土壤滅菌和殺真菌劑對大豆生長和重金屬累積的影響

摘要： 【目的】研究土壤滅菌和殺真菌劑（苯菌靈） 對大豆生長和重金屬累積的影響?！痉椒ā恳晕廴巨r(nóng)田土壤為基質(zhì)開展室內(nèi)盆栽試驗，在土壤滅菌和施用苯菌靈的條件下，測定大豆的生長指標、葉綠素含量、抗氧化生理指標、重金屬（鉛、鋅、鎘和銅） 含量與累積量以及土壤重金屬有效態(tài)含量。【結(jié)果】與原狀土壤相比，土壤滅菌處理導(dǎo)致大豆株高、莖葉和果實生物量分別降低21.00%、43.92% 和44.47%，但可以使根系生物量增加56.57%。土壤滅菌和施用苯菌靈處理均可顯著增加土壤有效態(tài)鉛含量，增幅分別為160.62% 和179.00%；均可顯著降低土壤有效態(tài)鋅含量，降幅分別為33.82% 和17.37%。土壤滅菌還可顯著增加大豆根系中的鋅、鎘含量以及鉛、鋅、鎘、銅累積量，顯著降低大豆莖葉和果實中的鉛、銅累積量，增加鉛、鋅和鎘的富集系數(shù)。施用苯菌靈可顯著增加類胡蘿卜素以及莖葉和根系中的鉛含量，增幅分別為77.00%、36.87% 和12.43%；顯著增加大豆莖葉中的鉛累積量；顯著增加鉛的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)；但對大豆生長、抗氧化生理及其他重金屬累積無顯著影響?！窘Y(jié)論】完全消除土壤微生物抑制了大豆的生長，并顯著降低了大豆對重金屬的耐性與累積能力，說明土壤微生物在大豆生長和重金屬耐性方面有重要作用。

關(guān)鍵詞： 土壤滅菌；土壤微生物；生長生理；重金屬含量；土壤重金屬有效態(tài)

中圖分類號： S565.101 文獻標志碼： A 文章編號： 1004–390X （2024） 05?0151?09

由于礦區(qū)不合理開采、工業(yè)“三廢”排放、農(nóng)藥和化肥不合理使用等導(dǎo)致土壤中的重金屬大量累積[1]，土壤重金屬污染已被公認為農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)發(fā)展的嚴重危害之一。重金屬是指密度大于5 g/cm3 的金屬元素，植物在吸收重金屬后會在其體內(nèi)累積，影響其抗氧化生理活性[2]，抑制生長[3]。植物大豆（Glycine max L.） 生長迅速，具有耐旱、抗寒、耐鹽堿等優(yōu)良特性，且其籽粒對部分重金屬的累積量低[4]，可作為土壤重金屬污染地區(qū)的經(jīng)濟作物之一。

在重金屬脅迫下，土壤微生物對促進植物生長和重金屬耐性方面具有重要作用。土壤微生物是土壤的重要組成部分，且具有多種功能，如改善土壤質(zhì)量、促進植物生長、解毒和從土壤中去除重金屬[5]。土壤微生物，特別是根際微生物在吸收和利用植物提供的營養(yǎng)物質(zhì)（包括有機酸、氨基酸等） 的同時，可以代謝這些營養(yǎng)物質(zhì)以促進植物生長；利用根際微生物的代謝物、氧化/還原反應(yīng)等來改變土壤中重金屬的生物有效性，可以增強植物根系對重金屬的吸收[6]。已有研究表明：根瘤菌[7-8]、叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizalfungi，AMF）[9-10]等微生物對植物耐重金屬脅迫具有重要作用。此外，重金屬污染土壤中還存在其他有益微生物，長期適應(yīng)重金屬脅迫并進化的土壤微生物也對重金屬具有很強的耐受性，其對植物生長與重金屬耐受的影響[11-12]已引起極大的關(guān)注。高壓滅菌和抑制微生物活性可以反映土壤微生物對植物生長及抵御重金屬的重要作用。有研究表明：土壤滅菌可減少植株的光合色素含量，顯著降低植株生物量，降低植株對重金屬的耐性及累積能力[13]。為闡釋土壤微生物對大豆耐重金屬和累積能力的重要作用，本研究以重金屬污染土壤為基質(zhì)，分析土壤高溫滅菌和施用苯菌靈對大豆生長、葉片抗逆性（可溶性蛋白、丙二醛和非蛋白巰基含量以及總抗氧化力）、重金屬（Pb、Zn、Cd 和Cu） 含量和累積量以及根際土壤有效態(tài)重金屬含量的影響，以期為重金屬污染土壤地區(qū)的經(jīng)濟作物種植提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤和植物

