• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于氫氧化鈣為中和劑的大腸桿菌丁二酸發(fā)酵

    2024-12-31 00:00:00陳思宇孫瑞雪包晨鵬王金華高娃王永澤
    中國(guó)調(diào)味品 2024年10期
    關(guān)鍵詞:中和劑丁二酸大腸桿菌

    摘要:氫氧化鈣因其價(jià)格相對(duì)低廉且與其配套的有機(jī)酸分離純化工藝成熟,常作為中和劑應(yīng)用于有機(jī)酸發(fā)酵中。但在丁二酸發(fā)酵中,因其不能提供丁二酸合成所必需的二氧化碳,存在發(fā)酵產(chǎn)量低的問(wèn)題。文章建立并優(yōu)化了以氫氧化鈣為中和劑結(jié)合二氧化碳脈沖補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。發(fā)酵初期不添加中和劑,pH值自然下降至5.7時(shí),立即流加23%氫氧化鈣溶液使pH值升至7.5,然后停止添加中和劑,通入0.2 m3/(m3·min)二氧化碳?xì)怏w至pH值降至6.5時(shí)停止通氣使發(fā)酵液自然發(fā)酵,當(dāng)pH值下降至5.7時(shí),再循環(huán)上述操作。使用該方法時(shí),發(fā)酵產(chǎn)量為88.47 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為96.03%,平均生產(chǎn)強(qiáng)度為2.21 g/(L·h),相較于以氫氧化鈣為中和劑不補(bǔ)入或者連續(xù)通入二氧化碳的方式,糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高了298%和95%。該方法為解決使用氫氧化鈣作中和劑發(fā)酵丁二酸產(chǎn)量低的問(wèn)題提供了新思路,也為利用現(xiàn)有有機(jī)酸分離設(shè)備大規(guī)模生產(chǎn)丁二酸打下了良好基礎(chǔ)。

    關(guān)鍵詞:大腸桿菌;丁二酸;氫氧化鈣;二氧化碳;中和劑

    中圖分類(lèi)號(hào):TS201.1 """""文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A """"文章編號(hào):1000-9973(2024)10-0009-05

    Succinic Acid Fermentation by Escherichia coli Based on

    Calcium Hydroxide as Neutralizing Agent

    CHEN Si-yu1, SUN Rui-xue1, BAO Chen-peng1, WANG Jin-hua1,2,3,

    GAO Wa1,2,3, WANG Yong-ze1,2,3*

    (1.School of Biotechnology and Food, Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China;

    2.Key Laboratory of Fermentation Engineering, Ministry of Education, Hubei University

    of Technology, Wuhan 430068, China; 3.Industrial Fermentation Collaborative

    Innovation Center Co-constructed by Province and Ministry of Education,

    Hubei University of Technology, Wuhan 430068, China)

    Abstract: Calcium hydroxide is often used as neutralizing agent in the fermentation of organic acids due to its relatively low price and mature matched organic acid separation and purification process. However, in the fermentation of succinic acid, there is a problem of low fermentation yield due to its inability to provide the necessary carbon dioxide for succinic acid synthesis. In this paper, with calcium hydroxide as the neutralizing agent, combined with carbon dioxide pulse feed fermentation, a method for producing succinic acid is established and optimized. When no neutralizing agent is added in the initial stage of fermentation to naturally lower the pH value to 5.7, 23% calcium hydroxide solution is immediately added to raise the pH value to 7.5.Then stop adding neutralizing agent, 0.2 m3/(m3·min) carbon dioxide gas is introduced until the pH value drops to 6.5, and stop ventilation to make the fermentation broth naturally ferment. When the pH value drops to 5.7, repeat the above operation. Using this method, the fermentation yield, sugar acid conversion rate, average production intensity are 88.47 g/L, 96.03% and 2.21 g/(L·h) respectively. The sugar acid conversion rate increases by 298% and 95% respectively

    compared" to using calcium hydroxide as neutralizing agent, without adding or continuously introducing carbon dioxide. This" method has provided a new approach to solve the problem of low yield of succinic acid fermentation using calcium hydroxide as neutralizing agent, and also laid a good foundation for the large-scale production of succinic acid using existing organic acid separation equipment.

    Key words: Escherichia coli; succinic acid; calcium hydroxide; carbon dioxide; neutralizing agent

    丁二酸(succinic acid)又被稱(chēng)為琥珀酸,是一種重要的四碳二羧酸,廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化學(xué)等領(lǐng)域[1]。在醫(yī)藥行業(yè)中,丁二酸可用于合成維生素和抗生素等保健品[2]。而在食品加工行業(yè)中,丁二酸的應(yīng)用更廣泛,首先,由于丁二酸具有獨(dú)特的貝類(lèi)風(fēng)味,故可被制成我國(guó)食品添加劑中唯一許可使用的有機(jī)酸類(lèi)鮮味劑——丁二酸二鈉(干貝素),可用于增強(qiáng)肉制品和海鮮制品的鮮味,是醬料、方便面、奶制品和膨化食品等食品中鮮味的主要來(lái)源[3-4],丁二酸鈉鹽還可用作強(qiáng)化劑增強(qiáng)餅干等食品的韌性[2];其次,丁二酸在啤酒、醋、醬油等產(chǎn)品中也發(fā)揮著重要的風(fēng)味作用[5-7],此外,丁二酸衍生物辛烯基琥珀酸酯可用作乳化增稠劑增加色拉油調(diào)味品的穩(wěn)定性[8]。

