茶樹(shù)STOP基因家族的鑒定及表達(dá)模式分析

龍露 湯丹丹 陳瑋 譚禮強(qiáng) 陳盛相 唐茜

摘要：STOP（Sensitive to proton rhizotoxicity）是一類C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子，在植物多種脅迫耐受機(jī)制中發(fā)揮重要調(diào)控作用?；诓铇?shù)（Camellia sinensis）全基因組數(shù)據(jù)共鑒定出6個(gè)STOP家族基因，并運(yùn)用生物信息學(xué)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）等方法對(duì)其進(jìn)行分析。結(jié)果表明，6個(gè)CsSTOPs基因編碼376～505個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為42.17～56.36 kDa，理論等電點(diǎn)為5.53～8.85，均為不穩(wěn)定蛋白；蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，它們均含zf-C2H2保守結(jié)構(gòu)域；系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，茶樹(shù)的STOP基因與擬南芥、甜橙、煙草的同源性較高；啟動(dòng)子順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，CsSTOPs具有許多與生長(zhǎng)發(fā)育、激素響應(yīng)及非生物脅迫相關(guān)的作用元件；茶樹(shù)各器官的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，CsSTOP1在根、果實(shí)、成熟葉片中的表達(dá)量較高，CsSTOP2在幼嫩葉片中的表達(dá)量較高，CsSTOP3在老葉中的表達(dá)量較高，而CsSTOP4和CsSTOP5在各個(gè)器官中的表達(dá)都較低。CsSTOPs基因能夠被PEG誘導(dǎo)的干旱脅迫、鹽脅迫、茉莉酸甲酯脅迫和冷脅迫處理誘導(dǎo)表達(dá)，說(shuō)明CsSTOPs基因參與調(diào)控茶樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CsSTOPs、CsGS1s和CsGDHs基因在高NH4+濃度處理（4.5 mmol·L-1）的峨眉問(wèn)春茶樹(shù)葉和根中的表達(dá)量均高于對(duì)照處理（CK），尤其是葉中CsSTOPs、CsGS1.1、CsGS1.3和CsGDH2在高NH4+濃度處理下的表達(dá)量顯著高于對(duì)照。研究結(jié)果初步解析了CsSTOPs的基本特征和功能，發(fā)現(xiàn)CsSTOPs可響應(yīng)高NH4+濃度處理，可能與CsGS1s和CsGDHs協(xié)同調(diào)控茶樹(shù)適應(yīng)高NH4+環(huán)境的過(guò)程。

關(guān)鍵詞：茶樹(shù)；STOP基因家族；生物信息學(xué)分析；基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S571.1；Q52????????????? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A????????????? 文章編號(hào)：1000-369X（2024）03-386-13

Identification and Expression Pattern Analysis of STOP Gene Family in Tea Plants （Camellia sinensis）

LONG Lu1， TANG Dandan1，2*， CHEN Wei1，2， TAN Liqiang1，2， CHEN Shengxiang1，2， TANG Qian1，2*

1. College of Horticulture， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China;

2. Tea Refining and Innovation Key Laboratory of Sichuan Province， Chengdu 611130， China

Abstract： STOP （Sensitive to proton rhizotoxicity） is a type of C2H2 zinc finger transcription factor， and it plays an important regulatory role in various stress tolerance mechanisms in higher plants. A total of 6 STOP genes were identified based on the whole genome data of tea plant （Camellia sinensis）， and analyzed by bioinformatics and real-time fluorescence quantitative PCR. The results show that the six CsSTOP genes encoded 376-505 amino acids， their molecular weights were 42.17-56.36 kDa， and their theoretical isoelectric points were 5.53-8.85， all of which were unstable proteins. Conserved domain analysis of the proteins shows that they all contained zf-C2H2 conserved domain. Phylogenetic analysis shows that tea plant has high homology with Arabidopsis， Citrus sinensis and Nicotiana tabacum. Cis-acting element analysis of the promoter shows that CsSTOPs contain many elements related to growth and development， hormone response and abiotic stress. Transcriptome data analysis of different tissues shows that the expression level of CsSTOP1 was the higher in roots， fruits and mature leaves， the expression level of CsSTOP2 was the higher in young leaves， the expression level of CsSTOP3 was the higher in old leaves， and the expression levels of CsSTOP4 and CsSTOP5 were low in all tissues. The expressions of different CsSTOP genes were induced by PEG-induced drought stress， salt stress， methyl jasmonate stress and cold stress， indicating that CsSTOP genes were involved in the regulation of growth and development of tea plants and response to abiotic stress. Fluorescence quantitative PCR detection shows that the expression levels of CsSTOPs， CsGS1s and CsGDHs in leaves and roots of 'Emeiwenchun' treated with high NH4+ concentration （4.5 mmol·L-1） were higher than those in the control treatment （CK）. Particularly， the expression levels of CsSTOPs， CsGS1.1， CsGS1.3 and CsGDH2 were significantly higher than CK in leaves treated with high NH4+ concentration. In this study， the basic characteristics and functions of CsSTOPs were preliminarily analyzed， and it was found that CsSTOPs could coordinate with CsGS1s and CsGDHs genes to regulate the process of tea plant adaptation to high NH4+ environmental availability.

