朱鹮性別分子鑒定的研究進展

摘 要：朱鹮（Nipponia nippon）為世界瀕危物種，也是國家一級重點保護鳥類。雖然一系列的保護措施顯著增加了朱鹮種群規(guī)模和分布區(qū)域，但近交衰退、低繁殖力和雛鳥高致殘率等問題一直制約著朱鹮種群的發(fā)展。朱鹮由于雌雄同型，難以從外觀區(qū)分性別，因此性別鑒定將對其人工繁殖具有重要意義。本文綜述了朱鹮性別的分子鑒定方法，主要包括基于性染色體連鎖的染色體解旋酶DNA 結合蛋白CHD 基因及EcoRⅠ片段的PCR鑒定方法，以期進行有效的人工繁育工作，實現對朱鹮種群的保護及規(guī)模重建。

關鍵詞：朱鹮；性別鑒定；CHD 基因；EE0.6序列；分子鑒定

中圖分類號：Q75

文獻標識碼：A

文章編號：2310 - 1490（2024）- 03 - 0670 - 05

DOI：10.12375/ysdwxb.20240325

朱鹮（Nipponia nippon）是國家一級重點保護野生動物，也是被“The IUCN Red List of ThreatenedSpecies”收錄的重要瀕危物種［1?2］。該物種在歷史上曾廣泛分布在東亞地區(qū)的中國、日本、朝鮮半島和俄羅斯遠東地區(qū)，種群數量較大［3］。在19世紀至20世紀中期，由于氣候變化、棲息地喪失、人類過度捕獵和農用化學品的使用，使朱鹮的數量迅速減少［4］。在很長一段時間內未見朱鹮蹤跡，一度被認為可能已經滅絕。直至1981年，在陜西秦嶺洋縣境內的姚家溝和金家河發(fā)現了7只朱鹮，才為后續(xù)朱鹮的保護和繁殖帶來了希望。朱鹮從被發(fā)現時的極度瀕危狀態(tài)發(fā)展到現在，其數量顯著增加，并已引入到國內多個繁殖基地及日本和韓國等數個國家［5］。自20世紀以來，眾多機構對朱鹮進行了持續(xù)地保護和研究，通過共同努力，這種瀕臨滅絕的野生鳥類得到了成功保護，截至2023 年，朱鹮全球種群數量已達到1. 1萬只［6］，但其仍被認為是瀕危物種。目前，近交衰退、低繁殖力、雛鳥高致殘率和消化系統(tǒng)疾病等問題一直影響著朱鹮種群的發(fā)展［7?9］。

單態(tài)性鳥即雌雄同型［10］的性別鑒定是生態(tài)學研究和生物多樣性保護的重要內容。朱鹮作為一種雌雄同型的鳥類，在圈養(yǎng)和放歸育種對的選擇中，有時會出現錯誤，需要一種方便、準確的方法來正確鑒別朱鹮個體的性別［11］。采用類固醇激素和核型分析等方法進行朱鹮的性別鑒定存在諸如結果不可靠、耗時或樣本量需求大等缺陷，腹腔鏡對鳥類損傷較大，甚至致命，因此上述方法不適用于朱鹮的性別鑒定［11?12］。朱鹮體細胞為正常的二倍體，細胞核型為2n=68，雄性性染色體為ZZ，雌性為ZW［13］。為了鑒定朱鹮的性別，研究人員以與朱鹮親緣關系較近的鳥類基因組序列為參照，進行引物設計，并利用PCR技術擴增其性染色體上具有差異序列的等位基因。目前染色體解旋酶DNA 結合蛋白基因（Chromodomain-helicase-DNA binding protein 1 gene，CHD1）、0. 6 kb EcoRⅠ片段（EE0. 6）等序列已被用于朱鹮的性別鑒定［14?15］。鳥類的CHD1 基因位于性染色體上，高度保守，CHD 有2個等位基因即CHD-W和CHD-Z［15］。EE0. 6是一個位于W染色體上的非重復序列，該序列位于異染色質區(qū)的EcoRⅠ和XhoⅠ位點之間［16］。此外，若能找到并利用進化上保守且只存在于雌性特有的W染色體上的非重復序列作為探針，將有助于鳥類的性別鑒定［17］。目前，已有這樣的序列被用于鑒定朱鹮的性別，但是鑒定效果并不理想［18?19］。在當前人工圈養(yǎng)模式下，獲悉準確的性別信息對朱鹮繁育具有重要意義［1］。因此，本文針對朱鹮性別的分子鑒定研究進行綜述，從而為朱鹮的保護和規(guī)模重建提供技術支持。