    目前發(fā)酵法是丁二酸生產(chǎn)的主要方式[9],而二氧化碳含量和發(fā)酵液pH值是影響丁二酸發(fā)酵的關(guān)鍵因素[10],因此在發(fā)酵過(guò)程中常通過(guò)添加碳酸鹽的方法,在提供二氧化碳的同時(shí)維持發(fā)酵液pH的穩(wěn)定。碳酸鎂被普遍認(rèn)為是最能提高丁二酸產(chǎn)量的中和劑[11-12],但是由于碳酸鎂價(jià)格昂貴且鎂離子在后續(xù)丁二酸分離工藝中難以被去除,最終使丁二酸的生產(chǎn)成本居高[13],因此碳酸鎂不適用于丁二酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。與碳酸鎂相比,氫氧化鈣作為傳統(tǒng)的有機(jī)酸發(fā)酵中和劑,不但成本較低,而且發(fā)酵液中的鈣離子可以轉(zhuǎn)化為硫酸鈣沉淀去除,成為很多有機(jī)酸發(fā)酵工廠首選的中和劑,成熟的配套工藝大大降低了有機(jī)酸的發(fā)酵成本。

    只使用氫氧化鈣作為中和劑會(huì)導(dǎo)致丁二酸發(fā)酵產(chǎn)量極低,這與用氫氧化鈣作為中和劑不能提供丁二酸合成所需的二氧化碳有關(guān)。使用碳酸鈣作為中和劑似乎能解決這個(gè)問(wèn)題,但我們又發(fā)現(xiàn)碳酸鈣堿性太弱,對(duì)發(fā)酵液pH無(wú)法實(shí)現(xiàn)很好的控制。使用氫氧化鈣作為中和劑時(shí)持續(xù)補(bǔ)入二氧化碳的方法看起來(lái)是一種較合理的解決方案,但實(shí)際發(fā)酵時(shí)卻發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中有大量沉淀生成,發(fā)酵液持續(xù)酸化,丁二酸產(chǎn)量仍然較低。

    本文擬建立以氫氧化鈣為中和劑結(jié)合二氧化碳脈沖補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法,將氫氧化鈣和二氧化碳交替以脈沖方式補(bǔ)入發(fā)酵液中,期望達(dá)到更好的發(fā)酵液pH控制和二氧化碳補(bǔ)充的效果,從而達(dá)到以氫氧化鈣為中和劑時(shí)也能高產(chǎn)丁二酸的目的,進(jìn)而降低丁二酸的生產(chǎn)成本,為利用現(xiàn)有成熟的有機(jī)酸發(fā)酵及分離純化設(shè)備大規(guī)模生產(chǎn)丁二酸打下了良好基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌株

    大腸桿菌(Escherichia coli)WS100[14]:由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存。

    1.1.2 試劑

    酵母粉、蛋白胨、氯化鈉、十二水磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸銨、葡萄糖、丁二酸、氫氧化鈣(均為分析純):國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;碳酸鎂:上海麥克林生化科技股份有限公司。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    一級(jí)種子培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L,酵母粉5 g/L,蛋白胨10 g/L,氯化鈉10 g/L,固體培養(yǎng)基添加瓊脂粉18 g/L,pH自然,121 ℃滅菌15 min。

    二級(jí)種子培養(yǎng)基:葡萄糖40 g/L,酵母粉10 g/L,蛋白胨10 g/L,十二水硫酸鎂0.5 g/L,磷酸二氫鉀1.14 g/L,硫酸銨0.3 g/L,十二水磷酸氫二鉀0.9 g/L,pH自然,121 ℃滅菌15 min。

    發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖80 g/L,玉米漿干粉3 g/L,酵母粉10 g/L,蛋白胨10 g/L,十二水硫酸鎂0.5 g/L,磷酸二氫鉀1.14 g/L,硫酸銨0.3 g/L,十二水磷酸氫二鉀0.9 g/L,pH自然,121 ℃滅菌15 min。

    1.2 主要儀器與設(shè)備

    ZWY-2102C恒溫?fù)u床 上海智城分析儀器制造有限公司;Waters-e2695高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司;DNP-9022電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;SBA-40D型生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;SW-CJ-2FB超凈工作臺(tái) 蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司;37070發(fā)酵罐 Sartorius Stedim Biotech GmbH。

    1.3 方法

    1.3.1 培養(yǎng)條件及方法

    一級(jí)種子培養(yǎng)方法:將保存在-80 ℃冰箱中的菌種在LB固體培養(yǎng)基上劃線(xiàn)培養(yǎng),在平板上挑選單菌落接種至250 mL三角瓶裝液量為50 mL的LB液體培養(yǎng)基中活化菌種,40 ℃ 200 r/min培養(yǎng)10~12 h。

    二級(jí)種子培養(yǎng)方法:將一級(jí)種子液以5%接種量接種至二級(jí)種子培養(yǎng)基中,40 ℃ 200 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h至發(fā)酵液OD600 nm值為15左右,以此作為二級(jí)種子液。

    發(fā)酵罐培養(yǎng)方法[15]:按照10%接種量將二級(jí)種子液接種到發(fā)酵罐培養(yǎng)液(裝液量4 L)中,全程恒溫40 ℃,攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min。發(fā)酵培養(yǎng)基中初始添加葡萄糖80 g/L,以23%氫氧化鈣作為中和劑。發(fā)酵罐培養(yǎng)的初期階段不流加氫氧化鈣溶液,使發(fā)酵液的pH值自然下降,當(dāng)pH值下降至5.4~6.0時(shí),立即流加23%氫氧化鈣使發(fā)酵液pH值上升至7.0~8.0,停止添加中和劑后,通入二氧化碳?xì)怏w0.1~0.6 m3/(m3·min)使pH值下降至6.3~6.7,隨后立即停止通入二氧化碳,使發(fā)酵液自然發(fā)酵,當(dāng)pH值自然下降至5.4~6.0時(shí),再流加23%氫氧化鈣,并重復(fù)上述操作。發(fā)酵過(guò)程示意圖見(jiàn)圖1。

