基于PCR—DGGE的間作油茶林土壤細(xì)菌多樣性

文亞雄??+劉君昂??+劉小平??+周國(guó)英??

摘要：土壤微生物多樣性是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)，為探究林農(nóng)間作對(duì)油茶林土壤微生物多樣性的影響，采用PCR-DGGE方法研究了油茶林間作大豆、間作花生2種間作模式不同時(shí)期對(duì)油茶林土壤細(xì)菌多樣性的影響。結(jié)果表明：間作處理各時(shí)期的土壤微生物種群相似性、微生物多樣性指數(shù)均高于對(duì)照處理；間作處理微生物多樣性指數(shù)保持在3.2～3.4之間；間作處理各時(shí)期土壤微生物均勻度指數(shù)為0.960～0.982；各處理的微生物種群相似性、微生物多樣性指數(shù)與季節(jié)變化相關(guān)。

關(guān)鍵詞：油茶林；林農(nóng)間作；土壤微生物；多樣性

中圖分類號(hào)： S154.38+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：

文章編號(hào)：1002-1302（2016）08-0057-03

林農(nóng)間作是指將多年生木本植物通過(guò)空間或時(shí)間布局與農(nóng)作物合理安排在同一土地經(jīng)營(yíng)單位內(nèi)，使其中各組分在生態(tài)和經(jīng)濟(jì)上具有相互作用[1]。研究表明，間作能顯著提高土壤微生物的生物量[2]，改變土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，提高土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)多樣性[3-4]，對(duì)土壤有機(jī)質(zhì)的分解、腐殖質(zhì)的形成、養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化與循環(huán)等過(guò)程[5]也有促進(jìn)作用。間作豆科植物還能通過(guò)生物固氮提高土壤氮素水平、增加產(chǎn)量[6-7]。目前，關(guān)于林農(nóng)間作的研究大多關(guān)于間作系統(tǒng)中的物理因素，如間作對(duì)林下小環(huán)境中光、熱、水[8-9]、土壤養(yǎng)分[10]的影響，而關(guān)于間作體系中土壤微生物多樣性的研究較少，對(duì)油茶林土壤微生物多樣性的研究未見(jiàn)報(bào)道。

油茶是世界四大木本油料植物之一，是我國(guó)特有的木本油料植物，廣泛分布于我國(guó)南方地區(qū)[11]。近年來(lái)，隨著市場(chǎng)需求的發(fā)展及國(guó)家對(duì)油茶產(chǎn)業(yè)的支持，油茶逐漸成為我國(guó)南方地區(qū)的一種重要經(jīng)濟(jì)作物。

通過(guò)對(duì)間作大豆、花生油茶林根區(qū)（距植物根系0～20 cm）土壤微生物多樣性進(jìn)行對(duì)比研究，探討間作大豆、花生對(duì)油茶根區(qū)土壤微生物多樣性的影響，以期為提高油茶林間套作生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)效益提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于江西省宜春市袁州區(qū)西村鎮(zhèn)（27°44′9.83″N，114°11′24.32″E）油茶基地進(jìn)行，該地屬于中亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)，具有四季分明、熱量豐富、降水充沛、日照充足、霜期短、氣候資源豐富等特點(diǎn)，有利于農(nóng)作物和林木生長(zhǎng)。試驗(yàn)地的年均日照時(shí)數(shù)約為1 737.1 h，年均氣溫為16.2～17.7 ℃，年均降水量約為1 624.9 mm，日均溫度≥10 ℃的活動(dòng)積溫為 5 050～5 644 ℃。試驗(yàn)地土壤為紅壤，地力均勻，便于排灌。

試驗(yàn)處理包括間作花生、間作大豆、無(wú)處理對(duì)照。試驗(yàn)用油茶林為4年生油茶幼林，株行距為2 m×3 m，長(zhǎng)勢(shì)良好。

處理1：于造林后1年開(kāi)始每年間種大豆，本研究中于2014年4月底間種，于同年7月收獲，收獲后將大豆苗覆于樣地。處理2：于造林后1年開(kāi)始每年間種花生，本研究中于2014年5月間種，于同年8月收獲，收獲后將花生苗覆于樣地。CK處理：選取1塊純林樣地作為無(wú)處理對(duì)照。

