芪紅膠囊對(duì)缺血性心力衰竭大鼠心肌線粒體能量代謝及AKT/AMPK－mTOR信號(hào)通路的影響

摘要 目的：探討芪紅膠囊基于蛋白激酶B/腺苷酸活化蛋白激酶（AKT/AMPK）－哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路對(duì)缺血性心力衰竭（IHF）大鼠線粒體能量代謝的影響及調(diào)控機(jī)制。方法：將36只雄性SD大鼠隨機(jī)選取6只作為假手術(shù)組，另30只作為模型組。模型組采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法制備IHF模型。將造模成功的大鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組：模型組、陽性藥組、芪紅膠囊低劑量組［QH－L組，0.324 g/（kg·d）］、芪紅膠囊中劑量組［QH－M組，0.648 g/（kg·d）］、芪紅膠囊高劑量組［QH－H組，1.296 g/（kg·d）］，給予相應(yīng)濃度的藥物溶液灌胃，假手術(shù)組、模型組給予等體積的生理鹽水（10 mL/kg），各組均每日灌胃1次。連續(xù)干預(yù)4周后，選用M型超聲測(cè)定左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、短軸縮短率（FS）判定心臟結(jié)構(gòu)及心功能；脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（TUNEL）染色法觀察心肌組織病理形態(tài)；酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)血清葡萄糖（Glu）、乳酸（LD）、酮體（KB）、游離脂肪酸（FFA）水平；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC－1法）檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位；線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其熒光強(qiáng)度；MitoSOXTMRed 線粒體超氧化物指示劑檢測(cè)線粒體活性氧（ROS）的含量；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)心肌組織AKT、AMPK、mTOR的蛋白表達(dá)量。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組LVEDD、LVESD、凋亡率、Glu、LD、FFA、KB、線粒體膜電位、ROS、磷酸化AMPK（p－AMPK）蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05），LVEF、FS、mPTP及磷酸化AKT（p－AKT）、磷酸化mTOR（p－mTOR）蛋白表達(dá)水平均下降（P＜0.05）；與模型組比較，芪紅膠囊低、中、高劑量組和陽性藥組Glu、LD、FFA、KB、線粒體膜電位、ROS水平明顯下降（P＜0.05），線粒體mPTP、p－AKT蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；芪紅膠囊中、高劑量組LVEDD、凋亡率、p－AMPK明顯降低（P＜0.05），LVEF、FS明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與芪紅膠囊低劑量組比較，芪紅膠囊高劑量組和陽性藥組大鼠LVEF、FS、線粒體mPTP、p－AKT水平明顯升高，LVESD、ROS、p－AMPK表達(dá)水平下降（P＜0.05）。結(jié)論：芪紅膠囊可以調(diào)節(jié)IHF大鼠心肌代謝底物進(jìn)程，減少ROS的過度生成保護(hù)線粒體功能，激活A(yù)KT上調(diào)mTOR活性抑制細(xì)胞凋亡，減輕心肌細(xì)胞損傷，調(diào)控能量代謝，發(fā)揮心肌保護(hù)作用，其機(jī)制可能與AKT/AMPK－mTOR信號(hào)通路蛋白的表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 缺血性心力衰竭；芪紅膠囊；能量代謝；線粒體功能障礙；蛋白激酶B/腺苷酸活化蛋白激酶－哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白信號(hào)通路

doi：10.12102/j.issn.1672－1349.2024.12.006

Effect of Qihong Capsule on Myocardial Mitochondrial Energy Metabolism and AKT/AMPK－mTOR Signaling Pathway in Rats with Ischemic Heart Failure

ZHAI Xueqin， ZHU Pengcheng， WANG Xiaofeng， FAN Hui， JIANG Haibing， YANG Yi

State Key Laboratory of Pathogenesis， Prevention and Treatment of High Incidence Diseases in Central Asia， The Fourth Clinical College of Xinjiang Medical University， Urumqi， 830000， China

