茶樹果膠甲酯酶及其抑制子家族基因的鑒定及CsPME55參與氟脅迫響應(yīng)的功能分析

摘要：茶樹（Camellia sinensis）具有氟（Fluoride，F(xiàn)）富集特性，且F主要富集在細(xì)胞壁組分的果膠中；果膠甲酯酶（Pectin methylesterase，PME）及其抑制子PMEI（Pectin methylesterase inhibitor）能夠催化果膠的修飾進(jìn)而影響細(xì)胞壁特性，參與植物生長發(fā)育、逆境響應(yīng)等過程。從茶樹舒茶早基因組中鑒定了85個(gè)CsPMEs和56個(gè)CsPMEIs成員，分別包括4個(gè)和5個(gè)亞族；不同亞族可能因基因結(jié)構(gòu)、保守基序和表達(dá)模式等不同呈現(xiàn)功能分化。熒光定量結(jié)果表明，CsPME3a、CsPME55、CsPMEI1和CsPMEI3在福鼎大白茶成熟葉中被F處理顯著誘導(dǎo)表達(dá)。此外，過表達(dá)CsPME55緩解了F脅迫對(duì)擬南芥根系生長的抑制作用，推測(cè)CsPME55可能參與茶樹F脅迫調(diào)控，研究結(jié)果將為進(jìn)一步研究PME和PMEI家族基因參與F響應(yīng)的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：茶樹；氟；果膠甲酯酶；果膠甲酯酶抑制子；基因表達(dá)；功能分析

中圖分類號(hào)：S571.1；Q945.11 " " " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A " " " " " "文章編號(hào)：1000-369X（2024）06-869-18

Identification of Pectin Methylesterase and Its Inhibitory Subfamily Genes， and Functional Analysis of CsPME55 in Response to Fluoride Stress in Camellia sinensis

XU Wenluan， WEN Xiaoju， JIA Yuxuan， NI Dejiang， WANG Mingle*， CHEN Yuqiong*

National Key Laboratory for Germplasm Innovation and Utilization of Horticultural Crops， College of Horticulture and Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China

Abstract： Tea plant （Camellia sinensis） has fluoride （F） enrichment characteristics， and F is mainly enriched in the cell wall component pectin. Pectin methylsterase （PME） and its inhibitor PMEI can catalyze the modification of pectin， thereby affecting cell wall characteristics and participating in the regulation of processes like plant growth and development， stress response and so on. In this study， 85 CsPMEs and 56 CsPMEIs were identified from the C. sinensis ‘Shuchazao’ genome， which were divided into 4 and 5 subgroups， respectively. Distinct subgroups may exhibit functional distinction due to varied gene architectures， conserved motifs and expression patterns. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） analysis reveals that the expression levels of CsPME3a， CsPME55， CsPMEI1 and CsPMEI3 were significantly induced in the mature leaves of ‘Fuding Dabaicha’ under F treatment. Moreover， overexpression of CsPME55 alleviated Arabidopsis root growth inhibition induced by F stress， suggesting its potential role in F stress regulation in tea plants. These findings could pave the way for further research on the functional involvement of PME and PMEI gene families in F response.

Keywords： Camellia sinensis， fluoride， pectin methylesterase， pectin methylesterase inhibitor， gene expression， functional analysis

茶樹（Camellia sinensis）是一種重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，其葉可以加工成富含生物活性成分和愉悅風(fēng)味的飲品，在全世界范圍內(nèi)廣受歡迎。茶樹被發(fā)現(xiàn)具有氟（Fluoride，F(xiàn)）富集特性，可以通過空氣、土壤、水分等途徑吸收和富集F[1]。F不是茶樹生長發(fā)育的必需元素，卻是人體必需微量元素，而飲茶通常被認(rèn)為是人體獲取F的第二途徑，但長期飲用F含量較高的茶會(huì)危害人體健康[2-3]。F脅迫會(huì)誘發(fā)茶樹的氧化應(yīng)激，干擾其基因表達(dá)、信號(hào)傳導(dǎo)等正常生理生化過程，造成生長發(fā)育不良，導(dǎo)致根系發(fā)黑、葉邊緣壞死、細(xì)胞結(jié)構(gòu)受損等癥狀[4-5]，同時(shí)也會(huì)影響茶樹品質(zhì)成分如兒茶素、氨基酸等關(guān)鍵次級(jí)代謝物的合成[6-8]。