1 DNA 來源

朱鹮性別的分子鑒定通常需要血液或組織樣本［12］。此外，孵化后的卵內帶血管的絨毛尿囊膜也可被用作性別分子鑒定的DNA來源，因為這可以避免對所研究鳥的創(chuàng)傷，但如果PCR中的引物與其結合位點不匹配，則有可能導致性別鑒定錯誤［20］。Kasuga等［20］認為在珍稀動物生態(tài)學研究中，使用極少量DNA來源（如糞便或僅是一根脫落的羽毛）且引物結合位點沒有序列錯配的引物，進行基于PCR的性別鑒定是可行的。張漫慧等［15］建立了一種采用朱鹮糞便基因組DNA進行PCR性別鑒定的方法，鑒定效率達到85. 11%。

2 基于CHD1 基因的性別鑒定法

2. 1 鑒定原理

性染色體連鎖的CHD1 基因是鳥類分子性別鑒定的通用靶標之一［11］，鳥類CHD 基因片段用于性別區(qū)分是可靠的［12］。在W和Z染色體上有2個CHD1等位基因。它們共有相對保守的外顯子，同時攜帶高度多態(tài)的內含子，通常這兩個等位基因的核苷酸長度不同。這些結構上的差異使得CHD1-W 和CHD1-Z 基因同源片段的PCR 擴增產物大小不同。由于這兩個等位基因的同源性水平在不同性別中有所不同［11］，因此，性別鑒定結果將取決于PCR擴增產物的片段數量：1 或2。單帶的PCR 產物表示雄性，雙帶的PCR產物表示雌性［21］。三對引物：P2/P8、2550F/2718R 和CHD1F/CHD1R 可用于確定鳥類的性別［22］，其中引物CHD1F/CHD1R 使用較少。引物序列信息見表1。此外，使用限制性內切酶消化CHD 片段的方法也可鑒定朱鹮的性別［19，23］。

2. 2 研究進展

引物P2和P8已被使用進行源自羽根組織的非損傷性性別鑒定，其擴增產生了Z染色體350 bp和W染色體400 bp的PCR產物。雌雄之間差異的準確性取決于所分離的羽毛類型。雖然一些樣本可顯示出清晰的DNA條帶結果，但也有一些樣本產生的結果并不明確。這種差異歸因于樣本中所包含的羽根（含有遺傳物質）數量，含有大量羽根的樣本在電泳中顯示出更清晰的DNA條帶［12］。但使用P2和P8引物進行PCR性別鑒定，即使能夠成功擴增出兩個片段，但仍然難以分離，這是由于Z-和W-特異片段之間的大小差異較小，只有在3%瓊脂糖凝膠中進行長時間電泳，兩種PCR 產物條帶才能得以有效分離［21］。Kim等［21］設計了引物pci1、pci2和pci3，通過擴增Z特異性片段和W特異性片段來鑒定朱鹮的性別，引物序列見表1。由于兩個PCR擴增子的大小相差107 bp，通過電泳很容易被分離，因此該方法克服了P2和P8引物所得的PCR擴增片段差異太小而無法有效進行性別鑒定的問題。最終的核苷酸序列被提交給GenBank（登錄號為AB620020和AB620021）。Sulandart等［24］使用引物P2/P8對110只共56種鳥類進行性別鑒定，分型結果顯示，81. 8%的樣本擴增成功，12. 7%的樣本擴增失敗，5. 5%的樣本由于PCR產物條帶相互緊鄰，而不能被準確鑒定，導致雌雄鳥的錯誤識別。Sulandart 等［24］進一步設計了引物2550F/2718R 以優(yōu)化PCR 檢測效率，引物序列見表1，利用該對引物，對229只共10種鳥類進行了PCR性別鑒定，結果顯示該對引物的鑒定有效率為100%，表明2550F和2718R引物可用于鳥類性別的鑒定。