1.2林間取樣

本研究分別采集間作花生油茶林、間作大豆油茶林、對(duì)照純林間作植物收獲時(shí)及收獲后的土壤樣品，間作大豆、間作花生處理第1次采樣時(shí)間分別為7、8月，收獲后第2次采樣時(shí)間分別為8、10月。每個(gè)處理在樣地內(nèi)以對(duì)角線法選取5株油茶，采集油茶根區(qū)（距油茶根系0～20 cm）表層0～20 cm土壤樣品，采集后混合。

將林間取得的土樣放入冰盒保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后迅速過(guò)2 mm土篩，除去雜物。將過(guò)篩土樣于-20 ℃下保存，用于土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究。

1.3.3土壤微生物多樣性的DGGE圖譜分析

使用Bio-Rad DCode Universal Mutation Detection System電泳系統(tǒng)進(jìn)行DGGE分析。采用濃度為8%的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度梯度為45%～65%（100%變性濃度為100 mL聚丙烯酰胺凝膠中加入40 mL去離子甲酰胺與42 g尿素），每孔加樣為25 μL PCR產(chǎn)物、5 μL 6×loading buffer，于60 ℃恒溫條件下[JP3]在1×TAE緩沖液中100 V電泳10 h。電泳完成后銀染照相。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用Quantity one軟件識(shí)別PCR-DGGE圖譜中的泳道及條帶，得出量化圖及相應(yīng)數(shù)據(jù)，進(jìn)行數(shù)學(xué)未成對(duì)加權(quán)聚類分析（UPGMA），計(jì)算物種均勻度、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)。Shannon-Wiener指數(shù)（H）、均勻度（E）的計(jì)算公式為：

[HS+7mm][JZ]H=-∑[DD（]s[]i=1[DD）]PilnPi；E=H/lnS。

式中：Pi為第i條條帶的優(yōu)勢(shì)度，S為樣本的總條帶數(shù)[12]。

2結(jié)果與分析

2.1PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測(cè)

所有樣品最終PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果（圖1）顯示，該P(yáng)CR方法能較好地?cái)U(kuò)增目標(biāo)片段，目標(biāo)片段長(zhǎng)度約為200 bp，無(wú)非特異性擴(kuò)增及引物二聚體，可用于后續(xù)DGGE分析。

2.2DGGE圖譜分析

對(duì)不同間作模式油茶林土壤微生物的16S rDNA V3可變區(qū)進(jìn)行DGGE圖譜分析，結(jié)果（圖2-a）表明，各DGGE泳道內(nèi)條帶被較好地分離，不同間作模式土壤微生物DNA條帶表現(xiàn)出不同的指紋圖譜及灰度，不同樣品的細(xì)菌群落表現(xiàn)出一定差別。由DGGE結(jié)果量化圖（圖2-b）可知，不同樣本的條帶分別與同批次樣本間有較多相同，表明相同樣地內(nèi)具有較多的共有微生物種群。該類微生物應(yīng)是土壤中的常見(jiàn)微生物種群，在土壤中的生長(zhǎng)繁殖較為穩(wěn)定，但該類微生物DNA條帶灰度不盡相同，表明間作處理對(duì)土壤微生物的數(shù)量也有一定影響。間作處理的條帶數(shù)量基本多于對(duì)照處理，表明間作處理增加了土壤中微生物的種群數(shù)量。 [FL）]

[FL（2K2]2.3DGGE圖譜聚類分析

以非加權(quán)算術(shù)平均法（UPGMA）對(duì)不同間作模式油茶林土壤細(xì)菌DNA的DGGE指紋圖譜進(jìn)行聚類分析。結(jié)果（圖3）表明，季節(jié)變化對(duì)土壤微生物多樣性的影響較大，不同季節(jié)各處理間的相似性均低于0.60，相似性水平較低。間作花生與間作大豆處理的相似性較高，第1、2次采樣的相似性均為0.48，第3次采樣的相似性為0.39，表明間作花生與間作大豆對(duì)土壤微生物多樣性的影響具有一定相似性。在3個(gè)不[JP3]同采樣時(shí)間之間，間作處理的相似性均聚于0.39，高于對(duì)照處理間的相似性，表明間作處理能提高土壤微生物種群的穩(wěn)定性。