茶樹根系具有很強(qiáng)的F吸收轉(zhuǎn)運(yùn)能力，它主要通過木質(zhì)部向上運(yùn)輸F[7]。F主要分布在葉片中，且多在成熟葉中富集，因此有學(xué)者認(rèn)為F含量也可以作為茶葉品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)之一[9-11]。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞壁是F富集的主要部位，葉片中有67%～92%的F分布在細(xì)胞壁中，而果膠是茶樹葉片細(xì)胞壁累積F的主要部位，其F含量占細(xì)胞壁總F含量的56%～71%[10]。果膠是最具流動(dòng)性、最易帶電的，可能對(duì)環(huán)境變化最敏感的細(xì)胞壁成分，因此非常適合用于防御監(jiān)測(cè)，在細(xì)胞壁力學(xué)、細(xì)胞壁完整性以及細(xì)胞壁介導(dǎo)的植物免疫中發(fā)揮重要作用[12-14]。

同型半乳糖醛酸（Homogalacturonan，HG）是最豐富的果膠類型，它在高爾基體中以高度甲酯化狀態(tài)被合成，運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外間隙（Extracellular space，ECS）后被果膠甲酯酶（Pectin methylesterase，PME）選擇性地去甲酯化，而PME的活性反過來又受PME抑制子（Pectin methylesterase inhibitor，PMEI）的調(diào)節(jié)，即PME和PMEI共同調(diào)控HG的修飾，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞壁特性[15-16]。PME和PMEI對(duì)于細(xì)胞擴(kuò)張、植物生長發(fā)育和植物免疫都至關(guān)重要，其功能研究在多種植物中都有報(bào)道，比如，AtPME35能夠調(diào)控細(xì)胞壁去甲酯化程度，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）莖伸長過程中提供機(jī)械支撐[17]；過表達(dá)OsPMEI28能夠通過增加果膠甲酯化水平；導(dǎo)致水稻（Oryza sativa）矮化[18]；FvPME38/39在草莓（Fragaria vesca）果實(shí)軟化過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[19]，CsPMEs和CsPMEIs參與調(diào)控低溫誘導(dǎo)下的臍橙（Citrus sinensis Osbeck）果實(shí)?；痆20-21]；AtPME17能夠增加病原體誘導(dǎo)的PME活性和擬南芥對(duì)灰孢桿菌的抗性，而GhPMEI3能夠增強(qiáng)棉花（Gossypium hirsutum）對(duì)黃萎病的抗性[22-23]。此外，茶樹PME能夠增強(qiáng)茶樹對(duì)鋁的（Aluminum，Al）耐受性[24-25]，而茶樹PMEI也有參與冷脅迫響應(yīng)及開花發(fā)育的報(bào)道[26]。據(jù)報(bào)道[10]，F(xiàn)的添加能夠促進(jìn)茶樹細(xì)胞壁果膠的去甲酯化，同時(shí)誘導(dǎo)PMEs的活性和基因表達(dá)增加，但PME對(duì)F富集的影響及具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

本研究中對(duì)茶樹PME和PMEI基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定，對(duì)其理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化以及在F脅迫下的表達(dá)等進(jìn)行了分析；同時(shí)，對(duì)CsPME55在轉(zhuǎn)基因擬南芥中的功能進(jìn)行了初步分析。旨在為進(jìn)一步研究PME和PMEI基因家族參與F脅迫條件下的基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和處理

本研究選用茶樹品種鄂茶10號(hào)（ICR-22945）和福鼎大白茶（ICR-22965）一年生扦插苗進(jìn)行F處理，水培處理在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹種質(zhì)資源圃大棚中進(jìn)行。先置于去離子水中緩苗7 d，再使用1/2茶樹營養(yǎng)液（pH=5.0）[27]連續(xù)培養(yǎng)1個(gè)月，每7 d換1次營養(yǎng)液，然后轉(zhuǎn)至外源添加NaF的營養(yǎng)液（0.5 mmol·L-1 NaF，pH=5.5）[28]中培養(yǎng)，分別在0、1、2 h和12 h剪取茶樹嫩葉（第一葉）和成熟葉（倒數(shù)第二片葉子），液氮速凍后于﹣80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于分析茶樹PMEs和PMEIs在F脅迫條件下的表達(dá)。本研究克隆CsPME55開放閱讀框所用材料為福鼎大白茶的新梢（一芽一葉），采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹種質(zhì)資源圃。

1.2 茶樹PME和PMEI基因家族成員的鑒定

使用PME家族Pfam登錄號(hào)（PF01095）和PMEI家族Pfam登錄號(hào)（PF04043）在InterPro數(shù)據(jù)庫[29]獲得PME和PMEI家族的隱馬爾可夫模型（HMM），利用HMM在HMMER網(wǎng)站（www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer）獲得CsPMEs和CsPMEIs的序列（E-value≤1e-5），以茶樹舒茶早基因組為參考基因組進(jìn)行搜索比對(duì)，茶樹基因組下載自Tea Plant Information Archive（TPIA）[30]，結(jié)合PROSITE（https：//prosite.expasy.org）、SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）和CDD網(wǎng)站（www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/

bwrpsb/bwrpsb.cgi）進(jìn)行結(jié)構(gòu)域核實(shí)和確認(rèn)。

1.3 茶樹PME和PMEI基因家族成員蛋白的生物信息學(xué)分析

利用在線網(wǎng)站ExPASy（https：//web.expasy.