此外，He 等［11］利用上述常用的兩對引物即2550F/2718R和P2/P8，擴增了鳥類Z染色體和W染色體上CHD1 基因的不同片段，首次在大量樣本中鑒定了朱鹮個體的性別，并根據2550F/2718R 引物結合位點之前的保守序列，重新設計了一組針對朱鹮的改進引物（2467F/2530R），從而提供了一種快速、方便和可靠的分子檢測方法，引物序列見表1。在常規(guī)1. 8% 瓊脂糖凝膠中，新改進引物的PCR 產物可以方便地觀察到雌性的552 bp和358 bp的雙條帶，而雄性則是552 bp的單條帶。同時，P2/P8引物組從雄性個體中擴增出1個398 bp的片段，而從雌性個體中擴增出398 bp和381 bp的兩個片段，需采用具高分辨率的10%聚丙烯酰胺凝膠來顯示雌性個體兩個擴增子之間存在的17 bp的大小區(qū)別。另外，一個微衛(wèi)星位點NnNF05也被驗證為性別連鎖，并被證明在朱鹮的性別鑒定中有效，且在非損傷性鑒定中具有實用性［11］。

3 基于0.6 kb EcoRⅠ片段（EE0.6）的性別鑒定法

3. 1 鑒定原理

EE0. 6序列在所有鳥類中都趨于保守，該序列不僅存在于W染色體上，在Z染色體上也存在對應的序列，但W染色體上的EE0. 6序列與Z染色體上的對應序列存在本質差異，其序列之間的多樣性程度因物種而異。在許多物種中，僅有W染色體上的序列可通過Southern Blot 雜交或PCR 檢測到［16?17］。Kasuga 等［20］對比了從12 種鳥類中克隆出的EE0. 6序列，在其保守區(qū)設計了1對引物（AWS03F/USP3R），引物序列見表2。利用該對引物所建立的日本朱鹮W染色體EE0. 6序列PCR鑒定方法是一種常見的性別鑒別方法，其鑒定原理是該對引物可擴增出W染色體連鎖的EE0. 6序列，而不能擴增出Z染色體連鎖的對應序列。

3. 2 研究進展

為了確認EE0. 6序列性別鑒定應用于朱鹮的準確性，Kasuga 等［20］測定了日本朱鹮W-和Z-連鎖的EE0. 6序列，明確了AWS03F/USP3R引物與W-連鎖的EE0. 6序列上的結合位點相匹配，而與Z-連鎖的對應序列上的相應位點不匹配，并驗證了基于PCR的AWS03和USP3引物鑒定方法作為日本佐渡島朱鹮圈養(yǎng)群體性別分子鑒定方法的準確性。此外，基于獲得的EE0. 6序列，該研究設計了一套新的性別鑒定引物NNsexF/NNsexR，引物序列見表2。Kasuga等［20］使用該對引物進行PCR擴增，特異性地獲得了日本朱鹮W-連鎖的EE0. 6序列，同時用一對Z/W公共序列的引物作為對照。結果顯示，在雌鳥而非雄鳥DNA的擴增中獲得了目的條帶。這是在日本朱鹮群體中首次發(fā)現EE0. 6序列。這種新的性別鑒定方法將有助于朱鹮的生態(tài)學研究及群體擴繁的實踐應用。

4 基于W染色體性別相關基因的性別鑒定法

4. 1 鑒定原理

由于鳥類的性染色體在雌性中為ZW，在雄性中為ZZ，該方法的引物僅能擴增位于W染色體上的基因片段，因而，該性別相關基因片段只能從雌性個體中獲得［17］。

4. 2 研究進展

Li等［18］選擇了1對位于東方白鸛（Ciconia boyci?ana）W 染色體上的性別相關基因的引物（F：5′-CACCCTGGATTGGACAACCTATTTC-3′；R：5′-CACTCTTTCCAGGAAATCAA-3′），從朱鹮中擴增性別相關基因，并對2個已知性別的朱鹮樣本進行了正確的性別鑒定。此外，他們還對這一性別相關基因片段進行了測序，以用于設計朱鹮性別鑒定的特異性引物。然而，在Kim等［19］使用上述同樣的引物對朱鹮進行性別鑒定時，發(fā)現部分鑒定結果并不準確，因此，該研究從朱鹮W染色體特異性DNA序列中擴增出262 bp PCR產物，并設計了新的引物，然后用新引物再次進行PCR，但從雄性和雌性的樣本中均擴增出了大小相似的條帶，無法鑒定朱鹮的性別，研究者認為這可能是W染色體的PCR產物序列與Z染色體的相應序列一致所造成。

5 結論

朱鹮自2000年以來一直被國際自然保護聯盟（IUCN）列為瀕危物種（EN）［2］。自1981年在中國重新發(fā)現幸存的7只野生朱鹮種群以來，隨著保護工作的不斷進行，野外放生和圈養(yǎng)朱鹮的數量均顯著增加。準確的性別鑒定為包括性別比例數據在內的種群結構監(jiān)測提供了關鍵信息，也為朱鹮保護計劃中雌雄交配對的選擇提供了技術支持。性別鑒定對朱鹮的行為、種群生態(tài)及育種管理等方面研究均具有重要意義。當僅有極少量樣本時，分子生物學方法靈敏度較高，如PCR法和DNA指紋法比形態(tài)測量學更準確。目前已報道了幾種基于PCR的性別鑒定方法以及用于該方法鑒定的一系列靶基因和未知基因組區(qū)域?；赪染色體性別相關基因對朱鹮進行性別鑒定的方法被證明并不理想，另外，使用酶切法進行性別鑒定雖然可行，但該方法所需樣本量大，且其鑒定結果的準確性受酶活性及DNA模板量的限制。目前這兩種方法在朱鹮的性別鑒定中已被淘汰。高度保守的CHD1 基因的選定內含子（引物P2/P8和2550F/2718R）是用于鳥類性別分型最廣泛的PCR標記。EE0. 6序列作為性別鑒定的靶標位點也具有一定的優(yōu)勢，因為該序列在鳥類中普遍保守，且W-和Z-鏈具有各自特異的EE0. 6序列。研究人員已對基于CHD1 基因和EE0. 6序列的一些引物進行了改進，應用改進后的引物進行朱鹮性別鑒定，均較為簡便和有效。但針對朱鹮性別鑒定的分子方法仍有待今后進一步完善和推廣。隨著對朱鹮基因組研究的深入開展，相信未來將開發(fā)出更多準確鑒定朱鹮個體性別的新方法，從而為朱鹮種群的保種及規(guī)模重建提供有力的技術支撐。

參考文獻：

［1］ JIANG X， YANG T D， LIU D P， et al. An automatic identification

method of crested ibis （Nipponia nippon） habitat based on spatiotemporal

density detection［J］. Animals， 2022， 12（17）： 2220.

［2］ BirdLife International. Nipponia nippon［J/OL］. The IUCN Red

List of Threatened Species， 2018： e. T22697548A132069229

［2023-06-23］. https： //dx. doi. org/10. 2305/IUCN. UK. 2018-

2. RLTS. T22697548A132069229. en.

［3］ 邱國強， 付春正， 張睿燦， 等. 朱鹮圈養(yǎng)種群與野外重引入種

群行為差異研究［J］. 野生動物學報， 2020， 41（2）： 376-386.

QIU G Q， FU C Z， ZHANG R C， et al. Behavioral differences between

captive and reintroduced populations of crested ibis（ Nipponia

nippon）［J］. Chinese Journal of Wildlife， 2020， 41（2）： 376-386.

［4］ FU C Z， GUANG X M， WAN Q H， et al. Genome resequencing

reveals congenital causes of embryo and nestling death in crested

ibis （Nipponia nippon）［J］. Genome Biology and Evolution，

2019， 11（8）： 2125-2135.

［5］ MA L M， LI X H， ZHAI T Q， et al. Changes in the habitat preference

of crested ibis （Nipponia nippon） during a period of rapid

population increase［J］. Animals， 2021， 11（9）： 2626.

［6］ 龔仕建. 全球朱鹮種群數量和棲息地面積雙增長： 種群數量

破萬只，由極危調整為瀕危［N］. 人民日報， 2023-11-08（14）.

GONG S J. The global crested ibis population and habitat area

have both increased： the population has exceeded 10，000 and has

been changed from critically endangered to endangered ［N］.

People’s Daily， 2023-11-08（14）.

［7］ XI Y M， LU B Z， ZHANG Y M， et al. Restoration of the crested

ibis， Nipponia nippon［J］. Journal of Applied Animal Research，

2002， 22（2）： 193-200.

［8］ YU X P， LIU N F， XI Y M， et al. Reproductive success of the

crested ibis Nipponia nippon［J］. Bird Conservation International，

2006， 16（4）： 325-343.

［9］ SUN Y W， WANG T J， SKIDMORE A K， et al. Predicting and

understanding spatio-temporal dynamics of species recovery： implications

for Asian crested ibis Nipponia nippon conservation in

China［J］. Diversity and Distributions， 2016， 22（8）： 893-904.

［10］ 田秀華， 劉鑄， 何相寶， 等. 7種鶴形目鳥類性別的分子鑒定

［J］. 動物學雜志， 2006， 41（5）： 62-67.

TIAN X H， LIU Z， HE X B， et al. The molecular sexing of 7

species of Gruiformes［J］. Chinese Journal of Zoology， 2006， 41

（5）： 62-67.

［11］ HE X L， QING B P， HAN J L， et al. Improved molecular assay

for sex identification of the endangered crested ibis （Nipponia

nippon） based on the CHD1 gene and a sex-linked microsatellite

locus［J］. Zoological Science， 2013， 30（9）： 742-747.

［12］ PURWANINGRUM M， NUGROHO H A， ASVAN M， et al. Molecular

techniques for sex identification of captive birds［J］. Veterinary

World， 2019， 12（9）： 1506-1513.

［13］ WANG J H， SU R， SU W T， et al. Establishment of cell lines

derived from skin biopsies of crested ibis （Nipponia nippon） and

their biological characteristics［J］. Zoological Research， 2013，

33（6）： 591-596.

［14］ 王曉宇， 昝林森. 朱鹮保護分子生物學研究進展［J］. 陜西林

業(yè)科技， 2021， 49（6）： 90-94.

WANG X Y， ZAN L S. Research progress of molecular biology

in the conservation of crested ibis［J］. Shaanxi Forest Science

and Technology， 2021， 49（6）： 90-94.

［15］ 張漫慧， 趙泓淙， 王彩霞， 等. 應用于PCR性別鑒定的朱鹮

糞便基因組提取方法的建立［J］. 湖北畜牧獸醫(yī)， 2020， 41

（8）： 5-7；14.

ZHANG M H， ZHAO H C， WANG C X， et al. Establishment of

genomic extraction method of crested ibis feces for PCR sex identification

［J］. Hubei Journal of Animal and Veterinary Sciences，

2020， 41（8）： 5-7；14.

［16］ OGAWA A， MURATA K， MIZUNO S. The location of Z- and

W-linked marker genes and sequence on the homomorphic sex

chromosomes of the ostrich and the emu［J］. Proceedings of the

National Academy of Sciences of the United States of America，

1998， 95（8）： 4415-4418.

［17］ ITOH Y， SUZUKI M， OGAWA A， et al. Identification of the

sex of a wide range of carinatae birds by PCR using primer sets

selected from chicken EE0. 6 and its related sequences［J］. Journal

of Heredity， 2001， 92（4）： 315-321.

［18］ LI M， DING C Q， WEI F W， et al. Sex-related gene and sex

identification of crested ibis Nipponia nippon （Ciconiiformes：

Threskiornithidae）［J］. Chinese Science Bulletin， 2001， 46

（8）： 669-671.

［19］ KIM K A， CHA J S， KIM T J， et al. Sex identification of the

first incubated chicks of the crested ibis Nipponia nippon in Korea

［J］. Journal of Life Science， 2011， 21（5）： 626- 630.

［20］ KASUGA K， HIGASHI M， YAMADA T， et al. The W- and Zlinked

EE0. 6 sequences used for molecular sexing of captive

Japanese crested ibis on Sado Island［J］. Animal Science Journal，

2012， 83（1）： 83-87.

［21］ KIM K A， SEOKCHA J， PARK S Y， et al. The improved polymerase

chain reaction method applied for sex identification of

crested ibis， Nipponia nippon［J］. Advances in Life Sciences，

2012， 2（4）： 82-84.

［22］ ?AKMAK E， AK?N PEK?EN ?， BILGIN C C. Comparison of

three different primer sets for sexing birds［J］. Journal of Veterinary

Diagnostic Investigation， 2017， 29（1）： 59-63.

［23］ KIKUCHI M， ISHII S. Sex identification of the Japanese crested

ibis， Nipponia nippon， by chromodomain helicase DNA binding

protein（ CHD） gene analysis［J］. Journal of the Yamashina Institute

for Ornithology， 2002， 33（2）： 189-197.

［24］ SULANDART S， ZEIN M S A. Application of two molecular sexing

methods for Indonesian bird species： implication for captive

breeding programs in Indonesia［J］. HAYATI Journal of Biosciences，

2012， 19（4）： 183-190.