Keywords： tea plant， STOP gene family， bioinformatics analysis， gene expression

STOP（Sensitive to proton rhizotoxicity）是一類C2H2型鋅指類轉(zhuǎn)錄因子，在植物響應(yīng)酸鋁、鹽堿、水分、缺氧等多種脅迫中發(fā)揮重要調(diào)控作用[1]。STOP1最早是通過(guò)圖位克隆從擬南芥（Arabidopsis thaliana）EMS突變體庫(kù)中篩選得到[2]。目前，STOP1基因已經(jīng)在水稻（Oryza sativa）[3]、煙草（Nicotiana tabacum）[4]、小麥（Triticum aestivum）[5]、大豆（Glycine max）[6]、紫花苜蓿（Medicago sativa）[7]、柱花草（Stybsanthes guianensis）[8]、葡萄（Vitis vinifera）[9]等植物中被克隆鑒定。Kobayashi等[10]在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，AtSTOP1的同源基因AtSTOP2受AtSTOP1調(diào)控并在質(zhì)子脅迫中起作用。研究發(fā)現(xiàn)，STOP1可通過(guò)誘導(dǎo)包括ALMT1在內(nèi)的一系列抗鋁毒基因的表達(dá)，響應(yīng)擬南芥酸鋁脅迫過(guò)程[2]。STOP1通過(guò)介導(dǎo)擬南芥中類鈣調(diào)磷酸酶B亞基蛋白（CBL）相互作用的CIPK23蛋白激酶的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)鹽和干旱耐受[11]。在低氧環(huán)境下，STOP1可以通過(guò)激活HsfA2和GDHs的表達(dá)調(diào)控植物的低氧耐受性[12]。STOP也參與調(diào)控植物耐受銨態(tài)氮（NH4+）過(guò)程，在外界NH4+濃度達(dá)到毒性水平時(shí)，STOP1可以直接結(jié)合CIPK23啟動(dòng)子區(qū)域并激活其表達(dá)，下調(diào)AMT1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，從而避免NH4+過(guò)度吸收引起的NH4+毒害作用[13]。由此可知，STOP對(duì)植物逆境響應(yīng)的調(diào)控并不局限于酸鋁脅迫、低氧脅迫等，其在氮的吸收利用中也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，推測(cè)STOP1可能是一類能介導(dǎo)多種脅迫響應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子。

茶樹(shù)（Camellia sinensis）是我國(guó)重要的葉用經(jīng)濟(jì)作物，相比其他植物，氮素對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育及品質(zhì)形成過(guò)程更加重要[14]。NH4+作為植物可獲取的主要氮素形態(tài)之一，大多數(shù)植物對(duì)NH4+敏感，當(dāng)其作為唯一或占主導(dǎo)地位的氮素時(shí)，多數(shù)植物會(huì)表現(xiàn)出整體生長(zhǎng)受抑制、葉片失綠萎黃、葉面積減小、主根變短側(cè)根增加、根冠比降低等癥狀，導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降[15-17]。茶樹(shù)具有偏NH4+利用的營(yíng)養(yǎng)特性[18]。在施用較多NH4+的條件下，茶樹(shù)仍然生長(zhǎng)良好，而且茶葉品質(zhì)和產(chǎn)量較佳[14，19-20]，即茶樹(shù)可能有一套獨(dú)特的適應(yīng)高NH4+環(huán)境的調(diào)控機(jī)制，其調(diào)控機(jī)制可能與STOP基因有關(guān)。因此，研究STOP在茶樹(shù)中的表達(dá)模式及其對(duì)高NH4+環(huán)境的響應(yīng)情況，對(duì)進(jìn)一步探究STOP在茶樹(shù)適應(yīng)高NH4+環(huán)境中的調(diào)控機(jī)制具有重要意義。

