除風(fēng)益損湯對(duì)兔角膜損傷后瘢痕形成及TGF-β1、Smad3、 α-SMA蛋白表達(dá)的影響

〔摘要〕 目的 探討除風(fēng)益損湯對(duì)兔角膜損傷后瘢痕形成及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（ransforming growth factor-beta 1， TGF-β1）、果蠅母本抗生存因子蛋白3（small mothers against decapentaplegic 3， Smad3）、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin， α-SMA）蛋白表達(dá)的影響。方法 取健康月齡新西蘭兔48只，按隨機(jī)數(shù)字法將其分成4組，每組12只，設(shè)為空白組、模型組、除風(fēng)益損湯組（以下簡(jiǎn)稱中藥組）、重組牛堿成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子滴眼組（以下簡(jiǎn)稱貝復(fù)舒組）；中藥組予除風(fēng)益損湯灌胃，1次/d，空白組、模型組、貝復(fù)舒組予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，貝復(fù)舒組予重組牛堿成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子滴眼液滴眼，3次/d；建模后各組于7、14、28 d在高倍顯微鏡下觀察角膜損傷修復(fù)情況，共聚焦激光斷層掃描觀察角膜細(xì)胞，Masson染色觀察角膜組織病理改變，Western blot檢測(cè)角膜組織中TGF-β1、Smad3、α-SMA蛋白表達(dá)。結(jié)果 眼前節(jié)拍照：可見兔角膜7、14、28 d時(shí)中藥組、貝復(fù)舒組角膜損面積傷較模型組角膜損傷面積明顯減小。共聚焦激光斷層掃描角膜淺層細(xì)胞：在造模后28 d，模型組呈現(xiàn)出大量瘢痕組織，同時(shí)存在肌成纖維細(xì)胞；中藥組和貝復(fù)舒組可見成纖維細(xì)胞及角膜基質(zhì)細(xì)胞，以及極少量瘢痕組織。角膜混濁度分級(jí)：與空白組比較，模型組在造模后7、14、28 d的角膜混濁分級(jí)均明顯升高（Plt;0.01），呈時(shí)間相關(guān)性，但28 d時(shí)模型組的角膜混濁分級(jí)出現(xiàn)回落，與模型組相比，中藥組和貝復(fù)舒組在造模后7、14、28 d的角膜混濁分級(jí)均明顯降低（Plt;0.01），且呈時(shí)間相關(guān)性（Plt;0.01）。Masson切片染色：在造模后28 d，空白組可見角膜上皮整齊連續(xù)排列，基質(zhì)層纖維排列整齊，染色致密，厚度均一；模型組傷口處角膜上皮細(xì)胞不連續(xù)分布，且角膜前部基質(zhì)淺藍(lán)色膠原纖維排列紊亂，呈不連續(xù)狀態(tài)，厚度不一，角膜后部基質(zhì)淺藍(lán)色膠原纖維排列較混亂，呈紊亂纖維束；中藥組可見角膜前部基質(zhì)淺藍(lán)色膠原纖維較模型組排列有序，稍疏松，呈連續(xù)狀態(tài)，角膜后部基質(zhì)淺藍(lán)色膠原纖維排列有序；貝復(fù)舒組見角膜前部基質(zhì)淺藍(lán)色膠原纖維較模型組排列有序，稍疏松，呈連續(xù)狀態(tài)，仍存在纖維束，角膜后部基質(zhì)淺藍(lán)色膠原纖維排列有序。Western blot檢測(cè)：與模型組比較，中藥組、貝復(fù)舒組的角膜組織中TGF-β1、Smad3、α-SMA蛋白表達(dá)在7、14、28 d時(shí)均顯著降低（Plt;0.05）。結(jié)論 除風(fēng)益損湯能促進(jìn)角膜損傷修復(fù)，抑制角膜瘢痕化，并對(duì)TGF-β1、Smad3、α-SMA蛋白產(chǎn)生影響。

〔關(guān)鍵詞〕 除風(fēng)益損湯；角膜瘢痕化；角膜修復(fù)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；果蠅母本抗生存因子蛋白3；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白

〔中圖分類號(hào)〕R285.5" " " " "〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A" " " " " 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.11.002

Effects of Chufeng Yisun Decoction on scar formation and protein expressions of TGF-β1， Smad3， and α-SMA in rabbits after

corneal injury

ZHU Bingyao1，2，4，5， ZENG Lingcong1，3，4， LIU Qianhong4， LI Jiangwei4， WU Kai4， CHEN Xiong4，

PENG Qinghua4， YAO Xiaolei1*

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Shenzhen Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine， Shenzhen， Guangdong 518104， China; 3. Chenzhou Municipal Hospital of TCM，Chenzhou， Hunan 423000， China; 4. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