供試土壤為山原紅壤，取自云南省會澤鉛鋅冶煉廠周邊污染的農(nóng)田。在陰涼通風處自然風干， 去除植物殘體，過8 目篩， 供盆栽試驗使用。其基本理化性質(zhì)為： pH 值為6.91，有機質(zhì)含量28.7 g/kg，全氮含量2.2 g/kg，全磷含量2.5 g/kg，全鉀含量6.5 g/kg，堿解氮含量72.6 mg/kg，速效磷含量38.5 mg/kg，速效鉀含量147.8 mg/kg，鉛（Pb）、鋅（Zn）、鎘（Cd）、銅（Cu）全量分別為684.8、371.7、6.3 和118.3 mg/kg。

供試大豆品種為云黃14。選擇大小相同、籽粒飽滿的種子，用10% 過氧化氫表面消毒（用玻璃棒攪拌10 min） 后，用蒸餾水洗凈，置于放有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，再放入25 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中催芽3 d，種子出芽后進行移栽。

1.2 盆栽試驗

盆栽試驗在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山試驗大棚內(nèi)進行。試驗設(shè)原狀土壤（對照組）、施用苯菌靈和土壤滅菌3 種處理，選用直徑25 cm、高20 cm 的花盆，每盆裝土樣3.0 kg。每個處理重復(fù)4 次，共12 盆。施用苯菌靈處理：于大豆出苗后的第7 天開始在盆栽土壤中均勻噴灑0.4 g/kg 苯菌靈溶液，每7 d 噴灑50 mL。土壤滅菌處理：將土壤放入高壓蒸汽滅菌鍋， 121 ℃ 高溫滅菌120 min，之后于常溫下放置7 d，備用。原狀土壤和土壤滅菌處理每7 d 噴灑蒸餾水50 mL。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 生長指標

種植4 個月后收獲大豆植株。收獲時，用直尺測定植株莖基部到主莖頂部的高度，即為株高。將大豆植株分為莖葉、根系和果實，用蒸餾水清洗，于105 ℃ 烘箱（101 型，北京市永光明儀器有限公司） 殺青30 min，然后在75 ℃ 下烘干至恒質(zhì)量，用萬分之一天平稱量，得到大豆植株莖葉、根系和果實的生物量。

1.3.2 光合色素含量

采用紫外分光光度法測定。取新鮮植物葉片0.2 g，加入80% 丙醇研磨至充分磨碎，用25 mL容量瓶過濾、定容；再用紫外分光光度計（Evolution201 紫外—可見光分光光度計，賽默飛世爾科技有限公司， 美國） 分別于波長663、 646 和470 nm處測定葉綠素a、葉綠素b 和類胡蘿卜素的吸光值（A），并計算葉綠素含量，計算公式為：

Ca= 12.21A663-2.81A646；

Cb= 20.13A646-5.03A663；

Cx= （1 000A470-3.27Ca-104Cb）=229；

CT=Ca+Cb。

式中：Ca 為葉綠素a 含量；Cb 為葉綠素b 含量；Cx 為類胡蘿卜素含量；CT 為葉綠素含量。

1.3.3 抗逆性指標

稱取大豆葉片鮮樣0.5 g，在預(yù)冷的研缽中將樣品研磨成勻漿， 采用0.9% 的生理鹽水（10 mL）將樣品勻漿轉(zhuǎn)移至離心管，于4 oC、12 000 r/min離心20 min，取上清液，置于冰上待測。采用分光光度法測定葉片可溶性蛋白、丙二醛（malondialdehyde，MDA） 和非蛋白巰基（non-protein sulfhydrylgroup，NP-SH） 的含量以及總抗氧化力（totalantioxidant capacity，T-AOC）。試驗所用試劑盒由南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。