org/compute_pi）預(yù)測(cè)蛋白分子量和理論等電點(diǎn)（pI）；利用GSDS 2.0（https：//gsds.gao-lab.

org）進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析；分別使用MEME（https：//meme-suite.org/meme）和CDD網(wǎng)站檢索保守基序和特征結(jié)構(gòu)域，并利用TBtools[31]進(jìn)行可視化；使用MEGA X軟件[32]中的鄰接法（Neighbor-Joining）對(duì)茶樹、擬南芥和水稻PMEs和PMEIs進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹繪制，其中Bootstrap value設(shè)置為1 000。

1.4 茶樹PME和PMEI基因家族成員的表達(dá)分析

茶樹PMEs和PMEIs在茶樹8個(gè)組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)獲取自TPIA。分別使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（華越洋，北京）和cDNA第一鏈合成試劑盒（SIMGEN，杭州）進(jìn)行RNA提取和反轉(zhuǎn)錄，獲得的cDNA用于逆轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcription-PCR，RT-PCR）和即時(shí)PCR（Quantitative real time PCR，qRT-PCR）。利用在線軟件Genscript（www.genscript.com/

tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool）設(shè)計(jì)PMEs和PMEIs基因特異性定量引物（表1），分別以CsEF-1α和CsUBC為嫩葉和成熟葉中的內(nèi)參基因進(jìn)行歸一化分析[33]。試驗(yàn)參照PerfectStart? Green qPCR SuperMix（全式金，北京）的試劑說明書，在ABI Step One Plus? Real Time PCR System（Applied Biosystems，美國）上進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果利用 算法進(jìn)行分析[34]。其中，將0 h的表達(dá)量設(shè)定為1.0。

1.5 CsPME55的克隆與轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得

以福鼎大白茶的cDNA為模板，以CsPME55-F/R（表1）為引物，利用PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase（TaKaRa，大連）擴(kuò)增不含終止密碼子的CsPME55的開放閱讀框。將所得擴(kuò)增產(chǎn)物連接pTOPO-Blunt Vector（艾德萊，北京）后菌液檢測(cè)，陽性克隆送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，并對(duì)測(cè)序正確的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提（艾德萊，北京）。以上述質(zhì)粒為模板，以pBinGlyRed3-CsPME55-

F/R（表1）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物參照ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit（諾唯贊，南京）重組試劑盒說明書在SmaI位點(diǎn)插入連接到植物表達(dá)載體pBinGlyRed3中，獲得pBinGlyRed3-CsPME55重組質(zhì)粒。利用凍融法將pBinGlyRed3質(zhì)粒（Vector）和上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，通過蘸花法得到擬南芥轉(zhuǎn)基因T0代植株，利用pBinGlyRed3載體的DsRed的紅色熒光蛋白標(biāo)記特性[35]，結(jié)合PCR鑒定結(jié)果[36]，獲得T1代陽性種子，經(jīng)過3代篩選最終得到T3代純合株系。

1.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型分析及CsPME55的亞細(xì)胞定位

將同期收獲的野生型（WT）和T3代轉(zhuǎn)基因擬南芥種子（Vector、OE-1、OE-2和OE-3）

經(jīng)低溫春化和消毒后播種在含有不同濃度NaF（0、0.2、2 mmol·L-1和3 mmol·L-1）的1/2MS固體培養(yǎng)基（酷萊博，北京）中，放置于組培室（晝/夜參數(shù)：24 ℃/22 ℃，16 h/8 h）中培養(yǎng)3 d后統(tǒng)計(jì)擬南芥的萌發(fā)率，培養(yǎng)2周后拍照記錄并稱取鮮重，同時(shí)使用Image J軟件（Version 1.8.0）測(cè)量根長。將上述樣品烘至恒重后磨成粉末置于干燥條件下儲(chǔ)存，用于后續(xù)水溶性F含量的測(cè)定。利用超聲波和沸水浸提測(cè)定F含量。精確稱取0.02 g上述粉末于離心管中，加入2 mL超純水，75 ℃超聲浸提40 min，100 ℃沸水浸提30 min，每10 min振蕩混勻1次，然后12 000 r·min-1離心15 min。冷卻后取1 mL上清液，加入1 mL總離子緩沖液［3 mol·L-1三水合乙酸鈉∶0.75 mol·L-1二水合檸檬酸鈉=1∶1（V/V）進(jìn)行配制］，充分混勻后用F離子電極（雷磁，上海）測(cè)量，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算F含量，F(xiàn)含量測(cè)定包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。為了確認(rèn)CsPME55的亞細(xì)胞定位，利用激光共聚焦顯微鏡（Leica SP8，德國）觀察空載和CsPME55轉(zhuǎn)基因擬南芥（一周齡）葉片表皮細(xì)胞中的紅色熒光信號(hào)（RFP）并拍照，RFP分別在552 nm和590～650 nm被激發(fā)和接收。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹PME和PMEI家族的鑒定