Corresponding Author WANG Xiaofeng， E－mail： wxf87112008@163.com

Abstract Objective：To explore the effect of Qihong capsule on mitochondrial energy metabolism in rats with ischemic heart failure（IHF） and its regulatory mechanism.Methods：Thirty－six male sprague－dawley rats were randomly divided into sham operation group（n＝6） and model group（n＝30） .The IHF model was prepared by ligation of the left anterior descending coronary artery.Sucessfully molded rats were randomly divided into 5 groups according to their body weight：model group，positive drug group，low－dose Qihong capsule group［QH－L，0.324 g/（kg·d）］，medium－dose Qihong capsule group［QH－M，0.648 g/（kg·d），high－dose Qihong capsule group ［QH－H，1.296" g/（kg·d）］，the rats in sham operation group and model group were given the same volume of normal saline （10 mL/kg） by gavage once a day.After four weeks of continuous intervention，left ventricular end－diastolic diameter（LVEDD），left ventricular end－systolic diameter（LVESD），left ventricular ejection fraction（LVEF） and fractional shortening of short axis（FS） were measured by M－mode ultrasound to determine the structure and function of the heart.Deoxyribonucleotide end transferase mediated notch end labeling（TUNEL） staining was used to observe the pathological morphology of myocardial tissue.Enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA） was used to detect the levels of serum glucose（Glu），lactate（LD），ketone bodies（KB），and free fatty acids（FFA）.Mitochondrial permeability transition pore（mPTP） detection kit was used to detect the fluorescence intensity.Mitochondrial membrane potential detection kit（JC－1 method） was used to detect mitochondrial membrane potential.MitoSOXTM Red mitochondrial superoxide indicator was used to detect the content of reactive oxygen species（ROS），and Western Blot was used to detect the protein expression of protein kinase B（AKT），AMP－activated protein kinase（AMPK），and mammalian target of rapamycin（mTOR） in the myocardium.Results：Compared with sham operation group，LVEDD，LVESD，apoptosis rate，Glu，LD，F(xiàn)FA，KB，mitochondrial membrane potential，ROS，phosphorylated AMPK（p－AMPK） protein expression levels increased in model group（P＜0.05）.The expression levels of LVEF，F(xiàn)S，mPTP，phosphorylated AKT（p－AKT），and phosphorylated mTOR（p－mTOR） decreased（P＜0.05）.Compared with model group，the levels of Glu，LD，F(xiàn)FA，KB，mitochondrial membrane potential，and ROS in QH－L group，QH－M group，QH－H group，and positive drug group significantly decreased（P＜0.05），and the expression levels of mitochondrial mPTP and p－AKT significantly increased（P＜0.05）.The LVEDD，apoptosis rate，and p－AMPK in QH－M group and QH－H group significantly decreased（P＜0.05），while LVEF and FS significantly increased（P＜0.05）.Compared with QH－L group，the levels of LVEF，F(xiàn)S，LD，mitochondrial mPTP and p－AKT in QH－H" group and positive drug group" significantly increased，while the expression levels of LVESD，ROS and p－AMPK decreased（P＜0.05）.Compared with QH－L group，the levels of LVEF，F(xiàn)S，mitochondrial mPTP，and p－AKT in QH－H group and positive drug group significantly increased，while the expression levels of LVESD，ROS and p－AMPK decreased（P＜0.05）.Conclusion：Qihong capsule can regulate the process of myocardial metabolic substrate in IHF rats，reduce the over－production of ROS，protect the function of mitochondria，activate AKT to up－regulate the activity of mTOR，inhibit the apoptosis and alleviate the injury of myocardial cells，the mechanism of myocardial protection by regulating energy metabolism may be related to the expression of AKT/AMPK－mTOR signaling pathway protein.

Keywords ischemic heart failure; Qihong capsule; energy metabolism; mitochondrial dysfunction;" protein kinase B/AMP－activated protein kinase－mammalian target of rapamycin signaling pathway