目前，對(duì)茶樹(shù)STOP（CsSTOP）的研究已有部分報(bào)道。李勇[21]研究發(fā)現(xiàn)，CsSTOP1可能參與茶樹(shù)耐鋁聚鋁的調(diào)控；李營(yíng)營(yíng)[22]從茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)中篩選了4個(gè)STOP基因，推測(cè)CsSTOP2a和CsSTOP2b在茶樹(shù)響應(yīng)酸鋁脅迫過(guò)程中，可能在調(diào)控茶樹(shù)根中茶氨酸合成等相關(guān)基因表達(dá)方面發(fā)揮著重要作用。目前CsSTOP家族基因在茶樹(shù)基因組中尚未被鑒定，其在應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫中的生物學(xué)作用缺乏深入研究，特別是STOP在響應(yīng)NH4+方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究基于茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)CsSTOP家族基因進(jìn)行全基因組鑒定，利用生物信息學(xué)方法解析CsSTOP家族基因特性，并分析CsSTOP家族成員在茶樹(shù)不同器官中，以及高NH4+濃度等不同脅迫處理下的表達(dá)模式，為進(jìn)一步探究CsSTOP家族基因在茶樹(shù)響應(yīng)高NH4+濃度等不同脅迫環(huán)境中的作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試驗(yàn)材料為四川省當(dāng)?shù)靥卦缟铇?shù)品種峨眉問(wèn)春的一年生扦插茶苗，來(lái)源于四川省雅安市名山茶苗繁育基地，試驗(yàn)于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水培室進(jìn)行。

NH4+處理：取生長(zhǎng)良好、大小一致的茶苗，根系用蒸餾水清洗后定植于塑料盆中，每盆6株，加入4 L營(yíng)養(yǎng)液，在純凈水中避光通氣預(yù)水培一周。隨后移至營(yíng)養(yǎng)液中通氣培養(yǎng)，依次用1/16、1/8、1/4、1/2、完全營(yíng)養(yǎng)液各培養(yǎng)14 d，營(yíng)養(yǎng)液每周更換1次。營(yíng)養(yǎng)液配方參照文獻(xiàn)[23]，大量元素（mmol·L-1）分別為N（1.50）、P（0.10）、K（1.00）、Ca（0.80）、Mg（0.40），微量元素（μmol·L-1）分別為Zn（1.00）、Cu（0.20）、Mn（1.50）、B（10.00）、Mo（0.50）、EDTA-Fe（6.25），并且加入0.07 mmol·L-1的Al。營(yíng)養(yǎng)液pH約為5.0，用通氣泵全天24 h通氣。培養(yǎng)溫室條件為光周期14L∶10D，溫度25 ℃，相對(duì)濕度70%～75%。待茶苗長(zhǎng)勢(shì)良好時(shí)，進(jìn)行氮饑餓處理5 d，以消耗幼苗中貯存的氮。預(yù)處理結(jié)束后轉(zhuǎn)入以（NH4）2SO4為主要氮源的營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)7 d，NH4+濃度設(shè)置為4.5 mmol·L-1（HN），以含有2 mmol·L-1 NH4+的營(yíng)養(yǎng)液處理作為對(duì)照組（CK），每個(gè)處理3次生物學(xué)重復(fù)。在處理結(jié)束后對(duì)茶樹(shù)的成熟葉與根進(jìn)行隨機(jī)取樣，用液氮冷凍固樣后置于﹣80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 CsSTOPs基因家族成員序列的獲取

分別從茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TPIA2（http：//tpia.teaplants.cn）和擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TAIR（www.arabidopsis.org）中獲取舒茶早（ShuchazaoV2）和擬南芥的全基因組數(shù)據(jù)信息。以擬南芥STOP蛋白序列為參考，在茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTP比對(duì)，閾值設(shè)定為E<1e-5，經(jīng)過(guò)篩選后獲得潛在的CsSTOPs基因家族蛋白序列。將篩選出的CsSTOPs序列用NCBI-BLASTP（https：//blast.ncbi.nlm.nih.

gov/Blast.cgi）再比對(duì)一次，驗(yàn)證兩次比對(duì)結(jié)果是否一致，再利用NCBI-CDD（www.ncbi.

nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、HMMER（www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer）、SMART（http：//

smart.embl-heidelberg.de）等工具對(duì)蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域zf-C2H2（Pfam：PF00096）進(jìn)行驗(yàn)證，經(jīng)過(guò)整理并去除冗余序列后獲得最終的CsSTOPs家族基因序列。

1.2.2 CsSTOPs理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

利用ExPASy protparam（https：//web.expasy.

org/protparam）在線工具預(yù)測(cè)分析CsSTOPs編碼蛋白質(zhì)的分子量（Mw）和等電點(diǎn)（pI）等理化特性。利用Plant-mPLoc（www.csbio.

sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi）在線工具預(yù)測(cè)分析CsSTOPs編碼蛋白亞細(xì)胞定位。