在茶樹中分別鑒定出85個(gè)PMEs和56個(gè)PMEIs，基本信息分別見表2和表3。PMEs中包含59個(gè)I型PME（同時(shí)包含PME結(jié)構(gòu)域和PMEI結(jié)構(gòu)域）和26個(gè)II型PME（僅包含PME結(jié)構(gòu)域），編碼序列（Coding sequence，CDS）長度為378～3 624 bp；蛋白質(zhì)分子量為13.53～133.42 kDa；理論pI為4.75～9.65。而PMEIs的CDS序列長度為417～1 506 bp；蛋白質(zhì)分子量

為15.10～54.93 kDa；理論pI為3.93～9.76。

2.2 進(jìn)化樹分析

分別以擬南芥、水稻和茶樹的194條PME蛋白序列和183條PMEI蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果表明（圖1），PME家族可被分為4個(gè)亞族（Ⅰ～Ⅳ），其中超70%（60個(gè)）的成員屬于Ⅰ亞族；而PMEI家族可被分為5個(gè)亞族（Ⅰ～Ⅴ），其中半數(shù)成員（28個(gè)）屬于Ⅴ亞族。

2.3 基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，除CsPME17/38不含內(nèi)含子，CsPME21含有14個(gè)內(nèi)含子外，其余CsPMEs的內(nèi)含子個(gè)數(shù)為1～5個(gè)（表2）；而在56個(gè)CsPMEIs中，只有13個(gè)被檢索到有內(nèi)含子，其中，CsPMEI13包含9個(gè)內(nèi)含子，數(shù)量最多（表3）。

利用MEME鑒定CsPMEs和CsPMEIs的保守基序（Motif）。如圖2所示，CsPMEs的Motif數(shù)量為4～16，其中絕大多數(shù)蛋白包含Motif 1～5和Motif 8，說明這幾個(gè)Motif較為保守且可能承擔(dān)較為重要的生物學(xué)功能。此外，同一亞族的蛋白Motif相似性較高，暗示其在進(jìn)化過程中可能具有相似的功能分化，PME特征結(jié)構(gòu)域（Domain）的分析也印證了這一觀點(diǎn)，比如亞族Ⅱ的成員均為Ⅰ型PME，而亞族Ⅳ的成員均為Ⅱ型PME。和PME相比，PMEI蛋白Motif的數(shù)量較少（圖3），為1～9，其中CsPMEI51只包含Motif 2，CsPMEI43只包含Motif 14，此外，CsPMEI13包含兩個(gè)PMEI特征結(jié)構(gòu)域。

2.4 表達(dá)模式分析

TPIA的組織表達(dá)數(shù)據(jù)表明，多數(shù)CsPMEs在根或花中特異性表達(dá)（圖4），比如CsPME57僅在根中表達(dá)，CsPME23在花中特異性高表達(dá)；而部分CsPMEs在茶樹各組織均有表達(dá)，比如CsPME3a在頂芽、嫩葉、莖和花中均有高豐度表達(dá)；此外，CsPME24、CsPME36、CsPME70和CsPME71未檢測(cè)到表達(dá)。

組織分析發(fā)現(xiàn)（圖5），多數(shù)CsPMEIs在根或花中表達(dá)較高，如CsPMEI43在花中高表達(dá)；而部分CsPMEIs在茶樹各組織均有表達(dá)，如CsPMEI1/29僅在老葉中表達(dá)較低；此外，CsPMEI12等7個(gè)基因未檢測(cè)到表達(dá)。

2.5 CsPMEs和CsPMEIs在F脅迫條件下的表達(dá)分析

分別在PME和PMEI基因家族中隨機(jī)選擇了4個(gè)基因，對(duì)其在F脅迫下的表達(dá)水平進(jìn)行了qRT-PCR分析（圖6）。在茶樹品種鄂茶10號(hào)中，除CsPMEI1外，其余基因在嫩葉中的表達(dá)整體呈下調(diào)趨勢(shì)，而CsPME31、CsPME51和CsPME55在成熟葉中表達(dá)上調(diào)。在茶樹品種福鼎大白茶中，未在其嫩葉中檢測(cè)到CsPME3a、CsPME31和CsPMEI17的表達(dá)，CsPME55表達(dá)無顯著變化，而CsPME51、CsPMEI1、CsPMEI3和CsPMEI31均呈現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)的表達(dá)趨勢(shì)（圖6A）；在成熟葉中，CsPME3a、CsPME55、CsPMEI1和CsPMEI3均被誘導(dǎo)表達(dá)，CsPME31、