缺血性心力衰竭（ischemic heart failure，IHF）是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化病變使心肌的供氧和需氧不平衡導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡、壞死，心腔擴(kuò)大，發(fā)生心力衰竭［1］，是冠心病嚴(yán)重的并發(fā)癥，每年死亡人數(shù)高達(dá)900萬人，是全球主要的死亡原因［2］。盡管及時(shí)行經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入（PCI）術(shù)，仍不能降低其死亡率及發(fā)病率。有研究表明，心肌線粒體功能障礙可導(dǎo)致心肌病，長(zhǎng)期的線粒體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡會(huì)導(dǎo)致心力衰竭［3］，線粒體作為心肌細(xì)胞能量代謝的主要調(diào)節(jié)器，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和細(xì)胞凋亡［4］，是細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）的主要來源［5］，ROS過度生成可損傷線粒體，導(dǎo)致線粒體功能失調(diào)，繼而線粒體膜電位降低，線粒體滲透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）異常開放，導(dǎo)致線粒體功能障礙及細(xì)胞凋亡［6－8］。心室重構(gòu)是導(dǎo)致心力衰竭的重要機(jī)制，而細(xì)胞凋亡是加重心室重構(gòu)和心力衰竭的重要因素［9］。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶B/腺苷酸活化蛋白激酶AKT/AMPK－哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號(hào)通路是線粒體細(xì)胞凋亡的重要通路，通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞能量代謝，維持能量穩(wěn)態(tài)［10］。mTOR主要受上游信號(hào)AKT和AMPK的調(diào)控，AKT激活后通過上調(diào)mTOR抑制細(xì)胞凋亡，AMPK激活后可下調(diào)mTOR活性促進(jìn)細(xì)胞凋亡［11］。因此，AKT/AMPK－mTOR信號(hào)通路對(duì)線粒體細(xì)胞能量具有雙向調(diào)節(jié)作用，干預(yù)該信號(hào)通路可能是發(fā)揮能量穩(wěn)態(tài)作用、防治心力衰竭的有效途徑。

中醫(yī)認(rèn)為IHF屬于“心衰”的范疇，“心衰”一詞最早見于西晉王叔和《脈經(jīng)·脾胃病》：“心衰則伏，肝微則沉，故令脈伏而沉”。國(guó)醫(yī)大師沈?qū)毞淌谡J(rèn)為心衰病臨床表現(xiàn)為心悸、水腫、胸痛、呼吸困難、喘憋等不同證候，以痰瘀互結(jié)、痰瘀同病為其主要的病機(jī)?；谠摬C(jī)特征，第七批全國(guó)老中醫(yī)藥專家學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承工作指導(dǎo)老師王曉峰教授在學(xué)習(xí)傳承國(guó)醫(yī)大師沈?qū)毞淌诘膶W(xué)術(shù)思想及臨床經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，創(chuàng)制了具有痰瘀同治、扶正祛邪治療心衰病的中藥芪紅膠囊，其主要由黃芪、桂枝、紅景天、丹參、葶藶子、澤瀉組成。本課題組前期研究基礎(chǔ)已證實(shí)，該方可以提高心力衰竭大鼠Na＋－K＋－ATPase及Ca2＋－ATPase含量，為心肌提供能量，改善心力衰竭癥狀，提高心功能［12］。因此，本研究基于線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡在能量代謝領(lǐng)域的新熱點(diǎn)，以AKT/AMPK－mTOR信號(hào)通路為切入點(diǎn)，采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法制備大鼠IHF模型探討芪紅膠囊對(duì)IHF大鼠線粒體能量代謝及AKT/AMPK－mTOR信號(hào)通路的影響，為芪紅膠囊防治IHF發(fā)揮心肌保護(hù)機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇6～8周齡健康雄性SD大鼠36只，體質(zhì)量210～230 g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào) SYXK（新）2021－0003，飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度60%～80%，晝夜節(jié)律，自由進(jìn)食、飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序及處置符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物照料和使用原則，均經(jīng)新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：IACUC－20230227－22）。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

1）干預(yù)藥物：芪紅膠囊（購自新疆維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：9220409，每粒0.4 g）。芪紅膠囊的臨床用藥量為7.2 g/d，根據(jù)“人和動(dòng)物按體表面積折算的等效劑量比值表”計(jì)算（人的用量/70 kg×6.3）［13］，分別給予芪紅膠囊干預(yù)，低劑量組0.324 g/（kg·d）、中劑量組0.648 g/（kg·d）、高劑量組1.296 g/（kg·d）。用開水溶解，放至4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?）陽性藥物：曲美他嗪片［施維雅（天津）制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)2020668］。3）麻醉藥物：舒泰509（法國(guó)維克有限公司，生產(chǎn)批號(hào)8SKGA），鹽酸賽拉嗪注射液（圣達(dá)動(dòng)物藥品有限公司，生產(chǎn)批號(hào)20220301）。