    1.3.2 檢測(cè)方法

    OD600 nm值的測(cè)定:取1 mL發(fā)酵液,使用稀鹽酸按體積比1∶1處理,再用純水稀釋至合適倍數(shù)后,用分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值,即OD600 nm值。

    葡萄糖的測(cè)定:取1 mL發(fā)酵液,10 000 r/min離心2 min后取上清,用純水稀釋至合適倍數(shù)后,使用SBA-40D型生物傳感分析儀進(jìn)行測(cè)量。

    有機(jī)酸含量的測(cè)定:用6%的硫酸水溶液按體積比1∶1處理發(fā)酵液,靜置數(shù)分鐘,以10 000 r/min離心10 min,用超純水稀釋后,用0.22 μm濾膜過(guò)濾備用,使用高效液相色譜儀測(cè)量發(fā)酵液中有機(jī)酸的含量。HPLC 條件:色譜柱:Xtimate Sugar-H;流動(dòng)相:5 mmol/L H2SO4溶液;流速:0.5 mL/min;柱溫:45 ℃;檢測(cè)器:PDA;檢測(cè)波長(zhǎng):210 nm;進(jìn)樣量:10 μL。

    1.3.3 數(shù)據(jù)處理

    糖酸轉(zhuǎn)化率(SA)參考張震等[16]的方法,計(jì)算公式如下:

    SA(%)=ρ×Vm×100%。

    式中: ρ為丁二酸濃度(g/L);V為發(fā)酵液總體積(L);m為總耗糖量(g)。

    使用Excel 2010對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理;使用SPSS 26進(jìn)行方差分析,Plt;0.05表示有顯著性差異,Plt;0.01表示有極顯著性差異。多重比對(duì)采用Duncan法,組間差異用字母法標(biāo)記;使用Origin 2022作圖。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 二氧化碳補(bǔ)入方式的選擇

    碳酸鹽可以為丁二酸生產(chǎn)提供不可或缺的二氧化碳,而氫氧化鈣不是碳酸鹽,因此需要在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)入二氧化碳。本文對(duì)比了3種二氧化碳的補(bǔ)入方式對(duì)丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的影響:發(fā)酵全程不補(bǔ)入;連續(xù)補(bǔ)料;以氫氧化鈣溶液結(jié)合二氧化碳?xì)怏w脈沖補(bǔ)料的方法將整個(gè)過(guò)程中pH值穩(wěn)定在6.0~8.0范圍內(nèi):當(dāng)發(fā)酵液pH值自然下降至6.0時(shí),流加23%氫氧化鈣溶液至pH值升至8.0,然后停止添加中和劑,通入0.1 m3/(m3·min)二氧化碳?xì)怏w使pH值降至6.7時(shí)停止通氣使發(fā)酵液自然發(fā)酵,當(dāng)pH值下降至6.0時(shí),再循環(huán)上述操作,具體結(jié)果見(jiàn)表1。

    由表1可知,不同的二氧化碳補(bǔ)入方式對(duì)丁二酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率的影響極顯著(Plt;0.01),發(fā)酵過(guò)程中不通入二氧化碳,僅靠氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH值,得到的丁二酸產(chǎn)量極低,這是因?yàn)槎《岬那绑w物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)需要固定一分子二氧化碳羧化為草酰乙酸,氫氧化鈣不能提供所需的二氧化碳,因此在不補(bǔ)入二氧化碳的情況下厭氧發(fā)酵,幾乎不生產(chǎn)丁二酸,丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率僅有12.32 g/L和24.14%。

    連續(xù)補(bǔ)入二氧化碳,丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率也不高,僅為25.37 g/L和40.33%,但對(duì)比不通入二氧化碳的方式,丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率分別提升了106%和67%。雖然丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率有所提升,但是仍處于較低水平,這可能是由于二氧化碳連續(xù)補(bǔ)入時(shí)二氧化碳和氫氧化鈣反應(yīng)生成碳酸鈣,碳酸鈣堿性較弱,發(fā)酵液的pH值難以控制,氫氧化鈣流加量過(guò)多,鈣離子濃度過(guò)高也會(huì)影響菌體的正常生長(zhǎng)代謝。

    使用氫氧化鈣結(jié)合二氧化碳脈沖補(bǔ)料發(fā)酵的效果最佳,不僅縮短了總發(fā)酵時(shí)長(zhǎng),而且丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率較高,分別為47.45 g/L和83.46%,對(duì)比不補(bǔ)入二氧化碳分別提升了285%和246%,對(duì)比連續(xù)補(bǔ)入二氧化碳分別提升了87%和107%。使用氫氧化鈣結(jié)合二氧化碳脈沖補(bǔ)料生產(chǎn)過(guò)程中有兩個(gè)重要的影響因素,一是脈沖補(bǔ)料過(guò)程中,二氧化碳?xì)怏w流量及何時(shí)停止通氣的問(wèn)題;二是脈沖補(bǔ)料過(guò)程中,何時(shí)流加氫氧化鈣及何時(shí)停止流加的問(wèn)題。本研究后續(xù)將圍繞這兩個(gè)問(wèn)題,通過(guò)調(diào)整發(fā)酵條件,實(shí)現(xiàn)更高的丁二酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率。