CsPME51和CsPMEI17下調(diào)表達(dá)，而CsPMEI31的表達(dá)則出現(xiàn)了動(dòng)態(tài)變化，即先降后升再降，并在2 h時(shí)達(dá)到最大值（圖6B）。上述結(jié)果表明，F(xiàn)脅迫條件下，CsPMEs和CsPMEIs的表達(dá)水平與茶樹品種的F富集特性以及葉片成熟度有關(guān)。

2.6 過表達(dá)CsPME55對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥F耐受的影響分析

上述結(jié)果表明，CsPME55在8個(gè)組織中均有較高表達(dá)，同時(shí)其在鄂茶10號(hào)和福鼎大白茶的成熟葉中均能夠受F誘導(dǎo)而上調(diào)表達(dá)，因此，選擇了CsPME55進(jìn)行進(jìn)一步的功能驗(yàn)證。為驗(yàn)證CsPME55的生物學(xué)功能，將WT和轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（Vector、OE-1、OE-2和OE-3）播種在未添加（Control）和外源添加NaF的1/2MS培養(yǎng)基中。播種3 d后發(fā)現(xiàn)，3 mmol·L-1 NaF顯著抑制了擬南芥種子的萌發(fā)，使萌發(fā)率降低到了40.00%～63.33%，而CsPME55過表達(dá)株系（OE-1、OE-2和OE-3）表現(xiàn)出萌發(fā)優(yōu)勢(shì)（圖7）；播種14 d后，擬南芥在添加外源NaF后根系發(fā)

育受到明顯抑制（圖8A），包括根系生長（圖8C）和側(cè)根發(fā)育（圖8D），且WT和Vector受抑制程度更重，0.2 mmol·L-1 NaF條件下表現(xiàn)最為明顯。此外，和對(duì)照相比，外源添加2 mmol·L-1 NaF顯著降低了擬南芥的鮮重（圖8B）。F含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，對(duì)照條件下僅有WT和OE-2的F含量存在顯著差異（Plt;0.05）（圖8E）；而添加0.2 mmol·L-1外源NaF之后，與WT相比，所有轉(zhuǎn)基因擬南芥F含量均較低，且Vector、OE-2和OE-3顯著降低；添加2 mmol·L-1外源NaF之后，與WT和Vector相比，CsPME55過表達(dá)株系中的F含量較低，且OE-3顯著降低（Plt;0.05）。上述結(jié)果表明，過表達(dá)CsPME55能夠在一定程度上緩解F脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥生長的抑制，尤其是根系發(fā)育。

2.7 CsPME55的亞細(xì)胞定位

為確定CsPME55蛋白的亞細(xì)胞定位，利用激光共聚焦顯微鏡觀察了一周齡的CsPME55轉(zhuǎn)基因擬南芥，對(duì)照為pBinGlyRed3空載。結(jié)果表明，空載蛋白的紅色熒光信號(hào)（RFP）在擬南芥細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中廣泛存在，而pBinGlyRed3-CsPME55蛋白集中在細(xì)胞質(zhì)中（圖9）。

3 討論

本研究從茶樹舒茶早基因組中分別鑒定了85個(gè)CsPMEs和56個(gè)CsPMEIs。鑒定的基因數(shù)多于Huang等[25]鑒定的CsPMEs以及Li等[26]鑒定的CsPMEIs，這可能與參考的數(shù)據(jù)庫以及篩選鑒定的標(biāo)準(zhǔn)不完全相同有關(guān)。參考擬南芥和水稻的PME和PMEI蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，茶樹PME和PMEI家族分別被分為4個(gè)和5個(gè)亞家族，基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析也支持這個(gè)分類，每個(gè)亞家族成員間都有相似的基因結(jié)構(gòu)和保守基序。同時(shí)一些基因的序列、基因結(jié)構(gòu)以及保守基序相似性極高，如CsPME32a/b和CsPMEI9a/b，這表明兩個(gè)家族中可能存在功能冗余。