1.3 試劑

葡萄糖（Glu）、乳酸（LD）、游離脂肪酸（FFA）、酮體（KB）酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為A154－1－1，A019－2－1，A042－2－1，H539－1－1），脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記（TUNEL）凋亡檢測(cè)試劑盒－POD（武漢博士德，批號(hào)MK1020），mPTP檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)C2009S），線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC－1法，南京建成生物工程研究所，批號(hào)G009－1－3），MitoSOXTMRed線粒體超氧化物指示劑（賽默飛世爾科技公司，批號(hào)M36008），蛋白酶抑制劑（博士德生物公司，批號(hào)AR1178），蛋白預(yù)染Marker（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)PR1910），山羊抗兔IgG Hamp;L（HRP），山羊抗小鼠IgG Hamp;L（HRP），AKT（pan）（C67E7）Rabbit mAb #4691，Phospho－AKT（Ser473）抗體，重組Anti－mTOR抗體［EPR390（N）］，重組Anti－mTOR（phospho S2448）抗體［EPR426（2）］，均為美國(guó)Abcam公司生產(chǎn)，批號(hào)分別為ab205718，ab205719，4691S，ab81283，ab134903，ab109268；AMPKα Antibody #2532，Phospho－AMPKα（Thr172）（40H9）Rabbit mAb #2535（美國(guó)CST公司，批號(hào)分別為2532S，2535S）。

1.4 儀器

5415D Centrifuge離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司），xMarkTM型酶標(biāo)儀（Bio－Rad），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司），免疫組化染色孵育盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），顯微鏡（Nikon生物顯微鏡），BF－700流式細(xì)胞儀（桂林優(yōu)利特醫(yī)療電子有限公司），DW－HL388型－80 ℃低溫冰箱、BCD－249LCK型－20 ℃低溫冰箱（合肥美菱公司），DNP－9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司），MadLab生物信息化醫(yī)學(xué)信號(hào)采集處理系統(tǒng)（北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司），化學(xué)發(fā)光成像儀系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司），免疫組化染色孵育盒（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司），蛋白轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio－Rad公司），電泳儀（北京六一生物科技有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 模型構(gòu)建及評(píng)價(jià)

36只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)抽取6只為假手術(shù)組（SOG），30只為模型組。模型組采用冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎法［14－15］制備IHF大鼠模型，大鼠術(shù)前12 h禁食水，稱體質(zhì)量，腹腔注射0.9%氯化鈉溶液22.5 mL、舒泰50（60 mg/kg）與鹽酸賽拉嗪（0.5 mg/kg）混合麻醉后，將大鼠仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，腹部手術(shù)區(qū)備皮、消毒，術(shù)者手部同時(shí)用乙醇擦拭消毒。大鼠皮下插針記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖（ECG），先記錄穩(wěn)定1 min的心電圖，連接無創(chuàng)氣管插管及小動(dòng)物人工呼吸機(jī)，于大鼠第3肋與第4肋間打開胸腔，暴露心臟，分離并結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支，進(jìn)針深度控制在1.5 mm左右，于血管與結(jié)扎線之間穿硅膠管，缺血30 min后剪斷結(jié)扎線，取出硅膠管，再灌注2 h，結(jié)扎后觀察并記錄心電圖，以結(jié)扎線以下心肌顏色變蒼白視作造模成功，然后縫合皮膚。假手術(shù)組只進(jìn)行開胸手術(shù)，暴露心臟，但不進(jìn)行結(jié)扎，其余操作同模型組。術(shù)后將大鼠仰臥放回單籠飼養(yǎng)并給予保溫直到蘇醒歸籠。蘇醒后，每只腹腔注射40×104 U青霉素，連續(xù)注射3 d。

1.5.2 分組及干預(yù)

造模成功后連續(xù)喂養(yǎng)7 d，術(shù)后按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組：模型組、陽性藥組、芪紅膠囊低劑量組［QH－L組，0.324 g/（kg·d）］、芪紅膠囊中劑量組［QH－M組，0.648g/（kg·d）］、芪紅膠囊高劑量組［QH－H組，1.296 g/（kg·d）］，每組6只。其中QH－L組、QH－M組、QH－H組大鼠分別給予相應(yīng)濃度的芪紅膠囊溶液灌胃，陽性藥組給予曲美他嗪10 mg/（kg·d）灌胃，假手術(shù)組、模型組給予等體積的生理鹽水，均按10 mL/kg體質(zhì)量灌胃給藥，每日1次，連續(xù)干預(yù)4周。每天觀察大鼠精神、運(yùn)動(dòng)、糞便、皮毛等狀態(tài)及飲食飲水行為有無異常。

