響應(yīng)面法優(yōu)化山楂皮渣總黃酮提取工藝及抗氧化活性研究

【摘" "要】" "目的∶確定超聲輔助乙醇提取山楂皮渣總黃酮工藝的最佳條件，并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行分析評(píng)價(jià)。方法∶以山楂皮渣為原料，山楂皮渣總黃酮得率為指標(biāo)，應(yīng)用單因素試驗(yàn)分析料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率對(duì)總黃酮得率的影響，并用響應(yīng)面法優(yōu)化總黃酮的提取工藝。結(jié)果∶料液比為1：16 g/mL，在450 W超聲輔助條件下，用體積分?jǐn)?shù)為 70% 的乙醇提取120 min為最佳工藝條件，此條件下山楂皮渣總黃酮得率可高達(dá)62.79 mg/g。結(jié)論∶超聲輔助條件下，利用響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇提取山楂皮渣總黃酮的工藝條件合理可靠，并得到了最佳工藝；山楂皮渣總黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化能力。

【關(guān)鍵詞】" "山楂皮渣；總黃酮；響應(yīng)面法；超聲提??；抗氧化

【Abstract】" " Objective： To optimize ultrasound-assisted ethanol extraction of the total flavonoids from hawthorn pomace and determine the antioxidant capacity of the total flavonoids. Method： Hawthorn pomace is used as the raw material， and the yield of total flavonoids from hawthorn pomace as indicator， single-factor experiments are applied to analyze the effects of solid-liquid ratio， extraction time， ethanol volume fraction， and ultrasonic power on the yield of total flavonoids. The response surface methodology is applied to optimize the extraction process of total flavonoids from hawthorn pomace. Result： The optimal extraction conditions for ultrasound-assisted ethanol extraction of total flavonoids from hawthorn pomace： with a solid-liquid ratio of 1：16 g/mL， under 450 W ultrasonic power， using 70% ethanol for extraction over 120 minutes. Under these conditions， the yield of total flavonoids from hawthorn pomace can reach 62.79 mg/g. Conclusion： Optimization of ultrasonic-assisted ethanol extraction of total flavonoids from hawthorn pomace by response surface methodology is reasonable and reliable， and the best optimization of extraction technology is obtained. The total flavonoids from hawthorn pomace have strong antioxidant capacity.

【Key words】" " "hawthorn pomace; total flavonoids; response surface methodology; ultrasonic extraction; antioxidant

〔中圖分類號(hào)〕 R284.2" " " " " " " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕" A

〔文章編號(hào)〕 1674 - 3229（2024）04 - 0049 - 07" " " " " " DOI：10.20218/j.cnki.1674-3229.2024.04.007

0" " "引言

山楂是薔薇科山楂屬植物的成熟果實(shí)，是我國(guó)十分常見的藥食兩用中藥材之一，《本草綱目》中記載，山楂干果最早用于治療胸痛、疝氣、消化不良、產(chǎn)后血瘀和便血等 ［1］。研究表明，山楂果實(shí)中富含熊果酸、黃酮類化合物等多種生物活性成分，具有抗氧化、延緩衰老、增強(qiáng)免疫力等功能，在心腦血管相關(guān)疾病和癌癥的預(yù)防與治療等方面具有重要作用［2-7］。由于山楂中黃酮類化合物含量較高、藥理作用效果顯著，山楂果實(shí)和葉中黃酮類化合物提取工藝、活性分析等成為了研究熱點(diǎn)［8-14］，但研究山楂皮渣中黃酮類化合物相關(guān)報(bào)道很少。

本試驗(yàn)以制作山楂罐頭廢棄的皮渣為原料，在超聲輔助條件下，用乙醇作為溶劑提取山楂皮渣中的總黃酮，并對(duì)工藝條件進(jìn)行優(yōu)化；分析測(cè)定最佳工藝條件下提取的山楂皮渣總黃酮的抗氧化活性，為山楂皮渣再利用提供理論支撐。

1" " "材料與方法

1.1" "試驗(yàn)材料

山楂皮渣：本科學(xué)生實(shí)驗(yàn)制作罐頭剩余的廢棄皮渣。

1.2" "儀器與設(shè)備

分析天平（FA2004C）：上海越平科學(xué)儀器有限公司；分光光度計(jì)（721型）：上海菁華科技儀器有限公司；酶標(biāo)儀（Bio-rad iMark）：美國(guó)bio-red公司。