基因的表達(dá)模式是基因功能預(yù)測(cè)的重要依據(jù)，表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，CsPMEs和CsPMEIs在各組織中的表達(dá)存在較大差異，表明其在不同組織中可能存在功能分化。PMEs的表達(dá)被證明具有組織特異性、以特定的方式受脅迫調(diào)控、參與植物防御響應(yīng)并在廣泛的發(fā)育過程中受到調(diào)控的特點(diǎn)[37]。例如，AtPME35在花序莖基部特異性表達(dá)并參與調(diào)控?cái)M南芥莖伸長[17]，而在保衛(wèi)細(xì)胞中高度表達(dá)的AtPME34能夠受脫落酸誘導(dǎo)表達(dá)，通過促進(jìn)氣孔運(yùn)動(dòng)來增加擬南芥耐熱性[38]，因此根據(jù)組織表達(dá)特性可以推斷，在花中特異性高度表達(dá)的CsPME13和CsPMEI54等基因可能參與茶樹花發(fā)育。F響應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)，CsPME3a、CsPME55、CsPMEI1和CsPMEI3在福鼎大白茶成熟葉中被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，同時(shí)F又主要在成熟葉中富集，推測(cè)它們可能參與F脅迫響應(yīng)。

F脅迫會(huì)影響茶樹的正常生長發(fā)育，而PME和PMEI能夠通過參與細(xì)胞壁修飾而廣泛地參與到植物的生長發(fā)育、氣孔運(yùn)動(dòng)、逆境響應(yīng)等過程的調(diào)控，F(xiàn)代謝相關(guān)基因的表達(dá)被認(rèn)為是植物耐F和維持F穩(wěn)態(tài)的重要因素[8]。為了進(jìn)一步確定CsPMEs在茶樹響應(yīng)F脅迫中的作用，本研究利用擬南芥轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)對(duì)CsPME55進(jìn)行了初步功能分析，過表達(dá)CsPME55在3 mmol·L-1 NaF脅迫條件下的種子萌發(fā)率高于WT以及空載，這表明CsPME55可能在種子萌發(fā)過程中發(fā)揮作用，類似功能在萵苣（Lactuca sativa）、擬南芥和棉花中均有報(bào)道[39-40]，PME

在種子發(fā)育和發(fā)芽過程中可能存在誘導(dǎo)作用，且PME活性與種子萌發(fā)能力存在正相關(guān)[41]。F脅迫會(huì)影響茶樹根系發(fā)育[10]，而過表達(dá)CsPME55在一定程度上緩解了F脅迫誘導(dǎo)的擬南芥根系抑制。PME和PMEI在根系發(fā)育和礦質(zhì)元素耐受的研究早有報(bào)道，AtPME46被發(fā)現(xiàn)能夠通過降低PME酶活性，減少Al與細(xì)胞壁的結(jié)合，從而減輕Al誘導(dǎo)的根系生長抑制[42]，而OsPME14能夠提高根尖細(xì)胞壁的PME活性和Al含量，且過表達(dá)水稻對(duì)Al脅迫更敏感[43]；木薯（Maninot esculenta）PMEI成員MePMEI1被發(fā)現(xiàn)可以抑制細(xì)胞壁的PME活性，且能夠促進(jìn)過表達(dá)擬南芥對(duì)重金屬鉛的耐受[44]。CsPME55在8個(gè)組織中均有較高表達(dá)且在根部表達(dá)最高，同時(shí)其在成熟葉中的表達(dá)能夠受F誘導(dǎo)而上調(diào)，推測(cè)CsPME55可能在F脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用，而CsPME55能夠在一定程度上緩解F脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥的生長抑制，可能與其定位在細(xì)胞質(zhì)有關(guān)。

綜上，本研究對(duì)茶樹PME和PMEI家族基因基本理化特性、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、蛋白序列、組織表達(dá)和F響應(yīng)進(jìn)行了分析，初步探索了CsPME55在F脅迫響應(yīng)中可能發(fā)揮的作用。結(jié)果表明，茶樹PMEs和PMEIs具有組織特異性表達(dá)且可能參與F脅迫響應(yīng)，但參與調(diào)控植物響應(yīng)F脅迫的具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

[1] Shu W S， Zhang Z Q， Lan C Y， et al. Fluoride and aluminium concentrations of tea plants and tea products from Sichuan province， PR China [J]. Chemosphere， 2003， 52（9）： 1475-1482.

[2] Cai H M， Zhu X H， Peng C Y， et al. Critical factors determining fluoride concentration in tea leaves produced from Anhui province， China [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety， 2016， 131： 14-21.

[3] Das S， de Oliveira L M， da Silva E， et al. Fluoride concentrations in traditional and herbal teas： health risk assessment [J]. Environmental Pollution， 2017， 231： 779-784.

[4] Barbier O， Arreola-Mendoza L， Del Razo L M. Molecular mechanisms of fluoride toxicity [J]. Chemico-Biological Interactions， 2010， 188（2）： 319-333.

[5] Luo J L， Hu K， Qu F F， et al. Metabolomics analysis reveals major differential metabolites and metabolic alterations in tea plant leaves （Camellia sinensis L.） under different fluorine conditions [J]. Journal of Plant Growth Regulation， 2021， 40（2）： 798-810.