5. Shenzhen Clinical School of Integrated Chinese and Western Medicine， Guangzhou University of Chinese Medicine，

Shenzhen， Guangdong 518104， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the effects of Chufeng Yisun Decoction （CFYSD） on scar formation and protein expressions of transforming growth factor-beta 1 （TGF-β1）， small mothers against decapentaplegic 3 （Smad3）， and α-smooth muscle actin （α-SMA） after corneal injury in rabbits. Methods Forty-eight healthy New Zealand rabbits of the same age were divided into four groups using the random number method， namely blank group， model group， CFYSD group， and eye drop group with recombinant bovine basic fibroblast growth factor （hereinafter referred to as the \"Beifushu group\"）， with 12 rabbits in each group. CFYSD group was given adult equivalent dose of CFYSD via gavage once a day， while blank， model， and Befushu groups were given the same volume of normal saline via gavage once a day; additionally， Befushu group was administered with eye drops containing recombinant bovine basic fibroblast growth factor three times a day. At 7， 14， and 28 days after modeling， corneal injury and repair were observed under a high-power microscope， corneal cells were examined by confocal laser tomography， pathological changes of corneal tissue were observed by Masson staining， and the protein expressions of TGF-β1， Smad3， and α-SMA in corneal tissue were determined by Western blot. Results Photographs of the anterior segment showed that at 7， 14， and 28 days after modeling， the corneal lesion area in CFYSD and Befushu groups was significantly smaller than that in model group. Confocal laser tomography of superficial corneal cells revealed that at 28 days after modeling， model group exhibited a large amount of scar tissue， along with the presence of myofibroblasts. In contrast， CFYSD and Befushu groups showed fibroblasts and corneal stromal cells， with only minimal scar tissue present. Corneal opacity grading showed that compared with blank group， the corneal opacity grade of model group significantly increased at 7， 14， and 28 days after modeling （Plt;0.01）， showing a time-dependent correlation; however， it then fell at 28 days， which may be due to the self-healing ability of rabbit cornea. Compared with model group， the corneal opacity grades of CFYSD and Beifushu groups were significantly reduced at 7， 14， and 28 days after modeling （Plt;0.01）， and the reduction trend increased over time， showing a time-dependent correlation （Plt;0.01）. Masson staining revealed that at 28 days after modeling， blank group showed neatly and continuously arranged corneal epithelium and orderly aligned stromal fibers， with uniform thickness and dense staining. In model group， the corneal epithelial cells in the lesion were distributed discontinuously; the light blue-stained collagen fibers in the anterior corneal stroma were disordered and discontinuous with uneven thickness， and those in the posterior stroma were also arranged in a chaotic manner， appearing as disordered fiber bundles. Compared with model group， the light blue-stained collagen fibers in the anterior stroma in CFYSD group were more orderly and slightly looser， appearing continuous， and those in the posterior stroma were also arranged orderly. Compared with model group， the light blue-stained collagen fibers in the anterior stroma in Befushu group were more orderly， slightly looser， and continuous， with fiber bundles still present， and those in the posterior stroma were also arranged orderly. Western blot showed that at 7， 14， and 28 days after modeling， the protein expression of α-SMA in the corneal tissue was the highest in model group， while it was significantly lower in CFYSD and Befushu groups than that in model group （Plt;0.05）; similarly， the protein expressions of TGF-β1 and Smad3 were also the highest in model group at these time points， while they were significantly lower in CFYSD and Befushu groups than those in model group （Plt;0.05）. Conclusion CFYSD can promote the repair of corneal injury， inhibit corneal scarring， and exert effects on TGF-β1， Smad3， and α-SMA protein expressions.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Chufeng Yisun Decoction; corneal scarring; corneal repair; transforming growth factor-beta 1; small mothers against decapentaplegic 3; α-smooth muscle actin

角膜具有保護(hù)眼球的作用，是位于眼球前壁無(wú)血管透明組織，其透明性主要由細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維有序排列所維持[1]。角膜常因外傷或有害因素導(dǎo)致角膜損傷，隨后機(jī)體將產(chǎn)生正常的生理反應(yīng)即角膜損傷修復(fù)來維持角膜的生理功能。角膜損傷修復(fù)延遲有可能導(dǎo)致角膜瘢痕化，對(duì)視力產(chǎn)生重大影響，嚴(yán)重者可致失明[2-3]。這主要是由于角膜基質(zhì)的纖維化造成的，肌成纖維細(xì)胞的產(chǎn)生和持續(xù)存在是角膜基質(zhì)纖維化的重要因素[4]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-beta 1， TGF-β1）是一種作用廣泛的細(xì)胞因子，它的激活啟動(dòng)了膠原纖維積累的程序，其信號(hào)的失調(diào)與組織纖維化密切相關(guān)[5]，對(duì)角膜組織損傷修復(fù)非常重要。TGF-β1能刺激成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，肌成纖維細(xì)胞能合成和分泌的α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA），能促進(jìn)傷口修復(fù)，加重瘢痕化的產(chǎn)生[6]。果蠅母本抗生存因子蛋白3（small mothers against decapentaplegic 3， Smad3）是TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要介質(zhì)，將細(xì)胞外TGF-β信號(hào)經(jīng)胞質(zhì)傳導(dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)的重要中介，該傳導(dǎo)通路的活躍程度與瘢痕化亦密切相關(guān)[7]。