1.3" "試驗(yàn)方法

1.3.1" "山楂皮渣處理

將制作罐頭廢棄的山楂皮渣烘干至恒重，粉碎，過60目篩子備用。

1.3.2" "標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

參照張巧明等［12］研究方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得到濃度Y（mg/mL）與吸光度A的回歸方程。

1.3.3" "山楂皮渣總黃酮的提取

準(zhǔn)確稱取1.0 g山楂皮渣原料，一定溫度下以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、超聲功率為變量提取山楂皮渣總黃酮， 3000 r/min離心，10 min后取上清液置于50 mL容量瓶中，定容待測(cè)。量取1 mL待測(cè)液置于25 mL容量瓶中，用相應(yīng)濃度乙醇溶液進(jìn)行定容測(cè)定吸光度值，根據(jù)回歸方程計(jì)算山楂皮渣總黃酮的質(zhì)量。

1.3.4" "得率計(jì)算

W：山楂皮渣總黃酮得率（mg/g）；C：山楂皮渣總黃酮濃度（mg/mL）；V：粗提液體積（mL）；N：稀釋倍數(shù)；m：試驗(yàn)原料質(zhì)量（g）。

1.3.5" "單因素試驗(yàn)

一定溫度（50 ℃）下，用60%乙醇溶液在超聲功率250 W條件下提取山楂皮渣總黃酮30 min，料液比分別設(shè)為 1：5、1：10、1：15、1：20、1：25 時(shí)計(jì)算黃酮得率；料液比為1：10，用體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液在超聲功率250 W條件下分別提取山楂皮渣總黃酮 時(shí)間30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，并計(jì)算黃酮得率；料液比為 1：10，用體積分?jǐn)?shù)分別為 30%、40%、50%、60%、70% 的乙醇水溶液在 250 W超聲條件下提取山楂皮渣總黃酮 30 min，并計(jì)算黃酮得率；料液比為1：10，用體積分?jǐn)?shù)為 60% 的乙醇溶液分別在250 W、300 W、350 W、400 W、450 W超聲條件下提取山楂皮渣總黃酮30 min，并計(jì)算黃酮得率。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.6" "響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)采用4因素3水平分析法，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以山楂皮渣總黃酮得率為指標(biāo)，以料液比（A）、提取時(shí)間（B）、乙醇濃度（C）、超聲功率（D）為影響因子，依據(jù)design-expert 8.0設(shè)計(jì)試驗(yàn)，得到二次多項(xiàng)式回歸方程的預(yù)測(cè)模型，從而優(yōu)化山楂皮渣總黃酮的超聲輔助提取工藝，并找到最佳參數(shù)［15-17］。具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

1.3.7" "山楂皮渣總黃酮抗氧化能力的測(cè)定

在最佳條件下提取山楂皮渣黃酮，方法如1.3.3，并應(yīng)用（1）式計(jì)算黃酮得率。然后利用總抗氧化能力（T-AOC）測(cè)定試劑盒（FRAP法），以蒸餾水作為空白對(duì)照，在595 nm條件下用酶標(biāo)儀測(cè)定其總抗氧化能力，每個(gè)點(diǎn)做8個(gè)重復(fù)。

以濃度為縱坐標(biāo)，OD值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，列回歸方程。將樣品OD值代入回歸方程，可得標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)濃度。山楂皮渣總黃酮抗氧化能力用所得標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)濃度來表示。

2" " "結(jié)果與分析

2.1" "單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1" "料液比對(duì)山楂皮渣總黃酮得率的影響

蘆丁濃度Y（mg/mL）與吸光度A的回歸方程為：Y=1.107 A-0.007 （R2=0.999） （2）

由圖1-A可以看出，提取條件相同，山楂皮渣總黃酮得率隨著料液比的減小先升高后降低，這是因?yàn)槿軇┝坎粩嘣黾舆^程中，細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)濃度梯度不斷增大，使得細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)更易溶出。當(dāng)料液比為1：15時(shí)，總黃酮得率達(dá)最大值，之后溶劑量繼續(xù)增加，總黃酮得率卻下降，可能是乙醇溶劑用量過大時(shí)，溶液中其他物質(zhì)會(huì)與黃酮類化合物競(jìng)爭(zhēng)乙醇溶劑［18］，導(dǎo)致山楂皮渣總黃酮的得率測(cè)定值減小。因此，本試驗(yàn)選取最佳料液比為1：15。