[6] Yang X， Yu Z， Zhang B B， et al. Effect of fluoride on the biosynthesis of catechins in tea [Camellia sinensis （L.） O. Kuntze] leaves [J]. Scientia Horticulturae， 2015， 184： 78-84.

[7] 邢安琪， 武子辰， 徐曉寒， 等. 茶樹富集氟的特點(diǎn)及其機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 茶葉科學(xué)， 2022， 42（3）： 301-315.

Xing A Q， Wu Z C， Xu X H， et al. Research advances of fluoride accumulation mechanisms in tea plants （Camellia sinensis） [J]. Journal of Tea Science， 2022， 42（3）： 301-315.

[8] Yang J， Liu C S， Li J L， et al. Critical review of fluoride in tea plants （Camellia sinensis）： absorption， transportation， tolerance mechanisms， and defluorination measures [J]. Beverage Plant Research， 2024， 4： e019. doi： 10.48130/bpr-0024-0010.

[9] Niu H L， Peng C Y， Zhu X D， et al. Positron-emitting tracer imaging of fluoride transport and distribution in tea plant [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2020， 100（8）： 3554-3559.

[10] Luo J L， Ni D J， Li C L， et al. The relationship between fluoride accumulation in tea plant and changes in leaf cell wall structure and composition under different fluoride conditions [J]. Environmental Pollution， 2021， 270： 116283. doi： 10.1016/j.envpol.2020.116283.

[11] Lu Y， Guo W F， Yang X Q. Fluoride content in tea and its relationship with tea quality [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2004， 52（14）： 4472-4476.

[12] Peaucelle A， Braybrook S A， Le Guillou L， et al. Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis [J]. Current Biology， 2011， 21（20）： 1720-1726.

[13] Wolf S. Cell wall signaling in plant development and defense [J]. Annual Review of Plant Biology， 2022， 73： 323-353.

[14] Wang D D， Kanyuka K， Papp-Rupar M. Pectin： a critical component in cell-wall-mediated immunity [J]. Trends in Plant Science， 2023， 28（1）： 10-13.

[15] Micheli F. Pectin methylesterases： cell wall enzymes with important roles in plant physiology [J]. Trends in Plant Science， 2001， 6（9）： 414-419.

[16] Du J， Anderson C T， Xiao C W. Dynamics of pectic homogalacturonan in cellular morphogenesis and adhesion， wall integrity sensing and plant development [J]. Nature Plants， 2022， 8（4）： 332-340.

[17] Hongo S， Sato K， Yokoyama R， et al. Demethylesterification of the primary wall by PECTIN METHYLESTERASE35 provides mechanical support to the Arabidopsis stem [J]. Plant Cell， 2012， 24（6）： 2624-2634.

[18] Nguyen H P， Jeong H Y， Jeon S H， et al. Rice pectin methylesterase inhibitor28 （OsPMEI28） encodes a functional PMEI and its overexpression results in a dwarf phenotype through increased pectin methylesterification levels [J]. Journal of Plant Physiology， 2017， 208： 17-25.

[19] Xue C， Guan S C， Chen J Q， et al. Genome wide identification and functional characterization of strawberry pectin methylesterases related to fruit softening [J]. BMC Plant Biology， 2020， 20（1）： 13. doi： 10.1186/s12870-019-2225-9.

[20] Li Z X， Wang C， Long D， et al. Genome-wide identification， bioinformatics characterization and functional analysis of pectin methylesterase inhibitors related to low temperature-induced juice sac granulation in navel orange （Citrus sinensis Osbeck） [J]. Scientia Horticulturae， 2022， 298： 110983. doi： 10.1016/j.scienta.2022.110983.

[21] Li Z X， Wu L M， Wang C， et al. Characterization of pectin methylesterase gene family and its possible role in juice sac granulation in navel orange （Citrus sinensis Osbeck） [J]. BMC Genomics， 2022， 23（1）： 185. doi： 10.1186/s12864-022-08411-0.

[22] Del Corpo D， Fullone M R， Miele R， et al. AtPME17 is a functional Arabidopsis thaliana pectin methylesterase regulated by its PRO region that triggers PME activity in the resistance to Botrytis cinerea [J]. Molecular Plant Pathology， 2020， 21（12）： 1620-1633.

[23] Liu N N， Sun Y， Pei Y K， et al. A pectin methylesterase inhibitor enhances resistance to Verticillium Wilt [J]. Plant Physiology， 2018， 176（3）： 2202-2220.

[24] Li D Q， Shu Z F， Ye X L， et al. Cell wall pectin methyl-esterifcation and organic acids of root tips involve in aluminum tolerance in Camellia sinensis [J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2017， 119： 265-274.