    2.2 二氧化碳補(bǔ)料的控制

    通過(guò)調(diào)整二氧化碳補(bǔ)入流量及停止通氣時(shí)機(jī)兩個(gè)方面優(yōu)化脈沖補(bǔ)料工藝,具體結(jié)果見(jiàn)表2。

    由表2可知,通過(guò)對(duì)氣體流量及停止時(shí)機(jī)的調(diào)控,發(fā)現(xiàn)二氧化碳的氣體流量對(duì)發(fā)酵有一定的影響,當(dāng)氣體流量為0.1 m3/(m3·min),停止通氣時(shí)發(fā)酵液pH值為6.3時(shí),丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率最低,僅為39.26 g/L和72.25%。當(dāng)氣體流量為0.2 m3/(m3·min)時(shí),丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率上升,但隨著氣體流量的上升,丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率并沒(méi)有相應(yīng)地提升,可能是由于發(fā)酵液中可利用的二氧化碳含量已達(dá)到飽和[17]。不同的脈沖補(bǔ)料停止時(shí)機(jī)得到了不同的發(fā)酵結(jié)果,當(dāng)pH值為6.5時(shí)停止通氣,丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率均最高。當(dāng)氣體流量為0.2 m3/(m3·min),pH值為6.5時(shí)停止補(bǔ)料,有最大的丁二酸產(chǎn)量(50.37 g/L)和糖酸轉(zhuǎn)化率(86.37%)。

    2.3 氫氧化鈣脈沖補(bǔ)料時(shí)機(jī)及停止時(shí)機(jī)

    通過(guò)調(diào)整氫氧化鈣補(bǔ)料時(shí)機(jī)及停止時(shí)機(jī)兩個(gè)方面進(jìn)一步優(yōu)化了該發(fā)酵方法,具體結(jié)果見(jiàn)表3。

    由表3可知,通過(guò)調(diào)整不同的氫氧化鈣脈沖補(bǔ)料時(shí)機(jī)及停止時(shí)機(jī)可以發(fā)現(xiàn),當(dāng)pH值自然下降至5.7時(shí)再補(bǔ)入氫氧化鈣至pH值為7.5,有最大的丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率,分別為53.47 g/L和92.46%。當(dāng)反饋補(bǔ)料pH值為5.4時(shí),所得到的丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率都較低,可能是因?yàn)榉答佈a(bǔ)料pH值過(guò)低,不適宜大腸桿菌的生長(zhǎng),從而影響了丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率。

    2.4 優(yōu)化條件的驗(yàn)證

    根據(jù)對(duì)脈沖補(bǔ)料條件的優(yōu)化,得到優(yōu)化后的發(fā)酵條件為當(dāng)pH值自然下降至5.7時(shí),流加23%氫氧化鈣至發(fā)酵液pH值為7.5,再通入二氧化碳(0.2 m3/(m3·min))至pH值為6.5,停止通氣后使發(fā)酵液自然發(fā)酵,當(dāng)pH值降至5.7時(shí)再重復(fù)此操作。依照此條件,對(duì)優(yōu)化的結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證,發(fā)酵條件為初始葡萄糖含量80 g/L,當(dāng)發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖含量低于10 g/L時(shí)再補(bǔ)加20 g/L葡萄糖。由圖2可知,發(fā)酵40 h結(jié)束時(shí),丁二酸產(chǎn)量達(dá)到88.47 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為96.03%,副產(chǎn)物乙酸產(chǎn)量?jī)H為3.82 g/L,平均生產(chǎn)強(qiáng)度2.21 g/(L·h)。采用優(yōu)化后的脈沖補(bǔ)料方法,糖酸轉(zhuǎn)化率比優(yōu)化前提升了15.06%,相比于不補(bǔ)入或者連續(xù)通入二氧化碳的方式,轉(zhuǎn)化率分別提高了298%和95%。整個(gè)過(guò)程pH穩(wěn)定在5.7~7.5范圍內(nèi),達(dá)到了較好的發(fā)酵液pH控制效果。

    將優(yōu)化后的結(jié)果與使用不同中和劑(使用本文實(shí)驗(yàn)菌株)和文獻(xiàn)中其他控制發(fā)酵液pH和二氧化碳通入方式相比的結(jié)果進(jìn)行了對(duì)比,見(jiàn)表4。

    由表4可知,無(wú)論是丁二酸產(chǎn)量還是糖酸轉(zhuǎn)化率,優(yōu)化后的發(fā)酵結(jié)果均最佳,僅在總發(fā)酵時(shí)間和平均生產(chǎn)強(qiáng)度上稍遜色于使用碳酸鎂時(shí)的發(fā)酵結(jié)果。然而雖然使用碳酸鎂時(shí)平均生產(chǎn)強(qiáng)度較高,但同時(shí)副產(chǎn)物乙酸含量也較高,達(dá)到4.84 g/L,而本文優(yōu)化后的方法僅積累3.82 g/L的乙酸。碳酸鎂一直被認(rèn)為是生產(chǎn)丁二酸的最佳中和劑[11-12],但是由于其本身價(jià)格昂貴,且鎂離子對(duì)后續(xù)分離提取工藝有影響,使生產(chǎn)成本過(guò)高,因此不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。而使用氫氧化鈣作為中和劑,發(fā)酵結(jié)束后可以使用成熟的鈣鹽法[18]進(jìn)行分離提取,并且氫氧化鈣價(jià)格相對(duì)低廉,較適用于丁二酸的工業(yè)化生產(chǎn)。通過(guò)對(duì)比可以得出,優(yōu)化后的脈沖補(bǔ)料方法不僅提高了丁二酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率,而且縮短了總發(fā)酵時(shí)間,提升了平均生產(chǎn)強(qiáng)度,副產(chǎn)物乙酸的產(chǎn)量也有所降低。