1.3.4 重金屬含量和累積量

稱取經(jīng)烘干、粉碎、過0.25 mm 篩的大豆植株干樣0.5 g，用硝酸—高氯酸（體積比為4∶1）濕法消解，過濾后定容至50 mL 容量瓶中，采用火焰原子吸收分光光度法（北京普析通用TAS-990） 測定大豆植株各部位重金屬的濃度[14]，并計算重金屬含量及累積量。重金屬累積量=重金屬含量×生物量。

植物收獲后，采集植物根系周邊土壤，于室內(nèi)自然風干后過1 mm 篩，采用乙基三胺五乙酸—三乙醇胺（DTPA-TEA） 作為提取劑，提取土壤中有效態(tài)Pb、Zn、Cd、Cu 元素，再采用火焰原子吸收分光光度法測定土壤有效態(tài)重金屬的濃度[14]。

1.3.5 重金屬富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)

富集系數(shù)（enrichment coefficient，EC） 表示大豆植株對重金屬的吸收能力；轉(zhuǎn)移系數(shù)（transportcoefficient，TF） 表示重金屬在地上部分的占比。EC=大豆植株重金屬含量/土壤重金屬含量；TF=地上部重金屬含量/根系重金屬含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析

采用SPSS 25.0 的最小顯著性差異法（LSD）檢測數(shù)據(jù)在0.05 水平上的差異顯著性；采用OriginPro9.0 繪圖。數(shù)據(jù)采用4 次重復(fù)的平均值，表示為“平均值±標準差”。

2 結(jié)果與分析

2.1 對大豆株高和生物量的影響

由圖1 可知：與原狀土壤相比，土壤滅菌處理顯著降低了大豆的株高、莖葉和果實生物量（Plt;0.05），降幅分別為21.00%、43.92% 和44.47%，但顯著增加了根系生物量，增幅為56.57% （Plt;0.05）；而施用苯菌靈處理的大豆株高以及莖葉、果實和根系生物量與原狀土壤處理無顯著差異。

2.2 對大豆光合色素含量的影響

由圖2 可知：與原狀土壤相比，土壤滅菌和施用苯菌靈處理對大豆葉片葉綠素a 和葉綠素b含量無顯著影響；施用苯菌靈處理可顯著增加類胡蘿卜素含量，增幅為77.00%；土壤滅菌處理對類胡蘿卜素含量無顯著影響。

2.3 對大豆葉片部分抗氧化生理指標的影響

由圖3 可知：與原狀土壤相比，施用苯菌靈處理對大豆的可溶性蛋白、MDA 和NP-SH 含量以及T-AOC 無顯著影響；土壤滅菌處理可顯著增加NP-SH 含量，增幅為163.94%，但對可溶性蛋白和MDA 含量以及T-AOC 無顯著影響。

2.4 對大豆根際土壤有效態(tài)重金屬含量的影響

由圖4 可知：與原狀土壤相比，土壤滅菌和施用苯菌靈處理均可顯著增加大豆根際土壤中的有效態(tài)Pb 含量，增幅分別為160.62% 和179.00%；可顯著降低土壤中的有效態(tài)Zn 含量，降幅分別為33.82% 和17.37%；土壤中有效態(tài)Cd 和Cu 的含量分別為2.67～2.85 和29.25～37.63 mg/kg，且處理間無顯著差異。

2.5 對大豆重金屬含量和累積量的影響

由圖5 可知：與原狀土壤相比，土壤滅菌處理可顯著增加大豆莖葉中的Pb、 Zn 含量， 根系中的Zn、Cd 含量以及果實中的Pb、Cd 含量，增幅分別為10.24%、 42.44%， 74.00%、 190.43% 及14.76%、89.39%；可顯著降低大豆莖葉中的Cd含量、果實中的Cu 含量，降幅分別為38.02%和37.04%。施用苯菌靈可顯著增加莖葉和根系中的Pb 含量，增幅分別為36.87% 和12.43%。

