小反芻獸疫LAMP 反應(yīng)結(jié)果可視化檢測(cè)方法比較研究

摘 要：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是一種可應(yīng)用于各種病原體檢測(cè)、基因分型等領(lǐng)域的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)所需設(shè)備簡(jiǎn)單且易于操作，因此具有較大的發(fā)展?jié)摿?。根?jù)目前已經(jīng)存在的判定LAMP結(jié)果的可視化方法，以可能對(duì)野生小反芻動(dòng)物造成威脅的小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminantsvirus，PPRV）cDNA為檢測(cè)對(duì)象，選擇合適的引物組，比較評(píng)估均可在日光或紫外光下區(qū)分陰陽性結(jié)果的SYBR Green I、SYBR Safe Stain 和羥基萘酚藍(lán)（hydroxynaphthol blue，HNB）3種指示劑方法的適用性與靈敏度。結(jié)果表明：3種方法的靈敏度都很高，均與瓊脂糖凝膠電泳相當(dāng)。其中，SYBR Green I結(jié)果區(qū)分度高、不受體系成分影響且無須額外設(shè)備，但成本較高；SYBR Safe Stain具有良好的結(jié)果區(qū)分度，成本相對(duì)較低，但需要額外的紫外照射設(shè)備；HNB成本最低，但顏色區(qū)分度較低，且易受多種因素影響。建議在選擇LAMP指示劑時(shí)，綜合考慮成本、使用便利性、結(jié)果準(zhǔn)確性及實(shí)驗(yàn)條件，通過充分的體系優(yōu)化和驗(yàn)證，確保LAMP檢測(cè)的準(zhǔn)確性和可靠性。研究結(jié)果突顯了不同方法的特征和適用場(chǎng)景，為研究人員根據(jù)不同場(chǎng)所與條件選擇高效、便捷的LAMP反應(yīng)結(jié)果可視化方法提供參考。

關(guān)鍵詞：環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增；SYBR Green I；SYBR Safe Stain；羥基萘酚藍(lán)；小反芻獸疫病毒

中圖分類號(hào)：S855. 3

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2310 - 1490（2024）- 03 - 0664 - 06

DOI：10.12375/ysdwxb.20240324

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)是由Notomi等于2000年研發(fā)的一種新型恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)［1］，其作為一種新興的核酸擴(kuò)增技術(shù)，可在等溫條件下實(shí)現(xiàn)目的產(chǎn)物的擴(kuò)增，因而備受關(guān)注。該技術(shù)利用兩對(duì)引物，在bst 聚合酶的作用下首先形成具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的啞鈴狀產(chǎn)物，其后內(nèi)引物再次結(jié)合莖環(huán)結(jié)構(gòu)上的部分單鏈，同時(shí)模板鏈延伸并剝離新形成的單鏈，該過程多次重復(fù)最終得到長(zhǎng)度不等的花菜樣的結(jié)構(gòu)產(chǎn)物，目前已經(jīng)應(yīng)用于各種病原體檢測(cè)［2?3］、基因分型［4］等領(lǐng)域，由于這種技術(shù)不需要復(fù)雜昂貴的熱循環(huán)儀，并且可以在較短的時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量擴(kuò)增產(chǎn)物，因此在野外檢測(cè)與基層檢測(cè)領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的發(fā)展?jié)摿?。為了進(jìn)一步提高LAMP檢測(cè)的實(shí)用性，研究人員開發(fā)了不同類型的結(jié)果判定方法，旨在實(shí)現(xiàn)更為靈敏、特異和便捷的結(jié)果判定，如基于DNA染料結(jié)合核酸時(shí)被激發(fā)出強(qiáng)烈熒光原理的嵌合染料法，基于金屬離子濃度變化的金屬離子指示劑法［5］和基于pH 變化的pH指示劑顯色法［6］等。

小反芻獸疫（peste des petits ruminants，PPR）是一種由副黏病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒屬（Morbillivirus）的小反芻獸疫病毒（Peste des petits ruminantsvirus，PPRV）引起的烈性病毒性傳染?。?］，目前發(fā)現(xiàn)該病的野生宿主有巖羊（Pseudois nayaur）、盤羊（Ovis ammon）和蒙古賽加羚羊（Saiga tatarica mon?golica）等［8?10］，傳染性與致死率極高，嚴(yán)重威脅畜牧業(yè)發(fā)展與野生動(dòng)物安全［11］。一種快速簡(jiǎn)便、可應(yīng)用于野外與基層的檢測(cè)方法有利于預(yù)防小反芻獸疫的傳播，因此已有多組研究人員開發(fā)了不同的小反芻獸疫LAMP檢測(cè)方法［12?14］。

本研究收集分析已開發(fā)的小反芻獸疫病毒的LAMP引物組，并選擇可以檢測(cè)全部4個(gè)譜系PPRV的引物組進(jìn)行檢測(cè)，比較評(píng)估SYBR Green I、SYBRSafe Stain 和羥基萘酚藍(lán)（hydroxy naphthol blue，HNB）3種指示劑的適用性與靈敏度，并對(duì)這3種方法與瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行對(duì)比和總結(jié)，突顯不同方法的特征和適用場(chǎng)景，為研究人員根據(jù)不同的場(chǎng)所與情況選擇合適的方法提供參考，為野生動(dòng)物保護(hù)提供重要的技術(shù)支持。

1 材料

1. 1 主要試劑

PPRV cDNA 受贈(zèng)于哈爾濱獸醫(yī)研究所的尹鑫研究員。Bst 2. 0 WarmStart DNA 聚合酶和10 mmol/LdNTPS購自New England Biolabs公司；羥基萘酚藍(lán)購自上海麥克林生化科技股份有限公司；SYBR Green I購自Biosharp公司；SYBR Safe Stain 購自APExBIO公司。

1. 2 實(shí)驗(yàn)儀器

電泳儀（型號(hào)：PowerPac HV）購自Bio-Rad（美國(guó)）公司；凝膠成像系統(tǒng)（型號(hào)：KETA GL）和PCR儀（型號(hào)SEDI G）購自威泰克（中國(guó)香港）有限公司；干式恒溫器（型號(hào)：MK-20）購自杭州奧盛儀器（中國(guó)）有限公司；紫外分光光度計(jì)（型號(hào)：NanoDrop One）購自賽默飛（美國(guó)）公司。

2 方法

2. 1 引物篩選

通過檢索分析已發(fā)表LAMP檢測(cè)小反芻獸疫病毒的文獻(xiàn)，最終選擇Rajko-Nenow 等［12］設(shè)計(jì)的引物組進(jìn)行分析。使用常規(guī)PCR 引物（Primer F/R）對(duì)N基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

2. 2 LAMP 初始反應(yīng)體系

LAMP總反應(yīng)體系為25. 0 μL，各組分濃度分別為FIP、BIP 各0. 8 μmol/L，F(xiàn)3、B3 各0. 1 μmol/L，dNTPS 1. 4 μmol/L，MgSO4 6. 0 mmol/L，1×IsothermalAmplification buffer，Bst 2. 0 WarmStart DNA 聚合酶8. 0 U，PPRV 模板1. 0 μL，無菌水補(bǔ)充至25. 0 μL。反應(yīng)參數(shù)設(shè)定為65 ℃，60 min，然后升至95 ℃，2 min，以終止反應(yīng)。