    3 結(jié)論

    本文建立了以氫氧化鈣為中和劑結(jié)合二氧化碳脈沖補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法。相比于以氫氧化鈣為中和劑不補(bǔ)入或者連續(xù)通入二氧化碳的方式,轉(zhuǎn)化率分別提高了298%和95%。

    對(duì)脈沖補(bǔ)料法進(jìn)一步優(yōu)化,優(yōu)化后的工藝將整個(gè)發(fā)酵過(guò)程pH值穩(wěn)定在5.7~7.5范圍內(nèi),達(dá)到了較好的發(fā)酵液pH值控制效果。脈沖補(bǔ)料法優(yōu)化后的工藝為發(fā)酵初期不添加中和劑使pH值自然下降至5.7時(shí),立即流加23%氫氧化鈣溶液至pH值升至7.5,然后停止添加中和劑,通入0.2 m3/(m3·min)二氧化碳?xì)怏w使pH值降至6.5時(shí)停止通氣使發(fā)酵液自然發(fā)酵,當(dāng)pH值下降至5.7時(shí),流加23%氫氧化鈣并重復(fù)上述操作。使用該方法,發(fā)酵40 h時(shí)丁二酸產(chǎn)量為88.47 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率為96.03%,平均生產(chǎn)強(qiáng)度為2.21 g/(L·h),乙酸產(chǎn)量?jī)H為3.82 g/L,優(yōu)化后的脈沖補(bǔ)料方法得到的丁二酸糖酸轉(zhuǎn)化率比優(yōu)化前提升了15.06%。

    使用優(yōu)化后的工藝發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸,對(duì)比使用其他方式,具有丁二酸產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率高、總生產(chǎn)強(qiáng)度大、副產(chǎn)物乙酸產(chǎn)量低等優(yōu)勢(shì)。并且使用氫氧化鈣作中和劑,便于后續(xù)使用鈣鹽法分離提取丁二酸,為降低丁二酸生產(chǎn)成本、利用現(xiàn)有成熟的有機(jī)酸發(fā)酵及分離純化設(shè)備大規(guī)模生產(chǎn)丁二酸打下了良好基礎(chǔ)。

    參考文獻(xiàn):

    [1]WILLKE T, VORLOP K D. Industrial bioconversion of renewable resources as an alternative to conventional chemistry[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2004,66(4):131-142.

    [2]張小葉.大腸桿菌木糖生物合成琥珀酸的代謝工程研究[D].長(zhǎng)春:吉林大學(xué),2013.

    [3]史曉君,劉微.一種貝類(lèi)海鮮提取物的研制及在水餃餡中的應(yīng)用研究[J].中國(guó)調(diào)味品,2020,45(10):122-125,129.

    [4]李永歌,劉立新.琥珀酸二鈉在食品中的應(yīng)用[J].中國(guó)調(diào)味品,2013,38(3):109-111.

    [5]向陽(yáng),李崎.啤酒中的琥珀酸[J].啤酒科技,2005(7):17-20.

    [6]李國(guó)權(quán),陸震鳴,余永建,等.鎮(zhèn)江香醋有機(jī)酸風(fēng)味特征的分析[J].中國(guó)調(diào)味品,2013,38(11):63-65.

    [7]于江,于貞.琥珀酸高產(chǎn)菌株ASQ-1醬油發(fā)酵性能的初步研究[J].中國(guó)調(diào)味品,2019,44(11):37-39.

    [8]李春波,邵斌.維生素E及其琥珀酸酯和琥珀酸鈣在保健食品中的應(yīng)用[J].中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào),2003(2):94-96.

    [9]張耀,邱曉曼,陳程鵬,等.生物法制造丁二酸研究進(jìn)展[J].化工學(xué)報(bào),2020,71(5):1964-1975.

    [10]GUETTLER M V, JAIN M K, RUMLER D. Method for making succinic acid, bacterial variants for use in the process, and methods for obtaining variants:US,US-5573931-A[P].1995-08-28.

    [11]楊卓娜,姜岷,李建,等.不同pH調(diào)節(jié)劑對(duì)產(chǎn)琥珀酸放線(xiàn)桿菌NJ113發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響[J].生物工程學(xué)報(bào),2010,26(11):1500-1506.

    [12]劉佳,唐文秀,王學(xué)明,等.大腸桿菌FMME-N-26生產(chǎn)琥珀酸的發(fā)酵條件優(yōu)化和放大[J].過(guò)程工程學(xué)報(bào),2022,22(7):853-862.

    [13]STRAATHOF A, EFE C, ENGEL C A R, et al. Fermentation and recovery of bio-based fumaric and succinic acid[J].Journal of Biotechnology,2010,150:82-83.

    [14]趙錦芳,華渤文,王永澤,等.高產(chǎn)琥珀酸重組大腸桿菌的構(gòu)建及厭氧發(fā)酵[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(1):6-10.

    [15]王金華,王永澤,趙筱,等.一種以氫氧化鈣為中和劑結(jié)合CO2脈沖反饋補(bǔ)料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸的方法:中國(guó),CN116426577A[P].2023-07-14.

    [16]張震,熊海波,徐慶陽(yáng).大腸桿菌高密度培養(yǎng)發(fā)酵L-色氨酸[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2019,45(23):15-20.

    [17]陳可泉,姜岷,蘇溧,等.產(chǎn)琥珀酸放線(xiàn)桿菌固定CO2制備丁二酸[J].化學(xué)工程,2009,37(1):49-52.

    [18]王靜怡.大腸桿菌NZN111發(fā)酵液中琥珀酸的提取[D].上海:華東理工大學(xué),2014.