1.5.3 樣本采集及制備

1.5.3.1 血標(biāo)本

灌胃4周后，各組大鼠均禁食不禁水12 h，按照以下操作進(jìn)行標(biāo)本采集：大鼠從腹主動(dòng)脈取血，分離血清，3 500 r/min，4 ℃，離心15 min，使血清分離，－80 ℃冰箱保存，用于血清學(xué)檢測(cè)。

1.5.3.2 心肌組織標(biāo)本

取血后，腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g，麻醉后打開胸腔，無菌條件下取心臟組織標(biāo)本，預(yù)冷的生理鹽水沖洗，濾紙吸干。再將心臟沿左室長(zhǎng)軸分為2份，取材過程盡量減小對(duì)組織的牽拉、挫傷與擠壓等機(jī)械損傷，其中一份迅速投入2.5%戊二醛固定液中4 ℃固定，以備病理組織檢測(cè)；另一份心臟組織置于液氮中保存，以備蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 心臟結(jié)構(gòu)及功能檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組大鼠麻醉后，仰臥位固定，胸部備皮，選用高頻探頭（頻率為6～13 MHz），與胸骨成20～30°夾角，顯示心臟沿二尖瓣口至心尖方向的左室長(zhǎng)軸切面。在乳頭肌水平將M型取樣線垂直于室間隔和左心室后壁獲得M型超聲心動(dòng)圖，測(cè)定左室舒張末期內(nèi)徑（LVEDD）、左室收縮末期內(nèi)徑（LVESD）、左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、短軸縮短率（FS）。每組數(shù)據(jù)取連續(xù)3個(gè)心動(dòng)周期的平均值。

1.6.2 TUNEL染色觀察心肌組織病理形態(tài)

制備大鼠心肌組織后，按照TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒方法檢測(cè)，采用TUNEL標(biāo)記凋亡的細(xì)胞核，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞有無肥大、變性、壞死； 間質(zhì)有無充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維結(jié)締組織增生；心內(nèi)膜、心外膜有無充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。于400倍視野計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡

率（%）＝凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6.3 血清學(xué)檢測(cè)

應(yīng)用ELISA檢測(cè)各組大鼠血清Glu、LD、KB和FFA的含量，具體操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書執(zhí)行，測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔的吸光度A，根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品濃度。

1.6.4 線粒體膜電位檢測(cè)

收集各組新鮮采集的大鼠心臟組織，剪碎后放在篩網(wǎng)上，以眼科鑷或刮刀輕研磨組織塊，邊研磨邊用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，將組織研磨完。收集細(xì)胞懸液，500×g離心10 min，去上清留沉淀。用預(yù)冷的PBS洗滌2遍，加入500 μL 1×JC－1染色液重懸細(xì)胞，37 ℃孵育30 min，加入500 μL PBS重選細(xì)胞，過200目篩網(wǎng)，制成單細(xì)胞懸液，按照

JC－1法檢測(cè)細(xì)胞線粒體蛋白濃度，用陰性對(duì)照管調(diào)節(jié)前向散射光（FSC）、側(cè)向散射光（SSC）和熒光通道的電壓，并在此電壓條件下，觀察樣本線粒體膜電位△Ψm水平變化。

1.6.5 mPTP檢測(cè)

收集各組新鮮采集的大鼠心臟組織，加入1 mL Calcein AM染色液，取10 μL的Calcein AM （1 000×）和100 μL促溶劑（100×），加入到10 mL的檢測(cè)緩沖液（Assay buffer）中混勻，重懸細(xì)胞，同時(shí)添加100 μL的氯化鈷（CoCl2）（100×）溶液；37 ℃孵育30 min，孵育完成后，1 000 r/min室溫離心5 min收集細(xì)胞。加入500 μL PBS重懸細(xì)胞，過200目篩網(wǎng)，制成單細(xì)胞懸液，在最佳激發(fā)波長(zhǎng)494 nm、發(fā)射波長(zhǎng)517 nm下［異硫氰酸熒光素（FITC）通道］使用mPTP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.6.6 線粒體ROS含量檢測(cè)

收集各組新鮮采集的大鼠心臟組織，制備單細(xì)胞懸液。每管加入1 mL PBS與1 μL 5 mmol/L MitoSOXTM Red指示劑，MitoSOXTM Red終濃度為5 μmol/L。置于培養(yǎng)箱中37 ℃孵育30 min，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，用PBS重懸細(xì)胞至1×106個(gè)/mL，取500 μL細(xì)胞懸液至5 mL流式管中，在最佳激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)580 nm下（PE通道），使用MitoSOXTM Red 線粒體超氧化物指示劑，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其熒光強(qiáng)度。

1.6.7 Western Blot檢測(cè)大鼠心肌組織AKT、AMPK、mTOR蛋白表達(dá)

提取各組大鼠心臟組織樣本，首先在組織樣本中加入RIPA裂解液提取蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）法測(cè)定目標(biāo)蛋白濃度以及p－AKT、p－AMPK、p－mTOR蛋白磷酸化水平，經(jīng)十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺（SDS－PAGE）凝膠電泳后將蛋白轉(zhuǎn)染至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，浸泡于Western Blot封閉液后封閉，加入相應(yīng)一抗，稀釋比例AKT（1∶1000），p－AKT（1∶1000），AMPK（1∶800），

p－AMPK（1∶800），mTOR（1∶800），p－mTOR（1∶500），β－actin（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次5 min。加入相應(yīng)稀釋的二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次5 min。用ChemiScope mini化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)顯影，Western Blot檢測(cè)并分析AKT、AMPK、mTOR蛋白表達(dá)以及p－AKT、p－AMPK、p－mTOR蛋白磷酸化水平。條帶灰度值采用Quantity One v.4.6.2軟件進(jìn)行讀取處理，以β－actin為內(nèi)參，用實(shí)驗(yàn)所得灰度值除以內(nèi)參灰度值得到相應(yīng)灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD）檢驗(yàn)（方差齊）或Dunnett′s－T3檢驗(yàn)（方差不齊）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行圖像繪制。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

假手術(shù)組大鼠活動(dòng)自如，兩眼有神，反應(yīng)迅速，飲食、飲水自如，糞便成形，皮毛有光澤；模型組、QH－L組、QH－M組、QH－H組及陽性藥組大鼠活動(dòng)稍有笨拙，精神不振，毛發(fā)無光澤，進(jìn)食、飲水量減少，6組均無大鼠死亡。

2.2 造模后心電圖表現(xiàn)

大鼠皮下插針記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖，于左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎后模型組、QH－L組、QH－M組、QH－H組及陽性藥組QRS波群增高、增寬、ST段抬高。假手術(shù)組大鼠心電圖基本正常，無QRS波群增高、增寬、ST段抬高現(xiàn)象。詳見圖1。 造模后觀察心肌，模型組、QH－L組、QH－M組、QH－H組及陽性藥組均以結(jié)扎線以下心肌顏色變蒼白，提示造模成功。

2.3 各組大鼠心臟結(jié)構(gòu)與功能比較

與假手術(shù)組比較，模型組LVEDD、LVESD均明顯升高，LVEF、FS均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，QH－M組、QH－H組LVESD明顯縮小，QH－L組、QH－M組、QH－H組LVEF、FS明顯升高，陽性藥組LVEDD、LVESD明顯降低，LVEF、FS明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與QH－L組比較，QH－H組LVESD明顯降低，QH－M組、QH－H組LVEF、FS明顯升高，陽性藥組LVEDD、LVESD明顯縮小，LVEF、FS明顯增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組彩超結(jié)果見圖2，心臟參數(shù)見表1。

2.4 各組大鼠心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)及凋亡情況比較

TUNEL染色顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，心肌細(xì)胞肥大、變性、壞死，間質(zhì)充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維結(jié)締組織增生，凋亡率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，QH－L組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量未見明顯減少，部分心肌細(xì)胞輕度肥大，間質(zhì)充血、水腫、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），QH－M組、QH－H組及陽性藥組心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，少量心肌細(xì)胞肥大、變性，少量壞死，凋亡率降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2、圖3。

2.5 各組大鼠血清中Glu、LD、FFA、KB含量比較

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清Glu、LD、FFA、KB含量明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組Glu、LD、FFA、KB含量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與QH－L組比較，QH－H組LD降低，陽性藥組Glu、LD、FFA含量降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表3。

