GRHL2在子癇前期患者胎盤中的表達(dá)及對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、侵襲的影響

［摘 要］目的 探討粒狀頭樣2基因（GRHL2）在子癇前期（PE）患者胎盤中的表達(dá)及對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、侵襲的影響。方法 收集2022年1月至6月期間在陜西省人民醫(yī)院進(jìn)行剖宮產(chǎn)分娩的32例PE患者的胎盤組織（PE組），同時(shí)收集同期在本院進(jìn)行剖宮產(chǎn)分娩的32例正常妊娠產(chǎn)婦的胎盤組織（對(duì)照組），Western blot檢測(cè)胎盤組織中GRHL2蛋白表達(dá)；將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo分為空白組、GRHL2小干擾RNA陰性對(duì)照（si-NC）組、GRHL2小干擾RNA（si-GRHL2）組、GRHL2過表達(dá)質(zhì)粒陰性對(duì)照（pcDNA）組、GRHL2過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-GRHL2）組，CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HTR-8/Svneo細(xì)胞OD450值、克隆形成率；Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HTR-8/Svneo細(xì)胞侵襲；Western blot檢測(cè)HTR-8/Svneo細(xì)胞中GRHL2、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、磷酸化磷脂酰肌醇3激酶（p-PI3K）、磷酸化絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（p-Akt）蛋白表達(dá)。結(jié)果 PE組患者胎盤組織中GRHL2蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=57.240，P＜0.05）；與空白組、si-NC組比較，si-GRHL2組HTR-8/Svneo細(xì)胞中GRHL2蛋白表達(dá)降低，OD450值、克隆形成率、侵襲細(xì)胞數(shù)、PCNA、MMP-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)升高（t值介于5.477～24.595之間，P＜0.05）；與空白組、pcDNA組比較，pcDNA-GRHL2組HTR-8/Svneo細(xì)胞中GRHL2蛋白表達(dá)升高，OD450值、克隆形成率、侵襲細(xì)胞數(shù)、PCNA、MMP-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)降低（t值介于9.295～24.239之間，P＜0.05）。結(jié)論 GRHL2在PE患者胎盤組織中高表達(dá)，沉默GRHL2可促進(jìn)HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖與侵襲，而過表達(dá)GRHL2可抑制HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖與侵襲，其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/Akt通路有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］粒狀頭樣2基因；子癇前期；胎盤；增殖；侵襲

Doi：10.3969/j.issn.1673-5293.2024.09.002

［中圖分類號(hào)］R173""" ［文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼］A

［文章編號(hào)］1673-5293（2024）09-0007-07

Expression of GRHL2 in the placenta of preeclampsia patients and its impacts

on proliferation and invasion of trophoblast cells

［Abstract］ Objective To investigate the expression of the grainyhead-like 2 （GRHL2） gene in the placenta of preeclampsia （PE） patients and its impacts on the proliferation and invasion of trophoblast cells. Methods Placental tissues were collected from 32 PE patients who underwent cesarean section at Shaanxi Provincial Peoples Hospital from January to June 2022 （PE group）.Placental tissues were also collected from 32 normal pregnant women who underwent cesarean section during the same period at the same hospital （control group）.Western blot was used to detect the expression of GRHL2 protein in placental tissues.Human chorionic trophoblast cells HTR-8/Svneo in the logarithmic growth phase were divided into the blank group，GRHL2 small interfering RNA negative control （si-NC） group，GRHL2 small interfering RNA （si-GRHL2） group，GRHL2 overexpression plasmid negative control （pcDNA） group，and GRHL2 overexpression plasmid （pcDNA-GRHL2） group.CCK-8 and colony formation assays were used to detect the OD450 value and colony formation rate of HTR-8/Svneo cells.Transwell assay was used to detect HTR-8/Svneo cell invasion.Western blot was used to detect the expression of GRHL2，proliferating cell nuclear antigen （PCNA），matrix metalloproteinase （MMP）-2，phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase （p-PI3K），and phosphorylated serine/threonine-protein kinase （p-Akt） proteins in HTR-8/Svneo cells. Results The expression level of GRHL2 protein in the placental tissues of the PE group was significantly higher than that in the control group （t=57.240，P＜0.05）.Compared with the blank group and si-NC group，the expression of GRHL2 protein in HTR-8/Svneo cells of the si-GRHL2 group was decreased，while the OD450 value，colony formation rate，number of invasive cells，and the expression levels of PCNA，MMP-2，p-PI3K，and p-Akt proteins were increased （t value ranged from 5.477 to 24.595，P＜0.05）.Compared with the blank group and pcDNA group，the expression of GRHL2 protein in HTR-8/Svneo cells of the pcDNA-GRHL2 group was increased，while the OD450 value，colony formation rate，number of invasive cells，and the expression levels of PCNA，MMP-2，p-PI3K，and p-Akt proteins were decreased （t values ranged from 9.295 to 24.239，P＜0.05）. Conclusion GRHL2 is highly expressed in the placental tissues of PE patients.Silencing GRHL2 can promote the proliferation and invasion of HTR-8/Svneo cells，while overexpressing of GRHL2 can inhibit the proliferation and invasion of HTR-8/Svneo cells.The mechanism may be related to the regulation of the PI3K/Akt pathway.

