 可以通過它增強多個同類功能基因同時發(fā)揮作用， 從而使植株獲得綜合改良效果。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族幾乎在所有植物中均存在，該轉(zhuǎn)錄因子家族成員都含有一段由60個氨基酸組成的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域的N端含有一段高度保守的WRKYGQK氨基酸序列，C端一般含有一個鋅指結(jié)構(gòu)。WRKY結(jié)構(gòu)域能夠特異性地結(jié)合一段TTGACC /T序列，這一結(jié)構(gòu)被稱為W-box[12]。W-box序列多存在于抗病、損傷、衰老相關(guān)基因和水楊酸誘導(dǎo)基因的上游調(diào)控區(qū)域，因此推測，WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能參與植物抗逆、生物脅迫和衰老等過程。

WRKY8是植物眾多WRKY類基因家族成員之一，在擬南芥中的功能研究比較多，中國科學院西雙版納熱帶植物園余迪求實驗室發(fā)現(xiàn)，擬南芥中，機械損傷誘導(dǎo)的WRKY8介導(dǎo)了擬南芥對病原菌的抵抗[13];WRKY8還與細胞中VQ9互作介導(dǎo)擬南芥抗鹽性[14];最近他們又發(fā)現(xiàn)WRKY8通過介導(dǎo)脫落酸和乙稀信號，參與了十字花科感染煙草花葉病毒（TMV-cg）的防御反應(yīng)，認為WRKY8可能介導(dǎo)了TMV-cg與擬南芥相互作用過程中ABA與乙稀信號之間的串擾，從而參與了對TMV-cg的防御反應(yīng)[15]。小麥中相關(guān)WRKY家族成員的報道較多[9]，雖然在Genbank中搜索到一個小麥的WRKY8（DQ323885.1），但其作者僅僅提交了一個mRNA的序列，對該序列沒有做功能闡述，因此，WRKY8在小麥中的功能研究未見任何報道。TaWRKY是本實驗室利用cDNA-AFLP技術(shù)分析抗病小麥Brock白粉菌誘導(dǎo)下基因表達譜時發(fā)現(xiàn)的表達上調(diào)片段，而后結(jié)合生物信息學技術(shù)克隆到基因cDNA全長，進一步的熒光定量表達趨勢分析發(fā)現(xiàn)，該基因的本底表達較低，但在8 h時達到表達高峰，隨后表達量下降，符合轉(zhuǎn)錄因子基因的一般表達規(guī)律，推測該基因可能參與了小麥對真菌防御反應(yīng)調(diào)節(jié)，進一步的研究正在進行中。

參考文獻：

[1] Rushton P J，Macdonald H，Huttly A K，et al. Members of a new family of DNA-binding proteins bind to a conserved cis-element in the promoters of alpha-Amy2 genes [J]. Plant Molecular Biology，1995，29： 691-702.

[2] Skibbe M，Qu N，Galis I，et al. Induced plant defenses in the natural environment Nicotiana attenuata WRKY3 and WRKY6 coordinate responses to herbivory [J].Plant Cell，2008，20（7）：1 984-2 000.

[3] Qiu D，Xiao J，Ding X，et al. OsWRKY13 mediates rice disease resistance by regulating defense-related genes in salicylate-and jasmonate-dependent signaling [J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2007，20（5）： 492-499.

[4] Jiang W，Yu D. Arabidopsis WRKY2 transcription factor mediates seed germination and postgermination arrest of development by abscisic acid [J]. BMC Plant Biology，2009（9）：96.

[5] Mare C，Mazzucotelli E，Crosatti C，et al. Hv-WRKY38： A new transcription factor involved in cold- and drought-response in barley [J]. Plant Molecular Biology，2004，55： 399-416.

[6] Ricachenevsky F K，Sperotto R A，Menguer P K， et al. Identification of Fe-excess- induced genes in rice shoots reveals a WRKY transcription factor responsive to Fe， drought and senescence [J]. Mol Biol Rep，2010，37（8）： 3 735-3 745.

[7] Ishiguro S，Nakamura K. Characterization of a cDNA encoding a novel DNA-binding protein， SPF1， that recognizes SP8 sequences in the ?5′ upstream regions of genes coding for sporamin and beta-amylase from sweet potato [J]. ?Molecular General Genetics，1994，244： 563-571.

[8] Wu K L，Guo Z J，Wang H H，et al. The WRKY family of transcription factors in rice and Arabidopsis and their origins [J]. DNA Res，2005，12（1）： 9-26.

[9] Wu H， Ni Z， Yao Y，et al. Cloning and expression profiles of 15 genes encoding WRKY transcription factor in wheat Triticum aestivem L [J]. Prog Nat Sci，2008，18： 697-705.

[10] Niu C F，Wei W，Zhou Q Y，et al. Wheat WRKY genes TaWRKY2 and TaWRKY19 regulate abiotic stress tolerance in transgenic Arabidopsis plants [J]. Plant Cell Environ，2012， 35：1 156 -1 170.

[11] Livak K J，Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCt method [J]. Methods，2001，25：402-408.

[12] Eulgem T，Rushton P J，Robatzek S，et al.The WRKY superfamily of plant transcription factors[J].Trends Plant Sci，2000（5）： 199-206.

[13] Chen L， Zhang L， Yu D. Wounding-induced WRKY8 is involved in basal defense in Arabidopsis [J]. Mol Plant Microbe Interact，2010， 23（5）：558-565.

[14] Hu Y， Chen L， Wang H， et al. Arabidopsis transcription factor WRKY8 functions antagonistically with its interacting partner VQ9 to modulate salinity stress tolerance [J]. Plant J， 2013，74（5）：730-745.

[15] Chen L， Zhang L， Li D， et al. WRKY8 transcription factor functions in the TMV-cg defense response by mediating both abscisic acid and ethylene signaling in Arabidopsis [J]. Proc Natl Acad Sci，2013，110（21）： 1 963-1 971.