[25] Huang D J， Mao Y X， Guo G Y， et al. Genome-wide identification of PME gene family and expression of candidate genes associated with aluminum tolerance in tea plant （Camellia sinensis） [J]. BMC Plant Biology， 2022， 22（1）： 306. doi： 10.1186/s12870-022-03686-7.

[26] Li B， Wang H， He S， et al. Genome-wide identification of the PMEI gene family in tea plant and functional analysis of CsPMEI2 and CsPMEI4 through ectopic overexpression [J]. Frontiers in Plant Science， 2022， 12： 807514. doi： 10.3389/fpls.2021.807514.

[27] Wan Q， Xu R K， Li X H. Proton release by tea plant （Camellia sinensis L.） roots as affected by nutrient solution concentration and pH [J]. Plant Soil and Environment， 2012， 58（9）： 429-434.

[28] Gao H J， Zhao Q， Zhang X C， et al. Localization of fluoride and aluminum in subcellular fractions of tea leaves and roots [J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 2014， 62（10）： 2313-2319.

[29] Paysan-Lafosse T， Blum M， Chuguransky S， et al. InterPro in 2022 [J]. Nucleic Acids Research， 2023， 51（D1）： D418-D427.

[30] Gao Q J， Tong W， Li F D， et al. TPIA2： an updated tea plant information archive for Camellia genomics [J]. Nucleic Acids Research， 2024， 52（D1）： D1661-D1667.

[31] Chen C J， Chen H， Zhang Y， et al. 2020. TBtools： an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data [J]. Molecular Plant， 13（8）： 1194-1202.

[32] Kumar S， Stecher G， Li M， et al. MEGA X： molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms [J]. Molecular Biology and Evolution， 2018， 35（6）： 1547-1549.

[33] 李慶會(huì)， 李睿， 溫曉菊， 等. 氟脅迫條件下茶樹葉部實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的篩選與驗(yàn)證[J]. 茶葉科學(xué)， 2024， 44（1）： 27-36.

Li Q H， Li R， Wen X J， et al. Selection and validation of internal reference genes for qRT-PCR analysis under fluoride stress in Camellia sinensis leaves [J]. Journal of Tea Science， 2024， 44（1）： 27-36.

[34] Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCT method [J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[35] Jach G， Binot E， Frings S， et al. Use of red fluorescent protein from Discosoma sp. （dsRED） as a reporter for plant gene expression [J]. The Plant Journal， 2001， 28（4）： 483-491.

[36] 楊雙， 阮燕曄， 樊金娟， 等. 一種簡易的擬南芥幼苗微量DNA提取方法[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2005， 36（1）： 99-100.

Yang S， Ruan Y Y， Fan J J， et al. A rapid-simple method of trace DNA extraction from a single plant of Arabidopsis thaliana [J]. Journal of Shenyang Agricultural University， 2005， 36（1）： 99-100.

[37] Pelloux J， Rustérucci C， Mellerowicz E J. New insights into pectin methylesterase structure and function [J]. Trends in Plant Science， 2007， 12 （6）： 267-277.

[38] Huang Y C， Wu H C， Wang Y D， et al. PECTIN METHYLESTERASE34 contributes to heat tolerance through its role in promoting stomatal movement [J]. Plant Physiology， 2017， 174（2）： 748-763.

[39] Xu Z J， Yang M， Li Z Y， et al. Tissue-specific pectin methylesterification and pectin methylesterase activities play a role in lettuce seed germination [J]. Scientia Horticulturae， 2022， 301： 111134. doi： 10.1016/j.scienta.2022.111134.

[40] Pei Y Y， Wang Y K， Wei Z Z， et al. Pectin methylesterase inhibitors GhPMEI53 and AtPMEI19 improve seed germination by modulating cell wall plasticity in cotton and Arabidopsis [J]. Journal of Integrative Agriculture， 2024， 23（10）： 3487-3505.

[41] Ren C， Kermode A R. An increase in pectin methylesterase activity accompanies dormancy breakage and germination of yellow cedar seeds [J]. Plant Physiology， 2000， 124（1）： 231-242.

[42] Geng X Y， Horst W J， Golz J F， et al. LEUNIG_HOMOLOG transcriptional co-repressor mediates aluminium sensitivity through PECTIN METHYLESTERASE46-modulated root cell wall pectin methylesterification in Arabidopsis [J]. The Plant Journal， 2017， 90（3）： 491-504.

[43] Yang X Y， Zeng Z H， Yan J Y， et al. Association of specific pectin methylesterases with Al-induced root elongation inhibition in rice [J]. Physiologia Plantarum， 2013， 148（4）： 502-511.

[44] Zhou Y J， Li R M， Wang S J， et al. Overexpression of MePMEI1 in Arabidopsis enhances Pb tolerance [J]. Frontiers in Plant Science， 2022， 13： 996981. doi： 10.3389/fpls.2022.996981.