［Key words］ grainyhead-like 2;preeclampsia;placenta;proliferation;invasion

子癇前期（preeclampsia，PE）是一種伴有高血壓和蛋白尿的多系統(tǒng)血管綜合征，通常在妊娠20周后可觀察到［1-2］。全世界PE的發(fā)病率約為2%～8%，它是孕婦及其胎兒死亡和發(fā)病的主要原因［3］。盡管醫(yī)學(xué)取得了重大進(jìn)展，但娩出胎兒和胎盤仍然是唯一已知的治療PE的方法［4］。多項(xiàng)研究提示了PE發(fā)病的可能理論：滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和侵襲受抑是PE的主要誘因［5］；滋養(yǎng)層侵襲性降低導(dǎo)致蛻膜螺旋動(dòng)脈重塑失敗，母體供氧不足，導(dǎo)致抗血管生成因子釋放，最終引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和全身炎癥，誘發(fā)PE［6］。盡管關(guān)于PE的研究有很多，但與PE發(fā)病機(jī)制相關(guān)的潛在機(jī)制仍有待探索。粒狀頭樣2基因（grainyhead-like 2，GRHL2）是在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的GRHL轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其可調(diào)控許多生物過程，包括細(xì)胞上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移等［7］。已有研究顯示，PE患者胎盤組織中GRHL2水平顯著上調(diào)，且可影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖與侵襲［8］，但具體機(jī)制尚不明確。相關(guān)研究顯示，干擾GRHL2基因表達(dá)可通過調(diào)控磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine protein-kinase，Akt）通路進(jìn)而調(diào)控腎癌細(xì)胞的增殖和遷移行為［9］。但GRHL2對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、侵襲的影響是否與調(diào)控PI3K/Akt通路有關(guān)尚不可知。因此，本研究主要探究GRHL2對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、侵襲的影響及其可能的機(jī)制。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2022年1月至6月期間在陜西省人民醫(yī)院進(jìn)行剖宮產(chǎn)分娩的32例PE患者的胎盤組織，并命名為PE組；同時(shí)收集同期在本院進(jìn)行剖宮產(chǎn)分娩的32例正常妊娠產(chǎn)婦的胎盤組織，并命名為對(duì)照組。所有組織立即凍存于-80℃中。該研究得到本院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（審批號(hào)：SX20220178），所有患者均簽署了知情同意書。

1.2主要試劑及儀器

人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo購(gòu)自上海弘順生物科技有限公司。GRHL2小干擾RNA（si-GRHL2）及其陰性對(duì)照（si-NC）、GRHL2過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-GRHL2）及其陰性對(duì)照（pcDNA）均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司；兔源一抗GRHL2、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix matalloprotein-ases，MMP）-2、p-PI3K、p-Akt、PI3K、Akt、GAPDH及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。CB 60型CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自上海錫為科學(xué)儀器有限公司；SAF-680T型酶標(biāo)儀購(gòu)自上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司；CKX53型光學(xué)顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司；DYCZ24DN型蛋白電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)與分組

將HTR-8/Svneo細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HTR-8/Svneo細(xì)胞，分為空白組（正常培養(yǎng)的HTR-8/Svneo細(xì)胞）、si-NC組（轉(zhuǎn)染si-NC）、si-GRHL2組（轉(zhuǎn)染si-GRHL2）、pcDNA組（轉(zhuǎn)染pcDNA）、pcDNA-GRHL2組（轉(zhuǎn)染pcDNA-GRHL2），轉(zhuǎn)染48h后，收集各組細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 CCK-8法檢測(cè)HTR-8/Svneo細(xì)胞OD450值

以10 000個(gè)/孔的密度將HTR-8/Svneo細(xì)胞接種于96孔板中，按照1.3所述分組進(jìn)行對(duì)應(yīng)處理后，向各孔中加入10μL CCK8溶液，在37℃中孵育1h后利用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔450nm處的吸光度，吸光度越大表明細(xì)胞增殖能力越強(qiáng)。