由圖6 可知：與原狀土壤相比，土壤滅菌處理可顯著增加大豆植株根系中的Pb、Zn、Cd、Cu累積量，增幅分別為68.69%、167.93%、332.67%和42.83%；可顯著降低莖葉中的Pb、Cd、Cu 累積量以及果實中的Pb、Zn、Cu 累積量，降幅分別為38.38%、65.81%、49.40% 和36.60%、40.24%、65.00%。施用苯菌靈處理可顯著增加大豆莖葉中的Pb 累積量，增幅為28.63%；而對其他重金屬累積量無顯著影響。土壤滅菌條件下，植株對Pb、Zn、Cu 的總累積量分別下降21.07%、1.11% 和41.14%，對Cd 的總累積量增加18.43%；施用苯菌靈條件下，植株對Pb 和Zn 的總累積量有所增加，但對Cd 和Cu 的總累積量分別降低了14.35% 和9.11%。

2.6 大豆植株對重金屬的富集及轉(zhuǎn)運能力

由表1 可知：與原狀土壤相比，土壤滅菌處理下Pb、Zn 和Cd 的富集系數(shù)顯著升高，施用苯菌靈處理下Pb 的富集系數(shù)顯著升高；土壤滅菌處理下Cd 的轉(zhuǎn)運系數(shù)顯著降低，施用苯菌靈處理下Pb 的轉(zhuǎn)運系數(shù)顯著升高。

3 討論

3.1 土壤滅菌和施用苯菌靈對植物生長的影響

連續(xù)施用苯菌靈與高溫滅菌可部分或完全抑制土壤微生物對植物的侵染，土壤微生物的減少會影響土壤的理化性質(zhì)（氮、磷、鉀、pH 值、陽離子交換量等）[15]，而土壤的理化性質(zhì)（pH、電導(dǎo)率、土壤結(jié)構(gòu)、有機碳）[16]又會對植物生長產(chǎn)生影響。土壤高壓滅菌是在較高的溫度和氣壓下進行的，會影響土壤的理化性質(zhì)，進而影響植物生長。有研究發(fā)現(xiàn)：采用經(jīng)高壓滅菌法滅菌3 次的菜園土培養(yǎng)紫莖澤蘭，其株高和生物量明顯低于未滅菌的原狀土壤[17]。對于酸性或有機質(zhì)含量高的土壤而言，高溫滅菌對其pH 值的影響較大[18]。苯菌靈能夠有效抑制土壤中AMF 對植物的侵染，從而間接影響土壤對植株的養(yǎng)分供應(yīng)[19]。此外，殺真菌劑與高溫滅菌具有易操作、成效明顯等優(yōu)點，常被用于研究植物—土壤微生物的生態(tài)功能 [13]。本研究中，與原狀土壤相比，施用苯菌靈與土壤滅菌后大豆株高、莖葉生物量和果實生物量均降低，這是因為土壤微生物的減少可能會降低土壤速效氮、速效磷和速效鉀的含量，從而使大豆養(yǎng)分不足，影響其生長。研究表明：細菌定殖通常會促進營養(yǎng)吸收和增加植物生物量[20-21]，但重金屬干擾根系對鐵、磷、鎂、鈣、鋅等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和必需營養(yǎng)物質(zhì)的代謝功能，影響植物生長[22-25]。施用苯菌靈與土壤滅菌可顯著增加土壤有效態(tài)Pb 含量，這可能是因為在重金屬脅迫下，高溫滅菌和施用苯菌靈降低了土壤pH值，促使土壤中Pb 碳酸鹽結(jié)合態(tài)和鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)（生物有效性較低的形態(tài)） 向有效態(tài)（可交換態(tài)和水溶態(tài)） 轉(zhuǎn)化；但土壤有效態(tài)Cu、Cd 的含量無顯著變化，這可能是因為土壤pH 值的變化對其影響較??；而有效態(tài)Zn 含量顯著降低，這可能是土壤pH 值、陽離子交換量等多重作用的結(jié)果。