    [19]薛葳蕤.產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌工程菌WS102的構(gòu)建、發(fā)酵及琥珀酸分離的研究[D].武漢:湖北工業(yè)大學(xué),2017.

    [20]華渤文.產(chǎn)琥珀酸大腸桿菌工程菌的構(gòu)建及其發(fā)酵研究[D].武漢:湖北工業(yè)大學(xué),2014.

    收稿日期:2024-03-20

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31501677);企業(yè)合作項(xiàng)目(2023077)

    作者簡(jiǎn)介:陳思宇(1999—),女,碩士,研究方向:食品科學(xué)。

    *通信作者:王永澤(1976—),男,副教授,博士,研究方向:微生物代謝與發(fā)酵。

    猜你喜歡
    中和劑丁二酸大腸桿菌
    諾氟沙星膠囊微生物限度檢查方法研究
    人人健康(2020年5期)2020-09-02 17:16:51
    丁二酸對(duì)化學(xué)鍍Ni-P-納米TiO2復(fù)合鍍層性能的影響
    助溶劑和中和劑對(duì)醇酸樹(shù)脂乳化的影響
    甲基黃嘌呤生物堿作用概述
    基于樹(shù)枝狀分子及功能化金納米粒子的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)污泥中大腸桿菌
    甲酚納米乳消毒劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)及消毒功效研究
    聚丁二酸丁二醇酯/淀粉共混物阻燃改性的研究
    適應(yīng)度代價(jià)對(duì)大腸桿菌藥物敏感性恢復(fù)的作用
    阻燃聚丁二酸丁二醇酯復(fù)合材料的制備及其阻燃性能研究
    聚丁二酸丁二酯的酶促降解研究
    高清欧美精品videossex| 国产一区二区在线观看av| 亚洲精品一二三| 大型黄色视频在线免费观看| 男男h啪啪无遮挡| 欧美中文综合在线视频| 国产一区二区在线观看av| 精品国产乱码久久久久久小说| 日韩精品免费视频一区二区三区| 精品国产亚洲在线| 97人妻天天添夜夜摸| 国产精品一区二区在线不卡| 热99re8久久精品国产| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 亚洲专区字幕在线| 国产成人啪精品午夜网站| 成人影院久久| 2018国产大陆天天弄谢| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 中文字幕人妻熟女乱码| a级毛片在线看网站| 亚洲七黄色美女视频| 成在线人永久免费视频| 国产伦理片在线播放av一区| 亚洲精品美女久久av网站| 宅男免费午夜| av视频免费观看在线观看| 精品国产一区二区三区四区第35| 色在线成人网| av天堂在线播放| 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲国产成人一精品久久久| av视频免费观看在线观看| 亚洲精品在线观看二区| 日韩一区二区三区影片| 中文字幕av电影在线播放| 欧美日本中文国产一区发布| 久久久久精品国产欧美久久久| 中文欧美无线码| 男女免费视频国产| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久中文字幕人妻熟女| 国产欧美亚洲国产| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产不卡一卡二| 亚洲第一av免费看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 男女午夜视频在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲熟女毛片儿| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 天天添夜夜摸| 国产一区二区三区综合在线观看| 男女床上黄色一级片免费看| 宅男免费午夜| 天堂动漫精品| 男女边摸边吃奶| 俄罗斯特黄特色一大片| 香蕉丝袜av| 欧美日本中文国产一区发布| 男女床上黄色一级片免费看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 捣出白浆h1v1| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| videosex国产| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲成人免费电影在线观看| www日本在线高清视频| 飞空精品影院首页| 黄色 视频免费看| 国产精品久久久久久精品古装| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 首页视频小说图片口味搜索| av超薄肉色丝袜交足视频| 十八禁高潮呻吟视频| 大香蕉久久网| 久久精品91无色码中文字幕| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 天堂8中文在线网| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 亚洲av国产av综合av卡| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 成人手机av| 91麻豆av在线| 在线观看人妻少妇| 午夜福利视频精品| 国产精品 欧美亚洲| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 国产成人影院久久av| 日韩制服丝袜自拍偷拍| tocl精华| 自线自在国产av| 国产在线一区二区三区精| 国产黄频视频在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 激情视频va一区二区三区| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 日韩免费av在线播放| 一区二区三区精品91| 免费在线观看黄色视频的| svipshipincom国产片| 一区二区三区精品91| 成人国语在线视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 国产精品免费一区二区三区在线 | 啦啦啦 在线观看视频| 久热这里只有精品99| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 午夜福利视频精品| 美国免费a级毛片| 中文亚洲av片在线观看爽 | 免费一级毛片在线播放高清视频 | 97人妻天天添夜夜摸| 飞空精品影院首页| 国产免费av片在线观看野外av| 日韩欧美免费精品| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 99在线人妻在线中文字幕 | 国产精品久久电影中文字幕 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 一本色道久久久久久精品综合| xxxhd国产人妻xxx| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 99久久精品国产亚洲精品| 久久人妻av系列| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 国产精品亚洲一级av第二区| 日本黄色视频三级网站网址 | 正在播放国产对白刺激| 中文字幕最新亚洲高清| 国产深夜福利视频在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 天堂俺去俺来也www色官网| 免费观看a级毛片全部| 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品福利观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产av精品麻豆| tocl精华| 麻豆av在线久日| 操出白浆在线播放| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 色综合婷婷激情| 欧美日韩成人在线一区二区| 久久这里只有精品19| 国产精品成人在线| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲伊人久久精品综合| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 正在播放国产对白刺激| 色尼玛亚洲综合影院| 免费高清在线观看日韩| 成年版毛片免费区| 大型黄色视频在线免费观看| 看免费av毛片| 嫁个100分男人电影在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 免费黄频网站在线观看国产| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| a级毛片黄视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 