2.6 各組大鼠線粒體膜電位比較

與假手術(shù)組比較，模型組、QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組線粒體膜電位水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組線粒體膜電位水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與QH－L組比較，陽性藥組線粒體膜電位水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表4。

2.7 各組大鼠線粒體mPTP水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組、QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組線粒體mPTP水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組線粒體mPTP水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與QH－L組比較，QH－H組、陽性藥組線粒體mPTP水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表4。

2.8 各組大鼠線粒體ROS水平比較

與假手術(shù)組比較，模型組、QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組線粒體ROS水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組線粒體ROS水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與QH－L組比較，QH－H組和陽性藥組線粒體ROS水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表4。

2.9 各組大鼠心肌組織中AKT、AMPK、mTOR通路蛋白表達(dá)比較

Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，各組AKT、AMPK、mTOR總蛋白含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），p－AKT、p－AMPK、p－mTOR通路具有可比性。與假手術(shù)組比較，模型組、QH－L組、QH－M組、QH－H組和陽性藥組心肌組織p－AKT、p－mTOR蛋白表達(dá)水平下降，p－AMPK蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，QH－L組、QH－M組、QH－H組及陽性藥組大鼠心肌組織p－AKT蛋白表達(dá)水平明顯升高，QH－M組、QH－H組和陽性藥組大鼠心肌組織p－AMPK蛋白表達(dá)水平下降，QH－H組和陽性藥組大鼠心肌組織p－mTOR蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與QH－L組比較，QH－M、QH－H組和陽性藥組大鼠心肌組織p－AKT蛋白表達(dá)水平升高，p－AMPK蛋白表達(dá)水平下降，陽性藥組p－mTOR蛋白表達(dá)水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表5及圖4。

3 討 論

近年來，中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)、中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)先后發(fā)布了《慢性心力衰竭中醫(yī)診療專家共識(shí)》《慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識(shí)》等，對(duì)心衰病的基本證候特征、證候演變規(guī)律、臨床辨治等進(jìn)行梳理、總結(jié)、歸納、評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步規(guī)范慢性心力衰竭的中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合診治發(fā)揮了積極的作用。共識(shí)中以病證結(jié)合為切入點(diǎn)，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)家臨床經(jīng)驗(yàn)對(duì)心衰病因病機(jī)進(jìn)行總結(jié)，心衰病的基本證候特征為虛實(shí)夾雜，痰、瘀是心衰的重要致病病因，相互轉(zhuǎn)化，相互滋生，以血瘀為主，兼雜痰濕、水飲，更有氣血、陰陽的虛損，痰與瘀互為因果，共同致病，在證候演變中血瘀、痰飲始終貫穿于心衰病發(fā)生、發(fā)展，二者分別為氣血和津液的病理性改變，兩者又不斷疊加促進(jìn)心衰病演變惡化［16－20］。結(jié)合以上病因病機(jī)，芪紅膠囊組方中重用黃芪為君，善補(bǔ)胸中大氣，大氣壯旺，氣行瘀血?jiǎng)t通，痰濁則化，即“大氣一轉(zhuǎn)，其結(jié)乃散”。桂枝、紅景天共為臣藥，桂枝祛痰通脈、痰瘀均治。紅景天為氣中血藥，補(bǔ)氣養(yǎng)血，扶正固本。丹參、葶藶子、澤瀉為佐使藥，下氣平喘、降氣化痰、利水消腫。諸藥配伍，補(bǔ)中有通、通中有補(bǔ)、通補(bǔ)并用，扶正祛邪。本課題組前期研究表明，芪紅方能夠增加冠狀動(dòng)脈血流量及靜脈血氧含量，使得心肌氧供應(yīng)充分，降低氧利用率，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步增加心輸出量和改善心臟功能。研究表明，心力衰竭是一種具有嚴(yán)重線粒體功能障礙的生物能量疾?。?1］，線粒體中Glu、LD、FFA、KB的氧化有助于心肌細(xì)胞三磷酸腺苷（ATP）的產(chǎn)生［22］。本研究發(fā)現(xiàn)，IHF存在代謝產(chǎn)物的過度堆積，Glu、LD、FFA、KB不能被充分利用，降低代謝物活力，經(jīng)過芪紅膠囊干預(yù)后調(diào)節(jié)心肌底物代謝進(jìn)程，顯著提高模型大鼠的心功能，逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)，抑制心肌細(xì)胞凋亡。心肌對(duì)代謝底物的如何選擇和利用，具體調(diào)控機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。線粒體能量代謝在心肌細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，甚至決定性作用［23］。新的證據(jù)表明ROS在正常生理狀態(tài)下，心肌細(xì)胞產(chǎn)生少量的ROS，其在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中起作用，并且很容易從細(xì)胞中清除。在病理狀態(tài)下，ROS產(chǎn)生的速率超過清除的速率，導(dǎo)致氧化應(yīng)激，ROS與細(xì)胞和線粒體組分（如蛋白質(zhì)、DNA、脂質(zhì)和其他分子）相互作用，觸發(fā)線粒體功能障礙，導(dǎo)致線粒體膜電位消失和mPTP持續(xù)開放［24］，并伴隨嚴(yán)重的心臟損傷［25］。本研究通過左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎法建立IHF模型，以結(jié)扎線以下心肌顏色變蒼白，提示造模成功，亦證實(shí)心肌細(xì)胞缺血、缺氧，衰竭的心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS的大量生成，導(dǎo)致線粒體功能受損［26］。芪紅膠囊干預(yù)后可以減少IHF大鼠心肌細(xì)胞ROS的產(chǎn)生，降低mPTP的通透性，減輕線粒體功能障礙，緩解心肌損傷。

研究表明，AKT/AMPK－mTOR信號(hào)通路具有雙向調(diào)節(jié)能量的作用，AMPK通過感知一磷酸腺苷（AMP）、ATP和二磷酸腺苷（ADP）的比率變化而被激活，參與ATP的代謝過程，恢復(fù)能量平衡。當(dāng)心功能低下時(shí)，機(jī)體會(huì)對(duì)心肌“能量饑餓狀態(tài)”產(chǎn)生應(yīng)激性代償反應(yīng)，通過心肌細(xì)胞AMPK調(diào)節(jié)組織的代謝來控制能量平衡，是調(diào)節(jié)機(jī)體能量平衡的總開關(guān)［27］。mTOR主要受上游信號(hào)AKT和p－AMPK的調(diào)控發(fā)揮能量雙向調(diào)節(jié)作用［28］。本研究結(jié)果顯示，IHF大鼠心肌p－AMPK蛋白含量升高，p－AKT、p－mTOR的蛋白含量下降，提示AKT/AMPK－mTOR信號(hào)通路參與了心力衰竭細(xì)胞線粒體能量代謝的生物發(fā)生進(jìn)程，芪紅膠囊干預(yù)后能夠明顯升高p－AKT的蛋白含量，降低p－AMPK的蛋白含量，表明AKT高表達(dá)后通過激活mTOR抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善線粒體功能。而QH－H組AKT激活程度更強(qiáng)，表現(xiàn)為AMPK、mTOR活性表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)心肌能量生成，進(jìn)一步改善心力衰竭［29］，機(jī)制可能與AKT/AMPK－mTOR信號(hào)通路蛋白的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)芪紅膠囊可以提高IHF大鼠的心功能，抑制細(xì)胞凋亡，抑制mPTP的開放程度，減輕線粒體功能障礙，緩解心肌損傷，AKT/AMPK－mTOR信號(hào)通路參與心力衰竭細(xì)胞線粒體能量代謝的生物發(fā)生進(jìn)程，并能夠通過激活p－AKT活性，下調(diào)p－AMPK、ROS蛋白表達(dá)，發(fā)揮改善心力衰竭的作用。本研究為深入探索芪紅膠囊治療心力衰竭獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)機(jī)制提供了新的參考依據(jù)。

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（收稿日期：2023－12－03）

（本文編輯王麗）

基金項(xiàng)目 新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.2022D01C558）；省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題資助項(xiàng)目（No.SKL－HIDCA－2021－42）

通訊作者 王曉峰，E－mail：wxf87112008@163.com

引用信息 翟雪芹，朱鵬程，王曉峰，等.芪紅膠囊對(duì)缺血性心力衰竭大鼠心肌線粒體能量代謝及AKT/AMPK－mTOR信號(hào)通路的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2024，22（12）：2150－2158.