3.2 土壤滅菌和施用苯菌靈對植物重金屬耐性和重金屬累積的影響

本研究表明：與原狀土壤相比，土壤滅菌處理可顯著降低植物對重金屬的耐性，導(dǎo)致大豆株高和生物量下降，而施用苯菌靈對大豆的生長并沒有顯著影響，這表明土壤微生物對大豆耐受重金屬有重要作用。土壤微生物能夠改善植株的抗逆性，促進植物生長，是增強重金屬耐性的機制之一。有研究發(fā)現(xiàn)：重金屬通過產(chǎn)生活性氧使植物細胞受到氧化損傷，但植物通常具有保護自身免受氧化脅迫的機制[26]。也有研究表明：接種有益微生物可提高抗氧化酶的活性，進而幫助植物減輕重金屬的脅迫[27]。如木豆接種AMF 后，可顯著提高過氧化物酶、過氧化氫酶和過氧化物歧化酶的活性，對重金屬Cd 和Pb 的耐性也有所提高[28]。土壤微生物除了可以促進植物的營養(yǎng)吸收和生長外，還可以通過減少乙烯的產(chǎn)生來減輕重金屬脅迫 [29]。某些抗重金屬植物通過促生細菌固氮、礦物質(zhì)溶解、植物激素、鐵載體的產(chǎn)生以及營養(yǎng)元素的轉(zhuǎn)化等多種機制促進寄主植物生長[30-31]，如：在缺磷條件下，用解淀粉芽孢桿菌FZB45 接種玉米，可顯著促進其幼苗生長，這可能是由于FZB45 能產(chǎn)生植酸酶，促進植物吸收植酸磷[32]，增強了植物對重金屬的耐性。

土壤微生物通過影響植物的生長和生理，進而影響植物對重金屬的吸收與累積。本研究中，減少土壤微生物可降低大豆莖葉和果實的生物量，但可增加根系生物量，間接說明土壤微生物通過改變大豆的生物量來改變其重金屬累積量。PETRICCIONE 等[33]研究發(fā)現(xiàn)：接種熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens） 后，除了能提高紫茉莉（Mirabilis jalapa） 植株的生物量外，還能顯著增加其根系對Cd、Cu 等重金屬的累積；而土壤滅菌后，紫花苜蓿（Medicago sativa） 的生物量顯著降低，其對Pb、Zn、Cd、Cu 的累積量顯著減少[34]。

此外，土壤微生物還可以通過酸化、絡(luò)合、氧化還原等反應(yīng)來改變重金屬的生物有效性，從而改變植物對重金屬的吸收累積[6， 35]。本研究發(fā)現(xiàn)：土壤滅菌和施用苯菌靈處理可顯著增加土壤有效態(tài)Pb 含量，顯著降低有效態(tài)Zn 含量，有效態(tài)Cd、Cu 含量則無顯著變化。這一方面可能與重金屬自身的化學(xué)特性和土壤環(huán)境化學(xué)行為差異有關(guān)；另一方面可能在于AMF 可通過菌絲體吸附重金屬，細胞壁及原生質(zhì)膜等組分結(jié)合滯留固定重金屬[36-37]，從而抑制重金屬從根系向地上部分轉(zhuǎn)移，降低了土壤中重金屬的生物有效性。

4 結(jié)論

土壤滅菌可顯著降低大豆株高、莖葉和果實生物量，并降低大豆對重金屬Pb、Zn、Cd 和Cu 的耐性與累積能力，抑制其生長；施用苯菌靈對大豆生長和重金屬總累積量均無顯著影響，間接驗證了土壤微生物對大豆耐重金屬和累積能力具有重要作用。因此，采用豆科植物修復(fù)重金屬污染土壤時，應(yīng)考慮土壤微生物的有益作用，提高植物修復(fù)的效率。

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責任編輯：何謦成

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（42177381，42267002）；云南省吳龍華專家工作站（202305AF150042）。