2.1.2" "超聲輔助提取時(shí)間對(duì)山楂皮渣總黃酮得率的影響

如圖1-B，山楂皮渣總黃酮得率與時(shí)間關(guān)系曲線呈先升后降趨勢(shì)。當(dāng)提取時(shí)間為90 min時(shí)，山楂皮渣總黃酮得率最高。Fick擴(kuò)散定律［19］提到：在一定范圍內(nèi)，超聲提取時(shí)間越長(zhǎng)總黃酮得率越高。但是超聲時(shí)間過長(zhǎng)（即超出一定范圍）其熱效應(yīng)影響就會(huì)愈加顯著，這將直接導(dǎo)致溶劑加速揮發(fā)及某些熱敏感組分降解轉(zhuǎn)化，可能會(huì)影響黃酮的穩(wěn)定性和相對(duì)含量［16+20］；另一方面提取時(shí)間過長(zhǎng)其他雜質(zhì)溶出量也會(huì)增大，這些因素都會(huì)導(dǎo)致總黃酮得率降低。因此，本試驗(yàn)選取最佳超聲提取時(shí)間為90 min。

2.1.3" "乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)山楂皮渣總黃酮得率的影響

如圖1-C，山楂皮渣總黃酮得率與乙醇體積分?jǐn)?shù)關(guān)系曲線呈先升后降趨勢(shì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)60%時(shí)總黃酮得率最高，乙醇體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)增加，黃酮得率開始降低，可能是由于較高濃度乙醇加速其他醇溶性物質(zhì)如蛋白質(zhì)、兒茶素等的大量溶出，從而影響總黃酮得率的測(cè)定［21-23］。因此，本試驗(yàn)選取最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.1.4" "超聲功率對(duì)山楂皮渣總黃酮得率的影響

如圖1-D，隨著超聲功率的增加，山楂皮渣總黃酮得率也是呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，功率達(dá)400 W時(shí)，總黃酮得率達(dá)峰值。由于超聲波的機(jī)械作用和空化效應(yīng)的影響，植物細(xì)胞壁會(huì)被破碎，致使細(xì)胞內(nèi)有效成分更多地溶入到提取劑中［24］，因此，一定功率作用下有利于山楂皮渣總黃酮的提取。但若超聲功率過高則某些黃酮成分可能會(huì)在超聲作用下降解，同時(shí)溶劑中其他醇溶性物質(zhì)增加，將最終影響總黃酮得率的測(cè)定。

2.2" " 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1" "數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性分析

本試驗(yàn)采用Design-Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)（表2）進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)式回歸模型。

方程（3）中Y為山楂皮渣總黃酮得率預(yù)測(cè)值，X1、X2、X3、X4分別代表料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率。

方差分析詳見表3，預(yù)測(cè)模型（P＜0.0001）具有高度顯著性，失擬性具有不顯著性（P=0.6933＞0.05），R2=0.9551，RAdj2=0.9261，表明方程對(duì)試驗(yàn)擬合較好，可以對(duì)山楂皮渣總黃酮得率進(jìn)行很好地分析和預(yù)測(cè)?；貧w方程各項(xiàng)方差分析顯示， X1、X1X4、X2X3、X12、X32、X42因子對(duì)山楂皮渣總黃酮得率影響極顯著（P＜0.01），X1X2、X1X3、X2X4因子對(duì)山楂皮渣總黃酮得率影響不顯著（P＞0.05）。各因子對(duì)山楂皮渣總黃酮得率的影響依次為：X1（料液比）＞X3（乙醇體積分?jǐn)?shù)）＞X2（提取時(shí)間）＞X4（超聲功率）。

2.2.2" "影響山楂皮渣總黃酮得率的各因子間的交互作用分析

據(jù)Box-Behnken分析可得到不同因子對(duì)山楂皮渣總黃酮得率影響的響應(yīng)曲面及其等高線圖［25-28］。三維立體曲線反映每?jī)蓚€(gè)影響因子之間的交互作用，響應(yīng)面曲線坡度越大，各影響因子對(duì)考察指標(biāo)的影響越大，反之，曲線越平緩，各因子對(duì)響應(yīng)值的影響越??；若等高線為橢圓形則影響因子之間交互作用顯著，若等高線為圓形，則各影響因子之間交互作用不顯著 ［29-30］。本試驗(yàn)因子之間交互作用極顯著的見圖 2-A和圖2-B，顯著的見圖2-C。