黄色a级毛片大全视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 窝窝影院91人妻| 久久久久久久久免费视频了| 精品国产一区二区久久| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲人成电影免费在线| 国产有黄有色有爽视频| 桃红色精品国产亚洲av| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲国产欧美一区二区综合| 欧美日韩视频精品一区| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久精品亚洲av国产电影网| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲国产av新网站| 操美女的视频在线观看| 免费不卡黄色视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产黄频视频在线观看| 欧美激情高清一区二区三区| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 在线播放国产精品三级| 高清欧美精品videossex| 亚洲色图av天堂| 老鸭窝网址在线观看| 啦啦啦 在线观看视频| 水蜜桃什么品种好| 91国产中文字幕| a级毛片在线看网站| 叶爱在线成人免费视频播放| 91精品三级在线观看| 国产精品九九99| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产男靠女视频免费网站| 不卡av一区二区三区| 免费日韩欧美在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久热这里只有精品99| 十八禁高潮呻吟视频| 无遮挡黄片免费观看| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 在线观看人妻少妇| 少妇精品久久久久久久| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 午夜福利影视在线免费观看| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美一级毛片孕妇| 一级片'在线观看视频| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 少妇的丰满在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 日韩欧美免费精品| 亚洲男人天堂网一区| 在线观看免费视频网站a站| 久久久久久久国产电影| 久久久久久久大尺度免费视频| 怎么达到女性高潮| 亚洲精品国产一区二区精华液| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产三级黄色录像| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 高潮久久久久久久久久久不卡| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 国产午夜精品久久久久久| 在线天堂中文资源库| 亚洲成人国产一区在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 久久久欧美国产精品| 免费少妇av软件| 午夜福利一区二区在线看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产精品一区二区在线观看99| 国产免费福利视频在线观看| 成人亚洲精品一区在线观看| 亚洲av电影在线进入| 大陆偷拍与自拍| 日韩视频在线欧美| www.自偷自拍.com| 亚洲 国产 在线| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 1024视频免费在线观看| 国产精品久久久av美女十八| 国产精品国产av在线观看| 日韩视频在线欧美| 十八禁网站免费在线| 亚洲七黄色美女视频| 最近最新免费中文字幕在线| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲成a人片在线一区二区| 精品久久蜜臀av无| 亚洲 国产 在线| 国产成人精品久久二区二区免费| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜福利影视在线免费观看| 日韩一区二区三区影片| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产xxxxx性猛交| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产一区二区三区视频了| 午夜激情av网站| av线在线观看网站| 一个人免费看片子| 日本黄色日本黄色录像| 欧美日韩黄片免| 女性被躁到高潮视频| 午夜福利影视在线免费观看| 国产一区二区 视频在线| 我要看黄色一级片免费的| 女同久久另类99精品国产91| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 蜜桃国产av成人99| 午夜两性在线视频| av天堂在线播放| 99re在线观看精品视频| 成年人免费黄色播放视频| 大陆偷拍与自拍| cao死你这个sao货| 一区二区av电影网| www.熟女人妻精品国产| 亚洲精品国产色婷婷电影| 色综合婷婷激情| 高清欧美精品videossex| 亚洲欧美激情在线| 99国产极品粉嫩在线观看| 不卡av一区二区三区| 欧美成人免费av一区二区三区 | 久久久精品94久久精品| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 黄色 视频免费看| 国产真人三级小视频在线观看| 90打野战视频偷拍视频| 男人操女人黄网站| 欧美另类亚洲清纯唯美| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 久久亚洲精品不卡| 美女高潮到喷水免费观看| 男女之事视频高清在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 老司机午夜十八禁免费视频| 色综合婷婷激情| 婷婷成人精品国产| 两个人免费观看高清视频| 岛国毛片在线播放| 人妻一区二区av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 精品国产亚洲在线| tube8黄色片| kizo精华| 久久久久网色| 欧美日韩一级在线毛片| 精品久久久久久电影网| 高清黄色对白视频在线免费看| 欧美在线一区亚洲| 亚洲伊人久久精品综合| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲精品在线美女| 99久久人妻综合| 国产伦理片在线播放av一区| 久久久久久久精品吃奶| 精品国产一区二区久久| 欧美中文综合在线视频| 看免费av毛片| 国产视频一区二区在线看| 国产野战对白在线观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 久久久欧美国产精品| 人人妻,人人澡人人爽秒播| av线在线观看网站| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产一区二区在线观看av| 中文字幕最新亚洲高清| 日日爽夜夜爽网站| 我要看黄色一级片免费的| 激情视频va一区二区三区| 在线观看免费视频网站a站| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 成人国产一区最新在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久精品国产综合久久久| 飞空精品影院首页| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 亚洲黑人精品在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 黄色丝袜av网址大全| 国产精品久久久久成人av| 在线永久观看黄色视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 国产成人啪精品午夜网站| 免费在线观看日本一区| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲九九香蕉| 欧美日韩一级在线毛片| 多毛熟女@视频| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲成人国产一区在线观看| 国产成人精品在线电影| 亚洲一区二区三区欧美精品| 久久久精品94久久精品| 色婷婷久久久亚洲欧美| www.