2.4土壤微生物多樣性指數(shù)分析

根據(jù)由Quantity one軟件得出的不同條帶光密度峰值，運(yùn)用Shannon-Wiener指數(shù)公式，計(jì)算得出不同間作處理土壤微生物多樣性指數(shù)。由圖4、圖5可知，間作處理的土壤微生物多樣性指數(shù)基本高于對(duì)照處理，其中間作花生處理第1次采[CM（25]樣的多樣性指數(shù)最高，達(dá)3.463；各處理的多樣性指數(shù)與季[CM）]

節(jié)變化相關(guān)，由春季向冬季逐漸降低。間作處理第1次采樣的多樣性指數(shù)與對(duì)照處理相近，均處于3.3～3.5之間；間作處理第2、3次采樣的多樣性指數(shù)略有降低，但仍處于3.1以上，而對(duì)照處理下降較多，降至3.0以下，間作處理在后期對(duì)土壤微生物多樣性的影響較大。間作處理的微生物群落均勻度變化較大，表明間作植物處理對(duì)油茶林土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響較大。間作花生處理各時(shí)期的多樣性指數(shù)均高于間作大豆處理，表明間作花生對(duì)土壤微生物多樣性的影響較大。

3結(jié)論與討論

土壤微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)的主要組成部分，對(duì)土壤肥力、酶活性[13]、土壤結(jié)構(gòu)等有著重要影響。合理的間作可有效改善土壤微生態(tài)環(huán)境，提高土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)多樣性，并對(duì)土壤理化性質(zhì)產(chǎn)生影響。陳永忠等、王瑞等研究表明，間作能提高油茶林土壤養(yǎng)分及微生物數(shù)量[14-15]。張向前等在研究玉米與花生、大豆間作時(shí)發(fā)現(xiàn)，間作能顯著提高土壤中的微生物數(shù)量，且微生物數(shù)量與土壤中酶活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系[16]。本研究結(jié)果表明，不同間作處理均能提高土壤微生物種群多樣性，對(duì)土壤微生物數(shù)量也有一定影響。

王玉娟等研究表明，稻草覆蓋能有效調(diào)節(jié)土壤溫度，具有高溫季節(jié)降溫、低溫季節(jié)增溫的效果，并能改善土壤理化性質(zhì)[17-18]。徐華勤等研究發(fā)現(xiàn)，稻草覆蓋與間作三葉草處理均可提高土壤微生物的活性與豐富度[19]。在本研究間作豆科植物處理中，豆科植物收獲后將植物殘?bào)w覆蓋于林間土地，不僅起到了夏季降溫、冬季保溫的作用，且隨著植物殘?bào)w的分解，較多的有機(jī)質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)元素流入土壤中，為微生物的生長(zhǎng)繁殖提供了有利條件，使間作豆科植物處理的微生物種群相似性及微生物多樣性指數(shù)始終保持在較高水平。另外，間作植物本身伸展的枝葉也覆蓋了地面，可起到降溫作用。

隨著微生物多樣性水平及種群數(shù)量的提高，油茶林土壤肥力也受到了影響。賈倩民等研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌及放線菌數(shù)量與土壤有機(jī)質(zhì)、全氮、全磷、速效氮、速效磷含量呈顯著或極顯著正相關(guān)，真菌數(shù)量與土壤全鉀、速效磷、速效鉀含量呈極顯著正相關(guān)[20]。邵英男等認(rèn)為，N、P含量及土壤pH值與細(xì)菌和放線菌的數(shù)量呈顯著正相關(guān)[21]。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，間作花生并于花生收獲后將花生秸稈覆蓋于林下土地的林農(nóng)復(fù)合經(jīng)營(yíng)模式，對(duì)調(diào)控油茶林土壤微生物多樣性具有較為積極的作用，同時(shí)對(duì)油茶林土壤肥力具有較好的影響，可在一定程度上促進(jìn)油茶幼林的生長(zhǎng)。

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