1.2.3 CsSTOPs基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中分別下載擬南芥、煙草、水稻、小麥、甜橙（Citrus sinensis）、蘋(píng)果（Malus domestica）、桃（Prunus persica）、梨（Pyrus pyrifolia）、櫻桃（Prunus dulcis）、玉米（Zea mays）、大豆、花生（Arachis hypogaea）、圭亞那筆花豆（Stylosanthes guianensis）、辣椒（Capsicum annuum）等的STOP序列。利用MEGA 7.0軟件中的Clustal W工具將CsSTOPs與這些物種的STOP進(jìn)行多序列比對(duì)，分析CsSTOPs家族的進(jìn)化關(guān)系，并使用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)[24]，設(shè)置校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap為1 000次重復(fù)，使用Evolview（https：//evolgenius.info//evolview-

v2/#login）在線工具進(jìn)行可視化處理。

1.2.4 CsSTOPs基因結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)基序和保守結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)在線工具M(jìn)EME（http：//meme-suite.

org）對(duì)CsSTOPs的氨基酸序列保守基序進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，motif數(shù)目設(shè)置為15個(gè)，寬度設(shè)置為6～50個(gè)氨基酸。從NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(kù)（www.ncbi.nlm.nih.gov）提取CsSTOPs序列中相關(guān)保守結(jié)構(gòu)域，利用Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)，并結(jié)合CsSTOPs基因組DNA序列和CDS序列，利用TBtools軟件繪制保守基序圖、結(jié)構(gòu)域圖及茶樹(shù)基因結(jié)構(gòu)圖[25]。

1.2.5 CsSTOPs染色體分布情況分析

從茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TPIA2（http：//tpia.

teaplants.cn）中獲取舒茶早（Shuchazao 2）中CsSTOPs在染色體上的起始位置信息，利用TBtools軟件基于基因注釋信息對(duì)同源關(guān)系進(jìn)行可視化[25]。

1.2.6 CsSTOPs啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用TBtools軟件提取CsSTOPs家族基因起始密碼子上游2 000 bp序列，通過(guò)PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）在線軟件對(duì)啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用TBtools軟件對(duì)整理的結(jié)果進(jìn)行可視化[25]。

1.2.7 CsSTOPs表達(dá)模式分析

從茶樹(shù)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)TPIA2（http：//tpia.

teaplant.org）下載茶樹(shù)不同器官，以及茶樹(shù)在干旱脅迫（PEG誘導(dǎo)）、鹽脅迫、冷脅迫和茉莉酸甲酯（Methyl jasmonate，MeJA）處理后的CsSTOPs轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（TPM值），利用TBtools軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理[25]。

1.2.8 CsSTOPs在高NH4+濃度下的表達(dá)特性分析

按照RNAprep pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]的要求分別提取不同NH4+濃度處理下茶樹(shù)成熟葉和根的總RNA，通過(guò)凝膠電泳和核酸濃度檢測(cè)驗(yàn)證其完整性、純度和濃度。使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)CsSTOPs的qRT-PCR擴(kuò)增引物（表1），CsGSs和CsGDHs的qRT-PCR引物參照文獻(xiàn)等[26-27]方法，選用CsGADPH作為內(nèi)參基因，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。使用Taq SYBR? Green qPCR Premix[蘭博利德生物科技（北京）有限公司]試劑盒及BIORAD-CFX96 PCR儀進(jìn)行qRT-PCR分析。每個(gè)樣品設(shè)置3次重復(fù)，采用方法進(jìn)行基因的相對(duì)表達(dá)量分析[28]。利用IBM SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，最后使用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsSTOPs家族的鑒定與分析

在茶樹(shù)基因組中共鑒定出6個(gè)CsSTOPs家族成員（表2），分別根據(jù)它們?cè)谌旧w上的分布情況進(jìn)行命名。蛋白的理化特性分析結(jié)果表明，CsSTOPs編碼376～505個(gè)氨基酸，蛋白的分子量為42.17～56.36 kDa；理論等電點(diǎn)（pI）為5.53～8.85；不穩(wěn)定性指數(shù)為41.61～53.71，均高于40，為不穩(wěn)定蛋白；脂肪族指數(shù)為61.87～66.81；平均疏水性為﹣0.743～

﹣0.552，均為負(fù)值，屬于親水性蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析結(jié)果表明，CsSTOPs均分布

于細(xì)胞核。

2.2 CsSTOPs系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

將茶樹(shù)與擬南芥、煙草、水稻、小麥等的STOP蛋白序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果表明（圖1），CsSTOP1與GhSTOP1、CisSTOP1、GmSTOP1等處于同一分支，親緣關(guān)系較近；CsSTOP2、CsSTOP3、CsSTOP6與AtSTOP1、NtSTOP1、CaSTOP1、SgSTOP1等親緣關(guān)系較為密切；CsSTOP4與CsSTOP5在氨基酸序列上具有高度相似性（相似度達(dá)99%），并且在進(jìn)化樹(shù)上成對(duì)出現(xiàn)，與AtSTOP2、PrpSTOP1和PpSTOP1親緣關(guān)系較近。