自偷自拍.com| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲av第一区精品v没综合| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 一本一本久久a久久精品综合妖精| 天天操日日干夜夜撸| 久久这里只有精品19| 国精品久久久久久国模美| 亚洲欧美一区二区三区久久| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲中文字幕日韩| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 色94色欧美一区二区| 久久九九热精品免费| 亚洲欧洲日产国产| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 久久人人97超碰香蕉20202| 免费少妇av软件| 国产欧美日韩一区二区三| 日本a在线网址| 亚洲伊人久久精品综合| 91精品国产国语对白视频| 12—13女人毛片做爰片一| 91精品三级在线观看| 久久久国产精品麻豆| 久久中文字幕人妻熟女| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲成人免费电影在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av | 亚洲五月色婷婷综合| 成人av一区二区三区在线看| 亚洲熟妇熟女久久| 久9热在线精品视频| 精品久久久久久电影网| 人妻久久中文字幕网| 老司机在亚洲福利影院| 国产成+人综合+亚洲专区| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 极品少妇高潮喷水抽搐| 欧美日韩av久久| 亚洲伊人久久精品综合| 免费观看a级毛片全部| 久久毛片免费看一区二区三区| 国产在线免费精品| 一级片免费观看大全| 男女边摸边吃奶| 大码成人一级视频| 成年人免费黄色播放视频| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲av国产av综合av卡| 久久影院123| 国产精品久久久久成人av| 亚洲国产看品久久| av网站免费在线观看视频| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 精品一区二区三区av网在线观看 | 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产精品亚洲一级av第二区| kizo精华| 桃红色精品国产亚洲av| 久久国产精品人妻蜜桃| 大片免费播放器 马上看| 亚洲精品在线观看二区| 岛国毛片在线播放| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲欧美一区二区三区久久| 老司机靠b影院| 国产欧美日韩精品亚洲av| 日本一区二区免费在线视频| a级毛片在线看网站| 国产色视频综合| 色婷婷av一区二区三区视频| 久久久国产一区二区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 两个人免费观看高清视频| 午夜福利免费观看在线| 国产精品欧美亚洲77777| 动漫黄色视频在线观看| 久久狼人影院| cao死你这个sao货| 成人影院久久| 日本五十路高清| 国产精品一区二区在线观看99| 超色免费av| 在线观看舔阴道视频| 天天影视国产精品| 国产麻豆69| 精品国内亚洲2022精品成人 | 蜜桃在线观看..| 国产成人影院久久av| 两个人看的免费小视频| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 午夜福利免费观看在线| 国产麻豆69| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 搡老熟女国产l中国老女人| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 亚洲天堂av无毛| 亚洲av片天天在线观看| 国产91精品成人一区二区三区 | 国产成人啪精品午夜网站| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲人成77777在线视频| 成人三级做爰电影| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲av第一区精品v没综合| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 亚洲一区中文字幕在线| 另类亚洲欧美激情| 69av精品久久久久久 | 一边摸一边做爽爽视频免费| 久久99一区二区三区| 国产精品亚洲av一区麻豆| 12—13女人毛片做爰片一| 午夜福利免费观看在线| 婷婷丁香在线五月| 午夜免费成人在线视频| 午夜福利在线观看吧| 久久精品国产综合久久久| 国产又爽黄色视频| 日本一区二区免费在线视频| 一本综合久久免费| 亚洲美女黄片视频| 99热国产这里只有精品6| 精品卡一卡二卡四卡免费| 十八禁网站网址无遮挡| 日韩有码中文字幕| 999精品在线视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美日韩黄片免| 岛国毛片在线播放| 国产成人av激情在线播放| 乱人伦中国视频| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲男人天堂网一区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲专区字幕在线| 亚洲第一av免费看| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| bbb黄色大片| 午夜免费鲁丝| 久久久久精品国产欧美久久久| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲三区欧美一区| 午夜福利在线免费观看网站| 亚洲七黄色美女视频| 黄片播放在线免费| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 成年版毛片免费区| 久久婷婷成人综合色麻豆| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 最新在线观看一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 夜夜爽天天搞| 性高湖久久久久久久久免费观看| 精品国产乱码久久久久久男人| 99精国产麻豆久久婷婷| 99在线人妻在线中文字幕 | 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 老鸭窝网址在线观看| 国产av国产精品国产| 热99国产精品久久久久久7| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 一级,二级,三级黄色视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久欧美国产精品| 老司机午夜十八禁免费视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 精品福利永久在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 99国产极品粉嫩在线观看| 免费观看人在逋| 色尼玛亚洲综合影院| 精品卡一卡二卡四卡免费| 成年版毛片免费区| av欧美777| 亚洲国产av影院在线观看| 人妻久久中文字幕网| 欧美亚洲日本最大视频资源| 视频区欧美日本亚洲| 亚洲avbb在线观看| 国产亚洲精品第一综合不卡| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 搡老乐熟女国产| 国产高清videossex| 桃花免费在线播放| 成年人午夜在线观看视频| 视频区欧美日本亚洲| 久久天堂一区二区三区四区| 最近最新中文字幕大全电影3 | 国产成人啪精品午夜网站| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 少妇 在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人 | 午夜免费鲁丝| 欧美乱码精品一区二区三区| 午夜福利视频在线观看免费| 精品亚洲成a人片在线观看| 国产黄色免费在线视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 窝窝影院91人妻| 欧美成人午夜精品| 91成人精品电影| 最近最新免费中文字幕在线| 成人18禁在线播放| 欧美中文综合在线视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 人人澡人人妻人| 国产一区二区在线观看av| 无限看片的www在线观看| 国产精品1区2区在线观看. | 性少妇av在线| 99久久99久久久精品蜜桃| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 极品人妻少妇av视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 亚洲成人免费电影在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽 | 十八禁人妻一区二区| 中文欧美无线码| 曰老女人黄片| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜|