玫瑰花青素提取工藝優(yōu)化及其抗疲勞研究

摘要：為優(yōu)化玫瑰花青素的提取工藝并探究其是否具有抗疲勞作用，該研究以平陰玫瑰為試驗材料，通過超聲提取法對其花青素進行提取，并通過響應(yīng)面試驗對其超聲提取工藝進行優(yōu)化，最終探索出玫瑰花青素最優(yōu)的超聲提取工藝為酸醇比1.6∶20、料液比1∶16、提取溫度50 ℃、提取時間50 min。在小鼠抗疲勞試驗中，灌胃玫瑰花青素的小鼠在抗疲勞能力上比對照組的小鼠提升72.5%，而在小鼠血液生化指標的測定中，灌胃玫瑰花青素的小鼠在糖原消耗、乳酸和尿素氮積累等指標上也表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢，該研究表明玫瑰花青素對小鼠具有一定的抗疲勞作用。

關(guān)鍵詞：玫瑰花青素；響應(yīng)面法；抗疲勞

中圖分類號：TS264.4""""" 文獻標志碼：A"""" 文章編號：1000-9973（2024）10-0205-05

Optimization of Extraction Process of Rose Anthocyanins

and Their Anti-Fatigue Study

ZHAO Dong， JIN Cang

（Huanghe University of Science and Technology， Zhengzhou 450063， China）

Abstract： In order to optimize the extraction process of rose anthocyanins and investigate whether they have anti-fatigue effects， in this study， with Pingyin rose as the test material， its anthocyanins are extracted by ultrasonic extraction method， and the ultrasonic extraction process is optimized through response surface test. Finally， the optimal ultrasonic extraction process for rose anthocyanins is determined as acid-alcohol ratio of 1.6∶20， solid-liquid ratio of 1∶16， extraction temperature of 50 ℃， and extraction time of 50 min. In the anti-fatigue test of mice， the anti-fatigue ability of mice given rose anthocyanins increases by 72.5% compared with that of mice in the control group， and in the determination of blood biochemical indexes of mice， the mice given rose anthocyanins also show obvious advantages in glycogen consumption， lactic acid and urea nitrogen accumulation.This study indicates that rose anthocyanins have" certain anti-fatigue effect on mice.

Key words： rose anthocyanins; response surface methodology; anti-fatigue

花青素又稱花色素，在自然界中廣泛存在于各種有色的花卉、蔬菜、水果中，作為一種天然的植物化合物，花青素在食品染色和醫(yī)療保健等方面受到廣泛關(guān)注[1-2]。當前研究表明，花青素具有抗氧化、提高視力、改善睡眠、清除自由基等功效[3]，可作為營養(yǎng)強化劑和食品著色劑應(yīng)用于食品中[4]。

玫瑰為薔薇科、薔薇屬灌木，原產(chǎn)于我國華北地區(qū)以及日本和朝鮮，是一種集觀賞與食藥用價值于一體的植物[5]。在我國可入藥的玫瑰品種主要為平陰玫瑰和苦水玫瑰[6]，目前國內(nèi)對其利用主要集中在食用和精油的提取方面[7]，對于其花青素的研究相對較少，當前已有研究表明，玫瑰色素粗提取物具有較好的體外抗氧化活性和緩解疲勞的能力[8]。本研究以平陰玫瑰為試驗材料，通過響應(yīng)面法優(yōu)化玫瑰花青素的超聲提取工藝，再通過小鼠試驗探究玫瑰花青素的抗疲勞作用。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

平陰玫瑰：山東華玫生物科技有限公司；健康雄性小鼠：昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物學(xué)部。

1.2 試劑與儀器

試劑：鹽酸、無水乙醇、60%乙醇溶液和矢車菊-3-O-葡萄糖苷。

儀器：電子天平、烘箱、離心機、紫外可見分光光度計和超聲波清洗機。

1.3 試驗方法

1.3.1 玫瑰花青素的提取

將平陰玫瑰烘干、研磨后過篩，避光保存。根據(jù)凌立貞等[9]的研究結(jié)果，采用酸醇比為1.6∶20，料液比為1∶16，在49 ℃、800 W的條件下超聲提取50 min，隨后離心取得的上清液即為玫瑰花青素提取液。

1.3.2 玫瑰花青素標準曲線的繪制

參照李艷秋等[2]的試驗方法，以矢車菊-3-O-葡萄糖苷標準品代替花青素標準品，取2 mg矢車菊-3-O-葡萄糖苷標準品溶于0.8%鹽酸-乙醇混合溶液中，并定容至10 mL，得到0.2 mg/L的標準溶液。用移液槍分別取0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL的標準溶液配制成4，6，8，10，12 μg/mL的溶液，以鹽酸-乙醇混合液為對照組，使用紫外可見分光光度計在520 nm處測定不同溶液的吸光度，試驗重復(fù)3次，并繪制標準曲線。

1.3.3 玫瑰花青素得率的測定

取2 g平陰玫瑰粉末，按照試驗設(shè)計的酸醇比、料液比、提取溫度和提取時間研究其對玫瑰花青素提取得率的影響。以鹽酸-乙醇混合液為對照組，在520 nm波長處測定提取的玫瑰花青素的吸光度，利用下式計算提取的玫瑰花青素的得率。

花青素得率（%）=標準曲線所得的花青素質(zhì)量濃度（mg/L）×提取液體積（L）×提取液稀釋倍數(shù)/[1 000×樣品質(zhì)量（mg）]×100%。

1.3.4 提取工藝優(yōu)化

1.3.4.1 單因素試驗

酸醇比對玫瑰花青素得率的影響試驗：精確稱取2 g平陰玫瑰粉末，加入20 mL濃度為60%的乙醇溶液。在料液比為1∶16、提取溫度為50 ℃、提取時間為50 min的條件下，研究不同的酸醇比（1.0∶20、1.2∶20、1.4∶20、1.6∶20、1.8∶20）對花青素提取得率的影響，每組重復(fù)3次。

料液比對玫瑰花青素得率的影響試驗：精確稱取2 g平陰玫瑰粉末，加入不同體積的60%乙醇溶液。在酸醇比為1.6∶20、提取溫度為50 ℃、提取時間為50 min的條件下，研究不同的料液比（1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20）對花青素提取得率的影響，每組重復(fù)3次。

提取溫度對玫瑰花青素得率的影響試驗：精確稱取2 g平陰玫瑰粉末，加入20 mL濃度為60%的乙醇溶液。在酸醇比為1.6∶20、料液比為1∶16、提取時間為50 min的條件下，研究不同的提取溫度（40，50，60，70，80 ℃）對花青素提取得率的影響，每組重復(fù)3次。

提取時間對玫瑰花青素得率的影響試驗：精確稱取2 g平陰玫瑰粉末，加入20 mL濃度為60%的乙醇溶液。在酸醇比為1.6∶20、料液比為1∶16、提取溫度為50 ℃的條件下，研究不同的提取時間（30，40，50，60，70 min）對花青素提取得率的影響，每組重復(fù)3次。

1.3.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計

在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，使用Design-Expert 12進行試驗設(shè)計，選擇酸醇比、料液比、提取溫度、提取時間為自變量，以玫瑰花青素得率為響應(yīng)值，設(shè)計響應(yīng)面試驗，見表1。

1.3.5 抗疲勞研究

1.3.5.1 轉(zhuǎn)棒試驗

將健康的雄性小鼠置于實驗室條件下適應(yīng)一段時間后，將小鼠隨機分為兩組，每組不少于20只。其中一組每天定時灌胃蒸餾水，另一組每天定時灌胃玫瑰花青素提取液，其他飼養(yǎng)條件一致。連續(xù)灌胃10 d 后，將小鼠置于25 r/min的轉(zhuǎn)棒上，按照每天1次、每次10 min的訓(xùn)練強度訓(xùn)練10 d，在10 d內(nèi)繼續(xù)灌胃給藥，10 d后將小鼠置于15 r/min的轉(zhuǎn)棒上，觀察記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒上運動的時間。

1.3.5.2 生化指標測定

取轉(zhuǎn)棒試驗結(jié)束后小鼠的眼眶血，將血液在4 ℃下以3 000 r/min離心20 min，分離血清，按試劑盒提取血清中肝糖原（HG）、肌糖原（MG）、乳酸（LA）、尿素氮（BUN）并測定其含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線

以矢車菊-3-O-葡萄糖苷的質(zhì)量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，見圖1。得到回歸方程：y=0.099 4x+0.040 2，R2=0.997 2。

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酸醇比對玫瑰花青素得率的影響

固定乙醇的體積，通過不斷增加鹽酸的含量配制不同的酸醇比，由圖2可知，玫瑰花青素得率隨著酸醇比的增大而增加，當酸醇比大于1.6∶20時，玫瑰花青素得率下降，因此，提取玫瑰花青素最優(yōu)的酸醇比為1.6∶20。

2.2.2 料液比對玫瑰花青素得率的影響

乙醇溶液可以起到溶解花青素的作用，在一定范圍內(nèi)，乙醇溶液越多，可溶解的花青素含量越多[10]。由圖3可知，料液比在1∶12～1∶16之間時，玫瑰花青素得率呈上升趨勢，當料液比大于1∶16時，玫瑰花青素得率逐漸減小，因此，提取玫瑰花青素最優(yōu)的料液比為1∶16。

2.2.3 提取溫度對玫瑰花青素得率的影響

由圖4可知，在超聲提取過程中，玫瑰花青素得率隨著溫度的升高呈上升趨勢，當溫度超過60 ℃時，玫瑰花青素得率呈下降趨勢，這可能與花青素在高溫下結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定有關(guān)[11]，因此在花青素提取過程中要時刻關(guān)注溫度，避免因為溫度過高導(dǎo)致花青素得率降低。

2.2.4 提取時間對玫瑰花青素得率的影響

由圖5可知，在50 min內(nèi)，玫瑰花青素得率隨著提取時間的增加而增加，當提取時間超過50 min時，玫瑰花青素的得率急劇下降，這是因為提取時間過短會導(dǎo)致花青素提取不充分，而提取時間過長會導(dǎo)致花青素結(jié)構(gòu)被破壞[12]，因此，超聲提取花青素最優(yōu)的時間為50 min。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗?zāi)Ｐ偷慕?/p>

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以酸醇比、料液比、提取溫度、提取時間為自變量，以玫瑰花青素得率為響應(yīng)值，利用Design-Expert 12進行響應(yīng)曲面設(shè)計，試驗設(shè)計方案及結(jié)果見表2。

通過自變量與響應(yīng)值的關(guān)系建立回歸方程：Y=10.12+0.130 8A－1.234B+0.04C－0.069D+1.022AB+0.256AC－0.123AD－0.37BC+0.53BD－0.356CD－1.53A2－0.78B2－0.31C2－0.527D2，該回歸方程的方差分析見表3。

由表3可知，該模型表現(xiàn)出較強的可靠性，回歸模型的P值極顯著，失擬項的P值不顯著，回歸方程的決定系數(shù)為0.989 5，表明該模型與實際值之間誤差較小。此外，除一次項A和交互項BD對花青素得率的影響不顯著外，其余項對花青素得率的影響均顯著。

2.3.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果及驗證

試驗所得的響應(yīng)曲面圖見圖6。

由圖6可知，4個因素兩兩交互對玫瑰花青素提取得率均有影響，且各個響應(yīng)面之間存在差異。

由圖6中 a可知，自變量B（料液比）方向的坡度明顯大于A（酸醇比）方向的坡度，表明料液比對玫瑰花青素得率的影響大于酸醇比。由圖6 中b可知，響應(yīng)面圖呈橢圓形，表明提取溫度與酸醇比的交互作用較顯著，而提取溫度方向的坡度明顯陡于酸醇比，故提取溫度對玫瑰花青素得率的影響大于酸醇比。由圖6中c可知，提取時間對玫瑰花青素得率的影響大于酸醇比。由圖6中d可知，提取溫度對玫瑰花青素得率的影響大于料液比。由圖6中e可知，提取時間對玫瑰花青素得率的影響大于料液比。由圖6中f可知，提取溫度對玫瑰花青素得率的影響大于提取時間。

通過響應(yīng)面分析，最終得到玫瑰花青素最佳提取工藝為酸醇比1.6∶20、料液比1∶16、提取溫度50 ℃、提取時間50 min，在此條件下玫瑰花青素得率為1.35%。

2.4 抗疲勞試驗結(jié)果

2.4.1 轉(zhuǎn)棒試驗結(jié)果

前人的研究表明，小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時間越長，表明其抗疲勞能力越好[13]。本研究將灌胃蒸餾水的小鼠設(shè)為對照組，灌胃玫瑰花青素的小鼠設(shè)為試驗組進行試驗，由表4可知，灌胃玫瑰花青素的小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留的時間顯著長于對照組，且小鼠在轉(zhuǎn)棒上停留時間的延長率為72.5%。該結(jié)果說明玫瑰花青素對小鼠的運動疲勞具有一定的緩解作用。

2.4.2 生化指標測定結(jié)果

在運動中，為保證正常的身體機能，身體會將儲存的糖原進行分解，從而為機體提供能量，此外，在運動中乳酸和尿素氮的含量也會隨著運動時間的延長以及運動強度的增加而增加[14]。因此在抗疲勞試驗中，一般會采用測量小鼠血液中的尿素氮、乳酸、糖原等指標檢測小鼠的疲勞程度。由表5可知，對對照組和試驗組的小鼠進行肝糖原、肌糖原、乳酸、尿素氮含量檢測，結(jié)果表明，在相同的運動條件下，灌胃玫瑰花青素的小鼠的肝糖原、肌糖原含量顯著低于灌胃蒸餾水的小鼠，而乳酸和尿素氮的含量顯著低于灌胃蒸餾水的小鼠。

3 討論與結(jié)論

近年來，花青素作為一種天然物質(zhì)被廣泛應(yīng)用于食品染色和藥物研究等方面。本研究以平陰玫瑰為試驗材料，在酸醇比、料液比、提取溫度、提取時間等方面對其提取工藝進行優(yōu)化，試驗結(jié)果表明，4個因素均對玫瑰花青素得率產(chǎn)生影響，影響大小為提取溫度＞提取時間＞料液比＞酸醇比。花青素結(jié)構(gòu)具有不穩(wěn)定的特點，因此在提取花青素過程中需注意避免溫度過高和微波時間過長對花青素結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞。此外，料液比對花青素的提取起著重要作用，只有足夠體積的溶劑才可將玫瑰花瓣中的花青素充分溶出。經(jīng)過本研究的工藝優(yōu)化，最終確定玫瑰花青素最佳提取工藝為酸醇比1.6∶20、料液比1∶16、提取溫度50 ℃、提取時間50 min，在該條件下提取的玫瑰花青素得率最高。

本研究還對玫瑰花青素的抗疲勞作用展開了相關(guān)試驗，在灌胃小鼠試驗中，灌胃玫瑰花青素的小鼠抗疲勞能力明顯提升，而在小鼠血液生化指標的測定中，灌胃玫瑰花青素的小鼠在糖原消耗、乳酸和尿素氮積累等指標上也表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。

本研究表明玫瑰花青素在小鼠試驗中具有明顯的抗疲勞作用，該結(jié)論對玫瑰花青素的深入研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)來源。

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收稿日期：2024-06-16

基金項目：2022年度教育部產(chǎn)學(xué)合作協(xié)同育人項目（220802700230021）；2024年度河南省教育廳人文社會科學(xué)課題（2024-ZDJH-524）

作者簡介：趙冬（1985—），男，講師，碩士，研究方向：營養(yǎng)健康。