CsSTOPs的保守基序組成和數(shù)目分析結(jié)果表明（圖2A和2B），CsSTOPs中共鑒定到7個(gè)比較保守的基序（motif 1～7），其中motif 1、motif 2和motif 4存在于6個(gè)CsSTOPs中，且6個(gè)CsSTOPs均含zf-C2H2保守結(jié)構(gòu)域。

2.3 CsSTOPs染色體定位和啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用TBtools軟件將鑒定到的6個(gè)CsSTOPs進(jìn)行染色體定位，結(jié)果表明（圖3），CsSTOPs不均等地定位到4條染色體上（1號(hào)、4號(hào)、9號(hào)、11號(hào)），其中CsSTOP1、CsSTOP2、CsSTOP3分別定位到1號(hào)、4號(hào)、9號(hào)染色體上，CsSTOP4、CsSTOP5均定位到11號(hào)染色體上。

對(duì)CsSTOPs啟動(dòng)子順式作用元件進(jìn)行分析，結(jié)果表明（圖4），CsSTOPs除了具有典型核心啟動(dòng)子元件TATA-box及啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域中常見(jiàn)元件CAAT-box外，還包含光響應(yīng)元件、生長(zhǎng)發(fā)育元件、激素響應(yīng)元件和非生物脅迫響應(yīng)元件。光響應(yīng)相關(guān)元件主要包括G-box、MRE、Box4、ATCT-motif、TCT-motif、GT1-motif；參與植物生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的元件包含一些組織特異性元件，例如分生組織表達(dá)（CAT-box）、種子特異調(diào)控（RY-element）、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)（O2-site）；激素類響應(yīng)元件主要涉及生長(zhǎng)素（AuxRR-core）、脫落酸（ABRE）、赤霉素（GARE-motif，TATC-box，P-box）、水楊酸（TCA-element）、茉莉酸甲酯（TGACG-motif，CGTCA-motif），其中生長(zhǎng)素響應(yīng)元件只分布于CsSTOP3，脫落酸響應(yīng)元件只分布于CsSTOP1；非生物脅迫的響應(yīng)元件主要包括干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件（MRE）、厭氧誘導(dǎo)必需元件（ARE）、低溫誘導(dǎo)響應(yīng)元件（LTR）及防御和應(yīng)激反應(yīng)元件（TC-rich repeats），其中厭氧誘導(dǎo)必需元件分布于每個(gè)CsSTOPs；除了CsSTOP2，干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件在其他5個(gè)CsSTOPs中都有分布；低溫誘導(dǎo)響應(yīng)元件僅分布于CsSTOP2和CsSTOP6。

2.4 CsSTOPs在不同器官及不同脅迫下的表達(dá)模式

2.4.1 CsSTOPs在茶樹(shù)不同器官中的表達(dá)模式

CsSTOPs在茶樹(shù)頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、根、莖、花和果實(shí)的表達(dá)情況如圖5所示，CsSTOP1、CsSTOP2、CsSTOP3在各個(gè)器官中的表達(dá)量相對(duì)較高，尤其是CsSTOP1表達(dá)水平明顯高于其他5個(gè)基因。CsSTOP1在果實(shí)、成熟葉、根中的表達(dá)量較高，CsSTOP2在頂芽、嫩葉、老葉、根和莖中的表達(dá)水平均較高，CsSTOP3在老葉和莖中的表達(dá)量較高，CsSTOP4、CsSTOP5、CsSTOP6均在根中的表達(dá)量相對(duì)較高。

2.4.2 CsSTOPs在不同脅迫下的表達(dá)模式

為了探究CsSTOPs在茶樹(shù)響應(yīng)不同脅迫過(guò)程中的調(diào)控作用，本研究分別對(duì)CsSTOPs在PEG誘導(dǎo)的干旱脅迫處理（0、24、48、72 h）、鹽脅迫處理（0、24、48、72 h）、茉莉酸甲酯處理（0、12、24、48 h），以及冷處理（非馴化CK、完全馴化CA1、去馴化CA3）后的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

在干旱脅迫下（圖6A），除了CsSTOP5，其余CsSTOPs均被不同程度地誘導(dǎo)表達(dá)，其中CsSTOP1、CsSTOP3、CsSTOP6的表達(dá)量隨干旱處理時(shí)間增加逐漸增加，在72 h時(shí)表達(dá)量最高。CsSTOP2、CsSTOP4在干旱處理24 h后表達(dá)量急劇增加，但處理48 h后表達(dá)量有所下降，CsSTOP2表達(dá)量在處理72 h后達(dá)到最高，CsSTOP4在處理72 h后表達(dá)水平略有升高。