角膜損傷修復(fù)中所生瘢痕類似于中醫(yī)學(xué)之“翳證”。翳有廣義和狹義之分，狹義的翳專指角膜（黑睛）上的混濁，廣義的翳則包括眼內(nèi)各組織的混濁性病變[8]。由于黑睛受損后，常以翳障的形式表現(xiàn)出來，所以臨床上所說的“翳”多指其狹義，即角膜混濁。翳又分新翳和老翳。新翳表現(xiàn)為黑睛廣泛混濁、表面粗糙、邊緣模糊，具有向周圍和深部組織發(fā)展的趨勢(shì)，并伴有不同程度白睛混赤、畏光流淚、疼痛難睜等癥狀，類似于角膜炎癥性混濁[9]。老翳即宿翳，常表現(xiàn)為表面光滑、邊緣清楚，無(wú)發(fā)展趨勢(shì)，類似西醫(yī)角膜炎潰瘍愈合后形成的瘢痕，可分為角膜云翳、角膜斑翳及角膜白斑[10]?！对瓩C(jī)啟微·風(fēng)熱不治之病》謂“翳猶瘡也”，認(rèn)為翳之所生，多因“風(fēng)熱不制”及“七情五賊勞役饑飽”所致[11]。除風(fēng)益損湯出自《原機(jī)啟微》，具有疏風(fēng)清熱、養(yǎng)血活血之功效。多項(xiàng)研究表明，除風(fēng)益損湯能減少眼外傷后角膜炎癥的產(chǎn)生及促進(jìn)角膜組織的愈合，同時(shí)對(duì)減輕術(shù)后角膜水腫也有較好的療效[12-14]。

有研究報(bào)道，中醫(yī)藥對(duì)治療角膜瘢痕有較好的療效，但對(duì)中醫(yī)藥治療角膜瘢痕的具體作用途徑及相關(guān)機(jī)制的研究不多，亦不夠深入[15-16]。因此，本研究基于臨床療效及文獻(xiàn)閱讀的基礎(chǔ)之上，通過建立兔角膜損傷模型，進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討除風(fēng)益損湯對(duì)角膜損傷修復(fù)后瘢痕化及其相關(guān)因子TGF-β1、Smad3、α-SMA的影響；為中醫(yī)藥治療本病的方藥選擇提供理論支持，為同類研究提供技術(shù)借鑒。

1 材料和方法

1.1" 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康月齡雄性普通級(jí)純種新西蘭白兔48只，體質(zhì)量1.8～2.5 kg，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心統(tǒng)一購(gòu)買，實(shí)驗(yàn)兔均無(wú)角膜疾病，在普通級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為22～26 ℃，濕度為42%～70%。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理與福利倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：LL20210921001）。

1.2" 實(shí)驗(yàn)藥物

除風(fēng)益損湯組成：熟地黃3 g，當(dāng)歸3 g，白芍3 g，川芎3 g，藁本2.1 g，前胡2.1 g，防風(fēng)2.1 g。藥物購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，產(chǎn)地四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司，該藥為顆粒劑，根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)用量，分袋密封包裝，室溫條件下儲(chǔ)存。重組牛堿成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子滴眼液（株海億勝生物制藥有限公司，批號(hào)：XY0637）；鹽酸左氧氟沙星眼用凝膠（湖北遠(yuǎn)大天天明制藥有限公司，批號(hào)：XY3595）。

1.3" 主要試劑

二甲苯、無(wú)水乙醇、95%乙醇（西隴科學(xué)股份有限公司，批號(hào)：33535、32061、32061）；Masson三色染色液（塞爾維生物，批號(hào)：G1006）；中性樹脂膠（康為世紀(jì)，批號(hào)：CW0136）；cocktail（上海源葉有限公司，批號(hào)：10557）；脫脂奶粉（伊利，批號(hào)：66196131T）；TEMED、Trise-Base、溴酚藍(lán)、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、PMSF（美國(guó)Amresco公司，批號(hào)：Amresc00761、Exp2017/12、BO449-5G、Exp2016109、Amresc00172、329-98-6）；Hcl（信陽(yáng)市化學(xué)試劑廠，批號(hào)：GB622-89）；SDS、甘油、甲醇、Nacl、Kcl、Na2HPO4.12H2O、KH？鄄PO4（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：30166428、10010618、10014118、10016318、10020318、10017618、10019718）；甘氨酸、三硫叔糖醇（DTT）、Tris-base、Glycine（蘭杰柯，批號(hào)：Exp2017106、Amresco0281、BS083、BL603B）；蛋白marker（北京全氏金生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：DM111）；PVDF膜（0.45 um）（密理博，批號(hào)：IPVH00010）；ECL底物液（賽默飛，批號(hào)：NCI5079）；戊巴比妥鈉（美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：P3761）；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（增強(qiáng)型）（碧云天，批號(hào)：P0010S）；α-SMA、Smad3（Affinity，批號(hào)：AF1032、AF6362）；TGF-β（proteintech，批號(hào)：21898-1-AP）；熒光素鈉（廣西梧州制藥股份有限公司，批號(hào)：XY7321）；眼球固定液（武漢卡諾斯科技有限公司，批號(hào)：R30102）。

1.4" 主要儀器

組織脫水機(jī)（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：KD-TS3S1）；石蠟包埋機(jī)（德國(guó)Leica，型號(hào)：HistoCore Arcadia）；攤片機(jī)（德國(guó)Leica HI1210，型號(hào)：Leica）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：HGZF-101-1）；顯微鏡（日本OLYMPUS，型號(hào)：CX43）；電泳儀（上海Tanon，型號(hào)：EPS300）；水平搖床（ORBITAL，型號(hào)：SHAKER TS-1000）；pH計(jì)（德國(guó)Metter-Toledo GmbH公司，型號(hào)：LP115）；電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，型號(hào)：CPA）；磁力攪拌器（江蘇省金壇市中大儀器廠，型號(hào)：T8-1）；酶標(biāo)儀（賽默飛，型號(hào)：muLISKANMK3）；月形隧道刀頭（宿遷天工醫(yī)療，型號(hào)：2.8 mm月形刀）；共焦激光斷層掃描儀（德國(guó)Heidelberg Engineering GmbH，型號(hào)：HRT3）；7×-50×倍三目顯微鏡（深圳市海約電子有限公司，型號(hào)：HY-0750A）；4800萬(wàn)像素高清相機(jī)（深圳市海約電子有限公司，型號(hào)：HY-0750A）；角膜環(huán)鉆（淮安中林東晟醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：直徑6 mm）。

1.5" 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1" 實(shí)驗(yàn)造模" 根據(jù)所查閱的文獻(xiàn)及臨床基礎(chǔ)，參照CONNON及王麗等[17-18]的方法，對(duì)造模方法稍作改良，予48只健康月齡雄性新西蘭兔，體質(zhì)量1.8～2.5 kg，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，空白組不做處理，將模型組、中藥組、貝復(fù)舒組置于固定箱中固定，使用10%戊巴比妥鈉（1.5～4 mL/kg）緩慢推入耳緣靜脈進(jìn)行全身麻醉，觀察實(shí)驗(yàn)兔意識(shí)，待雙眼瞬目反射消失后，將實(shí)驗(yàn)兔用手術(shù)孔巾包裹置于手術(shù)臺(tái)上，并滴用0.4%鹽酸奧布卡因進(jìn)行眼部表面麻醉，用直徑為6 mm角膜環(huán)鉆在角膜中央進(jìn)行旋轉(zhuǎn)按壓，在角膜上留下一直徑為6 mm左右的圓形印記，并按照印記使用2.8 mm的月形隧道刀進(jìn)行角膜板層分離，剔除100～150 μm厚度角膜表層，且不穿通角膜，形成一直徑6 mm左右，深100～150 μm的角膜損傷區(qū)，術(shù)后角膜損傷模型兔均以鹽酸左氧氟沙星眼用凝膠滴眼進(jìn)行術(shù)后預(yù)防感染，角膜情況均符合條件后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5.2" 實(shí)驗(yàn)分組" 采用隨機(jī)數(shù)字表法將普通雄性新西蘭兔分為空白組、模型組、除風(fēng)益損湯組（中藥組）、重組牛堿成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子滴眼組（貝復(fù)舒組），共4組，每組12只。

1.5.3" 動(dòng)物給藥" 中藥組予除風(fēng)益損湯溶液灌胃，用生理鹽水配制成0.1 g/mL除風(fēng)益損湯溶劑。根據(jù)人與動(dòng)物體表面積折算，人用劑量50 mL/d，計(jì)算出兔等效劑量為0.304 g/（kg·d），實(shí)驗(yàn)兔每日服用約5 mL。貝復(fù)舒組予重組牛堿成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子滴眼液滴雙眼，3次/d；空白組、模型組、貝復(fù)舒組均以等劑量生理鹽水常規(guī)喂養(yǎng)。

1.6" 動(dòng)物處理及指標(biāo)檢測(cè)

分別在空白組、模型組、中藥組、貝復(fù)舒組7、14、28 d時(shí)取4只實(shí)驗(yàn)兔以空氣栓塞處死，即刻摘除雙眼球，其中4只眼球放入試管保存于-80 ℃冰箱用于蛋白檢測(cè)，剩余4只眼球放入眼球固定液固定用于制備病理切片。

1.6.1" 眼前節(jié)拍照及角膜上皮熒光素染色觀察角膜損傷修復(fù)情況" 造模成功后7、14、28 d分別在高倍顯微鏡下對(duì)兔角膜進(jìn)行直接拍照以觀察實(shí)驗(yàn)兔角膜損傷修復(fù)情況；使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的熒光素鈉溶液滴眼進(jìn)行角膜染色，在高倍顯微鏡下使用鈷藍(lán)光燈照射進(jìn)行拍照，觀察角膜上皮損傷修復(fù)情況。

1.6.2" 共聚焦激光斷層掃描觀察角膜細(xì)胞" 將4組新西蘭兔分別在7、14、28 d予共焦激光斷層掃描儀檢查，予以?shī)W布卡因滴眼液進(jìn)行雙眼表面麻醉3次，用左氧氟沙星凝膠滴于共聚焦激光頭表面，并蓋上無(wú)菌接觸帽；固定實(shí)驗(yàn)兔眼，使其貼近于共焦激光斷層掃描儀的激光頭，觀察并采集角膜細(xì)胞圖像。

1.6.3" 角膜混濁分級(jí)評(píng)估角膜瘢痕程度" 在造模7、14、28 d后，使用盲法，在裂隙燈顯微鏡觀察下對(duì)4組實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行兔角膜混濁程度的臨床評(píng)分，臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[19]，評(píng)分細(xì)則及具體標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.6.4" Masson染色觀察角膜組織病理結(jié)構(gòu)變化" 將已固定好的角膜組織經(jīng)脫水、透明、包埋、切片。將切片浸入Masson A液中室溫浸泡過夜，再將切片浸泡于Masson A液內(nèi)于65 ℃烤箱內(nèi)孵育30 min，自來水洗30 s，同時(shí)將Masson D液及Masson F液放于65 ℃烤箱內(nèi)預(yù)熱。將Masson B液與Masson C液等體積混合，切片入混合液內(nèi)浸染1 min，流水稍洗。將切片經(jīng)1%鹽酸乙醇分化1 min左右，自來水稍洗，將切片入Masson D液浸染6 min，觀察組織呈現(xiàn)亮紅色。將切片稍微瀝干水分后放入Masson E液浸泡約1 min。觀察到膠原纖維呈淺紅色，纖維呈紅色即可。切片稍微瀝干Masson E液后，不經(jīng)水洗，直接入Masson F液染色。切片經(jīng)連續(xù)三缸無(wú)水乙醇依次脫水，最后經(jīng)兩缸二甲苯透明，中性樹膠封片，最后顯微鏡下進(jìn)行拍照記錄。

1.6.5" Western blot檢測(cè)角膜組織中TGF-β1、Smad3、α-SMA相對(duì)蛋白表達(dá)情況" 準(zhǔn)備1×TBST，10×電泳緩沖液，10×電轉(zhuǎn)緩沖液，5%牛奶封閉液，用RIPA強(qiáng)裂解液稀釋PMSF，配制裂解液；取角膜組織，PBS 洗滌后用RIPA裂解液進(jìn)行勻漿，BCA法測(cè)定蛋白濃度；提取上樣量，按照要求配制分離膠與濃縮膠后完成電泳。接著將蛋白條帶與PVDF膜及濾紙一同放入轉(zhuǎn)膜緩沖液完成轉(zhuǎn)膜，用含5%脫脂奶粉的TBST（封閉液）浸泡PVDF膜，室溫?fù)u床封閉2 h。稀釋相應(yīng)的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗α-SMA（Affinity， AF1032，1∶1 000）、TGF-β（proteintech，21898-1-AP，1∶2 000）、Smad3（Affinity，AF6362，1∶1 000）孵育液中，4 ℃孵育過夜。用封閉液稀釋HRP標(biāo)記二抗1∶1 000稀釋，TBST充分洗滌PVDF膜，5 min/次PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，37 ℃搖床孵育2 h。制備AB液，加入AB混合液，用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光30/60 s，觀察結(jié)果并保存圖片。

1.7" 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0軟件分析，計(jì)量資料以“ｘ±s”表示，多組間定量資料或數(shù)值變量資料比較符合正態(tài)性及方差齊性則采用單因素方差分析及多重比較；不滿足正態(tài)性及方差齊性則采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，兩兩比較。均以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)圖使用GraphPad Prism 8繪制。

2 結(jié)果

2.1" 眼前節(jié)拍照觀察角膜損傷修復(fù)情況

在造模后7 d時(shí)，模型組與空白組相比角膜表面不平整，白色光環(huán)及虹膜未能清晰顯現(xiàn)；中藥組與模型組相比，角膜表面均不平整，白色光環(huán)及虹膜均未能清晰顯現(xiàn)；貝復(fù)舒組與中藥組相比，角膜表面均不平整，白色光環(huán)及虹膜均未能清晰顯現(xiàn)；模型組、中藥組、貝復(fù)舒組兔角膜均存在大面積熒光素著染。在造模后14 d時(shí)，模型組與空白組相比角膜表面不平整，白色光環(huán)及虹膜未能清晰顯現(xiàn)；中藥組與模型組相比，角膜表面稍平整，白色光環(huán)及虹膜均能更清晰顯現(xiàn)；貝復(fù)舒組與中藥組相比，角膜表面均仍有不平整，白色光環(huán)及虹膜均未能清晰顯現(xiàn)；中藥組、貝復(fù)舒組與模型組相比，兔角膜熒光素著染減少。在造模后28 d時(shí)，模型組與空白組相比角膜表面不平整，白色光環(huán)及虹膜未能清晰顯現(xiàn)；中藥組與模型組相比，角膜表面更平整，白色光環(huán)及虹膜均能更清晰顯現(xiàn)；貝復(fù)舒組與中藥組相比，角膜表面均仍稍有不平整，白色光環(huán)及虹膜均能較清晰顯現(xiàn)；模型組仍存在小范圍兔角膜熒光素著染，中藥組、貝復(fù)舒組未出現(xiàn)兔角膜熒光素著染。模型組、中藥組、貝復(fù)舒組隨著時(shí)間的推移，在造模后7、14、28 d時(shí)，模型組其角膜表面仍不平整，白色光環(huán)及虹膜均不能清晰顯現(xiàn)，兔角膜熒光素染色逐漸減少；中藥組、貝復(fù)舒組其角膜表面均趨于平整，白色光環(huán)及虹膜均趨于清晰顯現(xiàn)，并在造模后28 d時(shí)未出現(xiàn)兔角膜熒光素染色。詳見圖1。

2.2" 共聚焦激光斷層掃描角膜淺層基質(zhì)細(xì)胞

在造模后7 d時(shí)，模型組、中藥組、貝復(fù)舒組均見大量細(xì)長(zhǎng)狀成纖維細(xì)胞（fibroblast）及炎性細(xì)胞。在造模后14 d時(shí)，模型組與空白組相比，存在大量成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞，同時(shí)出現(xiàn)磨砂樣、不透明瘢痕組織；中藥組與模型組相比，可見成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞減少，并可見少量角膜基質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)出現(xiàn)少量磨砂樣、不透明瘢痕組織；貝復(fù)舒組與中藥組相比，均可見成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞，并可見少量角膜基質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)出現(xiàn)少量磨砂樣、不透明瘢痕組織。在造模后28 d時(shí)，模型組與空白組相比，呈現(xiàn)出大量瘢痕組織，同時(shí)存在肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast），隱約透見零星角膜基質(zhì)細(xì)胞；中藥組與模型組相比，可見成纖維細(xì)胞及角膜基質(zhì)細(xì)胞，以及極少量瘢痕組織；貝復(fù)舒組與中藥組相比，均可見成纖維細(xì)胞及角膜基質(zhì)細(xì)胞，以及極少量瘢痕組織。詳見圖2。

2.3" 不同時(shí)間點(diǎn)兔角膜混濁分級(jí)

與空白組比較，模型組在造模后7、14、28 d的角膜混濁分級(jí)均明顯升高（Plt;0.01），但28 d時(shí)模型組的角膜混濁分級(jí)出現(xiàn)回落，這可能是由于兔角膜的自愈能力導(dǎo)致的；與模型組相比，中藥組和貝復(fù)舒組在造模后7、14、28 d的角膜混濁分級(jí)均明顯降低（Plt;0.01），且降低趨勢(shì)隨時(shí)間而增大，具有時(shí)間相關(guān)性（Plt;0.01）。詳見表2。

2.4" Masson染色觀察角膜組織中膠原纖維排列情況

Masson染色可見，空白組角膜上皮整齊連續(xù)排列，基質(zhì)層纖維排列整齊，染色致密，厚度均一（圖3A）；模型組傷口處角膜上皮細(xì)胞不連續(xù)分布，且角膜前部基質(zhì)淺藍(lán)色膠原纖維排列紊亂，呈不連續(xù)狀態(tài)，厚度不一，角膜后部基質(zhì)淺藍(lán)色膠原纖維排列較混亂，呈紊亂纖維束（圖3B）；中藥組可見角膜前部基質(zhì)淺藍(lán)色膠原纖維較模型組排列有序，稍疏松，呈連續(xù)狀態(tài)，角膜后部基質(zhì)淺藍(lán)色膠原纖維排列有序（圖3C）；貝復(fù)舒組見角膜前部基質(zhì)淺藍(lán)色膠原纖維較模型組排列有序，稍疏松，呈連續(xù)狀態(tài)，仍存在纖維束，角膜后部基質(zhì)淺藍(lán)色膠原纖維排列有序（圖3D）。

2.5" Western blot檢測(cè)角膜組織中TGF-β1、Smad3、α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量

在造模后7、14 d時(shí)，模型組與空白組相比，TGF-β1、Smad3、α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量升高（Plt;0.05）；在經(jīng)過治療后，中藥組、貝復(fù)舒組與模型組相比，TGF-β1、Smad3、α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（Plt;0.05）。在角膜損傷后28 d時(shí)，模型組與空白組相比，TGF-β1、Smad3、α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量升高；在經(jīng)過治療后，中藥組、貝復(fù)舒組與模型組相比，TGF-β1、Smad3、α-SMA蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著降低（Plt;0.05）。并可見TGF-β1、Smad3、α-SMA蛋白表達(dá)量在角膜損傷后7、14、28 d時(shí)各組均逐漸減少。詳見圖4。

3 討論

視力障礙影響著全球超過22億人，其中超過10億病例是可以預(yù)防或者通過治療進(jìn)行恢復(fù)[20]。其中由感染或損傷引起的纖維化瘢痕組織聚集，從而導(dǎo)致角膜混濁是角膜疾病致盲的主要原因[21-22]。角膜損傷修復(fù)后出現(xiàn)的瘢痕不僅在美觀上影響患者，最主要的是影響患者的生活、工作。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為角膜組織屬于黑睛范疇[23]，五輪學(xué)說中屬“風(fēng)輪”。黑睛暴露于外，易受外傷及邪毒侵襲，又因?yàn)楹诰ι蠠o(wú)血絡(luò)營(yíng)養(yǎng)保護(hù)，抵抗力較低，一旦發(fā)生病變，容易遺留翳膜[24]。黑睛透明則能透視萬(wàn)物，一旦受損，混濁生翳，則遮擋視物，影響視力。《傷科匯纂》[25]指出：“大凡傷損癥，有外邪乃乘虛而入?！惫湃苏J(rèn)為風(fēng)為百病之長(zhǎng)，由于致傷物體多較污穢，破損處易被邪毒侵襲，所以致傷后不僅經(jīng)絡(luò)、氣血、組織受損，還可有邪毒為患?！坝袀赜叙觥?，各種外傷是形成瘀血的一個(gè)常見而重要的原因，早在《靈樞·邪氣臟腑病形》就有“有所墮墜，惡血留內(nèi)”的記載?！墩撏唆璺ā氛J(rèn)為：“翳者，氣血津凝而不行，結(jié)聚而成云翳”，“經(jīng)絡(luò)凝結(jié)，氣血不得升降，非發(fā)散之劑云翳不得升”。故祛風(fēng)發(fā)散，退翳明目。由此認(rèn)為，由角膜損傷導(dǎo)致的翳證的病機(jī)為瘀血積目、風(fēng)熱攻目。

除風(fēng)益損湯由熟地黃、當(dāng)歸、白芍、川芎、藁本、前胡、防風(fēng)組成，主治血虛生翳膜之證，又能夠促進(jìn)傷口的修復(fù)。該方以熟地黃補(bǔ)腎水為君，黑睛為腎之子，此虛則補(bǔ)其母；以當(dāng)歸補(bǔ)血，因目為血所養(yǎng)，今傷目則病，白芍藥補(bǔ)血又補(bǔ)氣，為血病則氣亦病也，為臣；川芎治血虛頭痛，藁本通血去頭風(fēng)，為佐；前胡、防風(fēng)通療風(fēng)邪，俾不凝留，為使。該方是四物湯化裁而來，四物湯具有養(yǎng)血活血效果，故除風(fēng)益損湯也具備，又除風(fēng)益損湯中加入了系列風(fēng)藥，使得全方生血而不滯、行血而不過[12]。肝血得以暢達(dá)目竅達(dá)到治療之功。在不斷地臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于眼部外傷等，一味地用活血化瘀類中藥效果往往并不佳，但若在方中加入祛風(fēng)藥、歸肝經(jīng)類中藥則全方效用顯著增強(qiáng)[26]，從而達(dá)到疏風(fēng)清熱、養(yǎng)血活血之功。

本研究發(fā)現(xiàn)，眼前節(jié)拍照及角膜熒光素染色中，隨著時(shí)間的推移，實(shí)驗(yàn)兔經(jīng)過除風(fēng)益損湯中藥湯劑灌胃治療和貝復(fù)舒滴眼治療后，在造模后7、14、28 d時(shí)，中藥組和貝復(fù)舒組與模型組相比兔角膜表面均趨于平整，白色光環(huán)及虹膜均更清晰顯現(xiàn)；在造模后28 d時(shí)明顯可見中藥組和貝復(fù)舒組兔角膜熒光素染色為陰性，而模型組仍存在少量兔角膜熒光素染色。以上結(jié)果說明，除風(fēng)益損湯和重組牛堿成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子滴眼液對(duì)兔角膜損傷修復(fù)具有促進(jìn)作用。

通過共聚焦激光斷層掃描不同時(shí)期的兔角膜淺層基質(zhì)發(fā)現(xiàn)：模型組在造模后7、14 d時(shí)淺層角膜基質(zhì)中會(huì)出現(xiàn)大量的成纖維細(xì)胞及炎性細(xì)胞，在造模后28 d時(shí)出現(xiàn)大量磨砂樣、不透明瘢痕組織及肌成纖維細(xì)胞；而中藥組和貝復(fù)舒組在造模后7 d時(shí)存在大量成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞，經(jīng)過治療后，在造模后14、28 d時(shí)發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞和炎性細(xì)胞逐量減少，且磨砂樣、不透明狀瘢痕組織生成不明顯。肌成纖維細(xì)胞能促使α-SMA生成，α-SMA的沉積會(huì)導(dǎo)致瘢痕的產(chǎn)生，而在通過中藥及貝復(fù)舒治療后造模后28 d的角膜淺層基質(zhì)很少發(fā)現(xiàn)肌成纖維細(xì)胞。在角膜混濁度分級(jí)中，發(fā)現(xiàn)與空白組比較，模型組在造模后7、14、28 d的角膜混濁分級(jí)均明顯升高，且呈時(shí)間相關(guān)性，但造模后28 d時(shí)模型組的角膜混濁分級(jí)出現(xiàn)回落，這可能是由于兔角膜的自愈能力導(dǎo)致的；與模型組相比，中藥組和貝復(fù)舒組在造模后7、14、28 d的角膜混濁分級(jí)均明顯降低，且時(shí)間越長(zhǎng)角膜混濁分級(jí)越低。以上結(jié)果說明，除風(fēng)益損湯和重組牛堿成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子滴眼液能降低兔角膜損傷后的混濁程度，從而降低瘢痕的產(chǎn)生。角膜基質(zhì)主要是由膠原纖維構(gòu)成，角膜的透明與膠原纖維的有序排列密不可分，基質(zhì)層細(xì)胞主要為角膜基質(zhì)細(xì)胞，是一種成纖維細(xì)胞，角膜損傷能激活角膜基質(zhì)細(xì)胞生成成纖維細(xì)胞，加速分泌膠原至基質(zhì)中[27]。在Masson病理切片染色中發(fā)現(xiàn)：中藥組和貝復(fù)舒組較模型組角膜基質(zhì)中的膠原纖維排列更整齊、更有序，其排列方式更趨近于空白組，且角膜上皮恢復(fù)，呈連續(xù)狀，而模型組中角膜上皮未愈合，且角膜前部基質(zhì)淺藍(lán)色膠原纖維排列紊亂，呈不連續(xù)狀態(tài)，厚度不一，角膜后部基質(zhì)淺藍(lán)色膠原纖維排列較混亂，呈紊亂纖維束。在造模后7、14、28 d中，各組TGF-β1、Smad3蛋白相對(duì)表量模型組最高，在經(jīng)過治療后，中藥組、貝復(fù)舒組中TGF-β1、Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)量逐漸降低，并且均明顯低于模型組中TGF-β1、Smad3蛋白相對(duì)表達(dá)量。這有可能是因?yàn)橹兴幹械哪撤N物質(zhì)，與TGF-β1相結(jié)合，使該蛋白表達(dá)減少，又TGF-β1蛋白表達(dá)的降低能減少肌成纖維細(xì)胞的產(chǎn)生，導(dǎo)致α-SMA因子分泌減少，從而抑制角膜損傷后瘢痕化的產(chǎn)生。以上結(jié)果說明，除風(fēng)益損湯和重組牛堿成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子滴眼液能夠促進(jìn)角膜損傷修復(fù)，并能減少角膜損傷后瘢痕化。

綜上所述，除風(fēng)益損湯能有效促進(jìn)角膜損傷修復(fù)，抑制角膜瘢痕化產(chǎn)生，并影響TGF-β1、Smad3、α-SMA蛋白的相對(duì)表達(dá)。

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