1.5克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HTR-8/Svneo細(xì)胞克隆形成率

將HTR-8/Svneo細(xì)胞（500個(gè)）接種于6cm細(xì)胞培養(yǎng)板中，并在含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d。然后，除去培養(yǎng)液，將HTR-8/Svneo細(xì)胞用甲醇固定、0.1%結(jié)晶紫染色，觀察克隆形成情況?？寺⌒纬陕剩?）=（形成克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HTR-8/Svneo細(xì)胞侵襲

將1.3中的各組HTR-8/Svneo細(xì)胞（2×105個(gè)）懸浮在200μL無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，再將細(xì)胞懸液加入預(yù)先涂覆有基質(zhì)膠的Transwell上室中，然后向下室中加入500μL含20%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基。孵育24h后，用4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色侵襲的細(xì)胞，利用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞侵襲情況。

1.7 Western blot檢測(cè)HTR-8/Svneo細(xì)胞中GRHL2、PCNA、MMP-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)

利用RIPA緩沖液裂解并提取胎盤組織勻漿及HTR-8/Svneo細(xì)胞樣品總蛋白。2，2-聯(lián)喹啉-4，4-二甲酸二鈉法進(jìn)行蛋白定量后，取40μg蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺進(jìn)行凝膠電泳，將電泳分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，并用5%脫脂牛奶封閉膜1h后，在4℃下將膜與一抗GRHL2（1∶4 000）、PCNA（1∶3 000）、MMP-2（1∶5 000）、p-PI3K（1∶4 000）、PI3K（1∶4 000）、p-Akt（1∶4 000）、Akt（1∶4 000）、GAPDH（1∶5 000）孵育過夜，再與二抗（1∶4 000）在常溫下孵育2h。加入ECL試劑觀察蛋白印跡，利用Image J軟件分析目的蛋白條帶灰度值。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

利用SPSS 29.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有符合正態(tài)分布和方差齊性的計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，t檢驗(yàn)用于兩組間的差異比較，單因素方差分析用于多組間的差異比較，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 GRHL2在胎盤組織中的表達(dá)比較

32例PE組患者胎盤組織中GRHL2蛋白平均表達(dá)水平為（1.56±0.13），32例對(duì)照組為（0.21±0.03），PE組高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=57.240，P＜0.05），見圖1。

2.2沉默GRHL2或過表達(dá)GRHL2對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞中GRHL2蛋白表達(dá)變化的影響

與空白組、si-NC組比較，si-GRHL2組HTR-8/Svneo細(xì)胞中GRHL2蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為24.595、21.875，P＜0.05）；與空白組、pcDNA組比較，pcDNA-GRHL2組HTR-8/Svneo細(xì)胞中GRHL2蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為12.989、13.145，P＜0.05），見圖2和表1。

2.3沉默GRHL2或過表達(dá)GRHL2對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞OD450值及克隆形成率的影響

與空白組、si-NC組比較，si-GRHL2組HTR-8/Svneo細(xì)胞OD450值及克隆形成率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值介于5.477～13.950之間，P＜0.05）；與空白組、pcDNA組比較，pcDNA-GRHL2組HTR-8/Svneo細(xì)胞OD450值及克隆形成率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值介于10.954～18.424之間，P＜0.05），見表2和圖3。

2.4沉默GRHL2或過表達(dá)GRHL2對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞侵襲的影響

與空白組、si-NC組比較，si-GRHL2組HTR-8/Svneo細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為17.212、17.443，P＜0.05）；與空白組、pcDNA組比較，pcDNA-GRHL2組HTR-8/Svneo細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值分別為23.702、24.239，P＜0.05），見表3和圖4。

2.5沉默GRHL2或過表達(dá)GRHL2對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞中PCNA、MMP-2及PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與空白組、si-NC組比較，si-GRHL2組HTR-8/Svneo細(xì)胞中PCNA、MMP-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值介于13.327～18.075之間，P＜0.05）；與空白組、pcDNA組比較，pcDNA-GRHL2組HTR-8/Svneo細(xì)胞中PCNA、MMP-2、p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t值介于9.295～20.469之間，P＜0.05），見表4和圖5。

3討論

3.1 PE研究現(xiàn)狀

PE是妊娠的常見并發(fā)癥，威脅母嬰健康［10］。目前，胎盤分娩是PE的唯一根治性解決方案，而降壓藥僅對(duì)病情穩(wěn)定的患者有效。如果患者沒有得到適當(dāng)或及時(shí)的治療，可能會(huì)發(fā)生子癇或致命并發(fā)癥，包括中風(fēng)和肺水腫等［11］。許多研究報(bào)道，胎盤基因表達(dá)異?？蓪?dǎo)致子宮螺旋動(dòng)脈重塑障礙，并調(diào)節(jié)PE的發(fā)生和發(fā)展［12］。因此，開發(fā)新的用于治療PE的分子標(biāo)志物具有重要意義。