圖 2-A 為當(dāng)提取時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)兩個(gè)變量取零水平時(shí)，超聲功率和料液比對(duì)山楂皮渣總黃酮得率的影響。從等高線圖上看，山楂皮渣總黃酮得率隨超聲功率和料液比增大而快速升高，二者交互作用十分明顯，且二者對(duì)黃酮提取是相互促進(jìn)的作用，故黃酮得率在高液料比和高超聲功率的相互作用下升高極顯著（P＜0.01）。

圖2-B為料液比和超聲功率兩個(gè)變量取零水平時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)和時(shí)間對(duì)山楂皮渣總黃酮得率的影響。由圖2-B可知，隨時(shí)間延長(zhǎng)且乙醇體積分?jǐn)?shù)升高，山楂皮渣總黃酮得率也較高；而時(shí)間長(zhǎng)乙醇體積分?jǐn)?shù)較低或時(shí)間短乙醇體積分?jǐn)?shù)較高條件下，山楂皮渣總黃酮得率均較低。該圖能夠直觀體現(xiàn)總黃酮得率與提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)呈二次拋物線關(guān)系，且等高線呈橢圓形，說明因子間交互作用極其顯著（P＜0.01）。

圖2-C為料液比和提取時(shí)間兩個(gè)變量取零水平時(shí)，其他變量對(duì)山楂皮渣總黃酮得率的影響。由圖2-C可知，二者對(duì)山楂皮渣總黃酮得率也有比較顯著的影響，且乙醇體積分?jǐn)?shù)主效應(yīng)大于超聲功率，二者與黃酮得率呈二次曲線關(guān)系。但從等高線圖上看，二者的交互作用也比較顯著（P＜0.05），但是沒有圖2-A、圖2-B中兩因素交互作用明顯。

綜上數(shù)據(jù)分析，兩因子交互作用于山楂皮渣總黃酮得率強(qiáng)弱順序?yàn)椋?[X2X3gt;X1X4gt;X3X4]，此結(jié)果與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3" "最佳條件的預(yù)測(cè)及驗(yàn)證性試驗(yàn)

通過響應(yīng)面軟件分析，在料液比1：16 g/mL，時(shí)間120 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，超聲功率450 W時(shí)山楂皮渣黃酮提取效果最佳，在此條件下做3次平行試驗(yàn)，結(jié)果為62.79 mg/g，試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果和預(yù)測(cè)值（62.70 mg/g）十分接近，證明結(jié)果可靠，建立的數(shù)學(xué)模型對(duì)山楂皮渣總黃酮提取有實(shí)用價(jià)值。

2.3" "山楂皮渣總黃酮抗氧化能力測(cè)定結(jié)果

標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mmol/L）與OD值之間的回歸方程為：

將測(cè)得的OD值代入方程（4）計(jì)算得出山楂皮渣總黃酮總抗氧化能力為3.4 mmol/g。

3" " "結(jié)論

山楂皮渣中含有豐富的黃酮類化合物，超聲輔助條件下，用乙醇作為溶劑提取其中總黃酮的方法效率較高，該工藝最佳提取條件為：在450 W超聲條件下，以1：16 g/mL的料液比投入試驗(yàn)材料，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇提取120 min，此條件下山楂皮渣總黃酮得率可達(dá)62.79 mg/g。

山楂皮渣總黃酮具有很強(qiáng)的抗氧化能力，可以作為食品添加劑延緩脂肪的氧化起到一定的防腐作用，還可以延緩人體機(jī)能衰老和防治自由基引發(fā)的多種疾病，從而可以用來開發(fā)功能食品，制作天然抗氧化劑、化妝品、保健品及醫(yī)藥用品等。本研究既可以為利用山楂皮渣生產(chǎn)黃酮類藥物提供理論依據(jù)，也可以為進(jìn)一步深入研究山楂皮渣資源的應(yīng)用價(jià)值提供理論支撐。

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責(zé)任編輯" "呂榮榮

［收稿日期］" "2024-07-24

［基金項(xiàng)目］" "廊坊市科技局自籌項(xiàng)目（2023013109）

［作者簡(jiǎn)介］" "張春丹（1982- ），女，碩士，廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)師，研究方向：植物生理。

［通信作者］" "尚校蘭（1985- ），女，博士，廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院教授，研究方向：食品科學(xué)。