3.2 GRHL2可影響人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo增殖與侵襲

GRHL2是上皮組織發(fā)育和功能的重要轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)控細(xì)胞增殖、侵襲等生物學(xué)行為［13］。據(jù)報(bào)道，沉默GRHL2可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移與侵襲［14］；GRHL2在PE患者胎盤中過表達(dá)，下調(diào)GRHL2可促進(jìn)滋養(yǎng)層細(xì)胞遷移［15］；GRHL2可通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程促進(jìn)PE的發(fā)生［16］。本研究亦顯示，PE組患者胎盤組織中GRHL2蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組，與空白組、si-NC組比較，si-GRHL2組HTR-8/Svneo細(xì)胞OD450值、克隆形成率、侵襲細(xì)胞數(shù)升高；與空白組、pcDNA組比較，pcDNA-GRHL2組HTR-8/Svneo細(xì)胞OD450值、克隆形成率、侵襲細(xì)胞數(shù)降低，表明GRHL2蛋白在PE患者胎盤組織中高表達(dá)，沉默GRHL2可促進(jìn)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR-8/Svneo增殖與侵襲，而過表達(dá)GRHL2則呈相反趨勢(shì)。PCNA作為支架蛋白在DNA復(fù)制和修復(fù)中發(fā)揮重要作用［17］；MMP-2是細(xì)胞侵襲的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［18］。檢測(cè)PCNA、MMP-2蛋白表達(dá)水平可從蛋白質(zhì)水平上衡量HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖、侵襲能力。本研究顯示，沉默GRHL2可促進(jìn)HTR-8/Svneo細(xì)胞中PCNA、MMP-2蛋白表達(dá)，而過表達(dá)GRHL2可抑制HTR-8/Svneo細(xì)胞中PCNA、MMP-2蛋白表達(dá)，再次從蛋白質(zhì)水平上證實(shí)了GRHL2對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖、侵襲的調(diào)控作用，提示GRHL2可能成為治療PE的潛在有效靶點(diǎn)。此外，有研究報(bào)道，GRHL2通過抑制PI3K/Akt通路抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖［19］；GRHL2通過抑制TGFβ信號(hào)通路抑制胃癌細(xì)胞中MMP-2蛋白表達(dá)進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞侵襲［20］。以上研究表明GRHL2可通過調(diào)控通路影響PCNA、MMP-2蛋白表達(dá)進(jìn)而影響細(xì)胞的生物學(xué)行為。但GRHL2具體通過哪些通路影響PCNA、MMP-2蛋白表達(dá)進(jìn)而影響HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖、侵襲，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定。

3.3 GRHL2調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路影響HTR-8/Svneo增殖與侵襲

PI3K/Akt通路是許多細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)因子，包括增殖、侵襲、代謝［21］。最近，越來(lái)越多的證據(jù)表明PI3K/Akt信號(hào)通路與PE的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。如激活PI3K/Akt信號(hào)通路可促進(jìn)HTR8/Svneo細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程［22］；激活PI3K/Akt信號(hào)通路可增強(qiáng)滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力，以預(yù)防PE［23］；抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖，遷移和侵襲能力［24］；抑制PI3K/Akt信號(hào)通路可抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，從而參與PE的發(fā)生發(fā)展［25］。本研究顯示，與空白組、si-NC組比較，si-GRHL2組HTR-8/Svneo細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)升高，與空白組、pcDNA組比較，pcDNA-GRHL2組HTR-8/Svneo細(xì)胞中p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)降低，表明沉默GRHL2可激活HTR-8/Svneo細(xì)胞中的PI3K/Akt信號(hào)通路，而過表達(dá)GRHL2可抑制HTR-8/Svneo細(xì)胞中的PI3K/Akt信號(hào)通路，提示GRHL2對(duì)HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖、侵襲的促進(jìn)作用可能與調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。未進(jìn)一步設(shè)置PI3K/Akt信號(hào)通路激活劑或抑制劑來(lái)驗(yàn)證GRHL2是否真正通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路影響HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖、侵襲過程是本研究的不足之一，后期將會(huì)深入探究。

綜上所述，GRHL2在PE患者胎盤組織中高表達(dá)，沉默GRHL2可促進(jìn)HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖與侵襲，而過表達(dá)GRHL2可抑制HTR-8/Svneo細(xì)胞增殖與侵襲，其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/Akt通路有關(guān)。該研究可能為PE的臨床治療提供新的思路，未對(duì)作用機(jī)制進(jìn)行深入探討是本研究的缺陷之一，后期將繼續(xù)研究。

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