在鹽脅迫處理下（圖6B），除了CsSTOP5，其余CsSTOPs均被不同程度地誘導(dǎo)表達(dá)，其中CsSTOP1、CsSTOP3的表達(dá)量隨鹽脅迫處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加，在72 h時(shí)表達(dá)水平最高。CsSTOP2、CsSTOP6在鹽脅迫處理24 h后表達(dá)量明顯提高，在處理48 h后表達(dá)水平降低，CsSTOP2、CsSTOP6在處理72 h后表達(dá)量略有升高，CsSTOP4的表達(dá)量在鹽脅迫處理24 h后略有上調(diào)，在48、72 h后逐漸下降。

在茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下（圖6C），CsSTOP1、CsSTOP2、CsSTOP3、CsSTOP4、CsSTOP6的表達(dá)量在MeJA處理12 h和24 h時(shí)被不同程度地抑制，其中CsSTOP1、CsSTOP2、CsSTOP3、CsSTOP4在MeJA處理48 h被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，CsSTOP6仍被抑制表達(dá)。CsSTOP5在MeJA處理12 h時(shí)被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，而后表達(dá)量逐漸下降。

在冷處理下（圖6D），CsSTOP2、CsSTOP4、CsSTOP5、CsSTOP6的表達(dá)量在CA1處理下急劇上調(diào)，CsSTOP3的表達(dá)量在CA1處理下略有上調(diào)，在CA3處理下被抑制表達(dá)。而CsSTOP1在CA1處理下的表達(dá)量沒(méi)有明顯變化，在CA3處理下的表達(dá)量急劇增加。

2.5 CsSTOPs對(duì)高NH4+濃度處理的響應(yīng)分析

選取茶樹(shù)中參與NH4+同化的關(guān)鍵基因—谷氨酰胺合成酶編碼基因（GS）和谷氨酸脫氫酶編碼基因（GDH），通過(guò)qRT-PCR分析高NH4+濃度處理下CsGS1s、CsGDH及6個(gè)CsSTOPs在茶樹(shù)成熟葉及根中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示（圖7和圖8），茶樹(shù)成熟葉中，幾乎所有CsSTOPs在高NH4+處理下的表達(dá)水平較對(duì)照顯著上調(diào)，大部分CsGS1s和CsGDHs的表達(dá)水平也顯著高于對(duì)照。在根中，高NH4+處理下CsSTOP1的表達(dá)水平略高于對(duì)照，大部分CsSTOPs的表達(dá)水平與對(duì)照差異不大，CsGDHs和CsGS1s的表達(dá)水平均略高于對(duì)照，其中CsGDH1和CsGS1.3差異較為明顯。

3 討論

STOP轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育及多種脅迫耐受機(jī)制中發(fā)揮重要作用，參與調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，也參與調(diào)控植物響應(yīng)酸鋁、鹽堿、水分、缺氧等各種逆境脅迫過(guò)程[1]。目前，STOP1已在多個(gè)植物中被克隆與分析，但多集中于模式植物擬南芥及草本植物，在木本植物中的相關(guān)研究較少，并且對(duì)STOP1功能研究多集中于植物耐酸鋁脅迫方面。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子STOP1在高NH4+濃度環(huán)境下可以通過(guò)直接促進(jìn)CIPK23蛋白激酶的表達(dá)而負(fù)調(diào)控AMT1的活性，從而避免過(guò)度吸收NH4+帶來(lái)的毒害作用[13，29]。由此說(shuō)明，轉(zhuǎn)錄因子STOP1在植物適應(yīng)高NH4+濃度環(huán)境中可能起著重要的調(diào)控作用。

本研究基于茶樹(shù)全基因組數(shù)據(jù)共鑒定出6個(gè)CsSTOPs，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，CsSTOPs與AtSTOP1、AtSTOP2、GhSTOP1、CisSTOP1、NtSTOP1等進(jìn)化關(guān)系較近。AtSTOP參與植物多種逆境脅迫過(guò)程，說(shuō)明CsSTOPs基因可能具有相似的功能。6個(gè)CsSTOPs具有典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)蛋白，啟動(dòng)子區(qū)域中包含許多激素響應(yīng)元件和非生物脅迫響應(yīng)元件，說(shuō)明CsSTOPs可能在茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及逆境脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。順式作用元件參與基因表達(dá)的調(diào)控，與基因功能密切相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)，NH4+升高可以顯著加速組織內(nèi)源ABA的積累，ABA通過(guò)增強(qiáng)抗氧化酶活性來(lái)降低NH4+誘導(dǎo)的氧化損傷[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，ABA響應(yīng)元件（ABRE）僅存在于CsSTOP1的啟動(dòng)子中，說(shuō)明CsSTOP1可能與茶樹(shù)適應(yīng)高NH4+環(huán)境密切相關(guān)?；虻慕M織表達(dá)特征可以在一定程度上反映基因的功能，研究指出，GmSTOP1-1、GmSTOP1-2和GmSTOP1-3在根中的表達(dá)量較高，超量表達(dá)GmSTOP1-3能夠提高轉(zhuǎn)基因株系的根表面積、總根長(zhǎng)和側(cè)根長(zhǎng)[6，31]。本研究發(fā)現(xiàn)，CsSTOPs在不同器官中的表達(dá)具有明顯的特異性，其中CsSTOP1在果實(shí)、成熟葉、根中的表達(dá)量最高，CsSTOP2在嫩葉中的表達(dá)量最高，CsSTOP3在老葉中的表達(dá)量最高，CsSTOP4、CsSTOP5、CsSTOP6均在根中的表達(dá)量最高。這些結(jié)果表明，CsSTOPs可能在茶樹(shù)的果實(shí)、花、葉片、根、莖中發(fā)揮不同作用，而CsSTOP1在3個(gè)器官中有較高的表達(dá)水平，其可能參與茶樹(shù)多個(gè)器官的生長(zhǎng)發(fā)育及相關(guān)生物學(xué)功能的調(diào)控。本研究分析發(fā)現(xiàn)，CsSTOPs能夠響應(yīng)多種脅迫過(guò)程，可能在茶樹(shù)響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

研究顯示，植物耐NH4+性和其NH4+同化能力有很大的關(guān)系，轉(zhuǎn)錄因子STOP1在植物耐NH4+性中起著重要作用[13]。GS和GDH是植物NH4+同化過(guò)程的關(guān)鍵基因，它們的表達(dá)和NH4+濃度的變化有很大關(guān)聯(lián)[26]。在擬南芥[32]和番茄[33]中，高NH4+濃度條件下，植株可以提高GS與GDH活性來(lái)增強(qiáng)對(duì)NH4+的利用。此外，在擬南芥鋁抗性研究中，STOP1能激活GDH表達(dá)，尤其是GDH2[34]。由此推測(cè)，STOP1可能與NH4+同化基因共同調(diào)控茶樹(shù)適應(yīng)高NH4+濃度環(huán)境過(guò)程。為進(jìn)一步探究CsSTOPs與茶樹(shù)適應(yīng)高NH4+濃度環(huán)境的關(guān)系，本研究對(duì)茶樹(shù)根及成熟葉中CsSTOPs及NH4+同化關(guān)鍵基因CsGS1s和GsGDHs在高NH4+濃度處理下的表達(dá)量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)成熟葉中CsSTOPs、CsGS1s和CsGDHs的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照，表明它們可能在茶樹(shù)適應(yīng)高NH4+濃度環(huán)境的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。高NH4+濃度處理下的茶樹(shù)成熟葉中CsGS1s和CsGDHs的變化趨勢(shì)與前人研究結(jié)果基本一致[26，35]。高NH4+濃度處理下，CsSTOP1在茶樹(shù)葉和根中的表達(dá)趨勢(shì)與CsGS1.1和CsGDH2基本一致，表明三者可能在調(diào)控茶樹(shù)適應(yīng)高NH4+濃度環(huán)境的機(jī)制中存在一定的相關(guān)性，為茶樹(shù)在NH4+濃度過(guò)高的環(huán)境中仍能保持正常生長(zhǎng)提供支撐。

參考文獻(xiàn)

14馬哲宇， 高可可， 李桂新， 等. STOP1介導(dǎo)多種逆境響應(yīng)分子機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 植物生理學(xué)報(bào)， 2023， 59（4）： 773-781.

Ma Z Y， Gao K K， Li G X， et al. Research progress of the molecular mechanisms of STOP1 in various stress responses [J]. Plant Physiology Journal， 2023， 59（4）： 773-781.

15Iuchi S， Koyama H， Iuchi A， et al. Zinc finger protein STOP1 is critical for proton tolerance in Arabidopsis and coregulates a key gene in aluminum tolerance [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2007， 104（23）： 9900-9905.

16Yamaji N， Huang C F， Nagao S， et al. A zinc finger transcription factor ART1 regulates multiple genes implicated in aluminum tolerance in rice [J]. Plant Cell， 2009， 21（10）： 3339-3349.

17Yoshinao O， Hiroki I， Yuriko K， et al. Characterization of AtSTOP1 orthologous genes in tobacco and other plant species [J]. Plant Physiology， 2013， 162（4）： 1937-1946.

18Luísa G A， César B， Pilar P， et al. Molecular characterization of TaSTOP1 homoeologues and their response to aluminium and proton （H+） toxicity in bread wheat （Triticum aestivum L.） [J]. BMC Plant Biology， 2013， 13（1）： 134. doi： 10.1186/1471-2229-13-134.

19叢亞輝， 王婷婷， 柳聚閣， 等. 大豆耐鋁毒候選基因GmSTOP1的克隆與表達(dá)分析[J]. 作物學(xué)報(bào)， 2015， 41（12）：1802-1809.

Cong Y H， Wang T T， Liu J G， et al. Cloning and expression analysis of tolerance to aluminum-toxicity candidate gene GmSTOP1 in soybean [J]. Acta Agronomica Sinica， 2015， 41（12）： 1802-1809.

20張寶云. 紫花苜蓿鋁脅迫響應(yīng)基因MsMATE與MsSTOP1的功能與表達(dá)調(diào)控研究[D]. 重慶： 重慶大學(xué)， 2017.

Zang B Y. Function and expression regulation of aluminum-responsive genes MsMATE and MsSTOP1 in Medicago sativa [D]. Chongqing： Chongqing University， 2017.

21羅佳佳， 向晨瑩， 劉攀道， 等. 柱花草SgSTOP1和SgSTOP2基因的克隆與表達(dá)分析[J]. 草業(yè)科學(xué)， 2019， 36（3）： 704-712.

Luo J J， Xiang C Y， Liu P D， et al. Cloning and expression analysis of SgSTOP1 and SgSTOP2 in Stylosanthes guianensis [J]. Pratacultural Science， 2019， 36（3）： 704-712.

22張永福， 徐仕琴， 陳姣， 等. 葡萄耐鋁毒基因STOP1的克隆與表達(dá)分析[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2022， 35（3）： 588-595.

Zhang Y F， Xu S Q， Chen J， et al. Cloning and expression analysis of tolerance to aluminum-toxicity gene STOP1 in Vitis [J]. Southwest China Journal of Agricultural Sciences， 2022， 35（3）： 588-595.

23Kobayashi Y， Ohyama Y， Kobayashi Y， et al. STOP2 activates transcription of several genes for Al- and low pH-tolerance that are regulated by STOP1 in Arabidopsis [J]. Molecular Plant， 2014， 7（2）： 311-322.

24Sadhukhan A， Enomoto T， Kobayashi Y， et al. Sensitive to proton rhizotoxicity1 regulates salt and drought tolerance of Arabidopsis thaliana through transcriptional regulation of CIPK23 [J]. Plant and Cell Physiology， 2019， 60（9）： 2113-2126.

25Enomoto T， Tokizawa M， Ito H， et al. STOP1 regulates the expression of HsfA2 and GDHs that are critical for low-oxygen tolerance in Arabidopsis [J]. Journal of Experimental Botany， 2019， 70（12）： 3297-3311.

26田文昊. 擬南芥STOP1蛋白協(xié)同氮磷營(yíng)養(yǎng)的分子機(jī)制研究[D]. 杭州： 浙江大學(xué)， 2021.

Tian W H. Mechanisms of nitrogen and phosphorus acquisition coordinated by STOP1 in Arabidopsis [D]. Hangzhou： Zhejiang University， 2021.

27方翔， 胡國(guó)策， 孫琪璐， 等. 氮素形態(tài)對(duì)茶樹(shù)葉片品質(zhì)及其氮代謝相關(guān)基因的影響[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2020， 48（2）： 52-59.

Fang X， Hu G C， Sun Q L， et al. Effects of nitrogen forms on tea quality and nitrogen metabolism related genes in tea leaves [J]. Journal of Northwest A & F University （Natural Science Edition）， 2020， 48（2）： 52-59.

28Britto D T， Kronzucker H J. NH4+ toxicity in higher plants： a critical review [J]. Journal of Plant Physiology， 2002， 159（6）： 567-584.

29Bittsánszky A， Pilinszky K， Gyulai G， et al. Overcoming ammonium toxicity [J]. Plant Science， 2015， 231（1）： 184-190.

30范子晗. 柑橘銨毒害產(chǎn)生機(jī)制及緩解措施研究[D]. 重慶： 西南大學(xué)， 2021.

Fan Z H. Study on the mechanism and relative alleviation measures of ammonium toxicity to citrus [D]. Chongqing： Southwest University， 2021.

31Tang D D， Liu M Y， Zhang Q F， et al. Preferential assimilation of NH4+ over NO3- in tea plant associated with genes involved in nitrogen transportation， utilization and catechins biosynthesis [J]. Plant Science， 2020， 29： 110369. doi： 10.1016/j.plantsci.2019.110369.

32Wang Y， Wang Y M， Lu Y T， et al. Influence of different nitrogen sources on carbon and nitrogen metabolism and gene expression in tea plants （Camellia sinensis L.） [J]. Plant Physiology and Biochemistry： PPB， 2021， 167（1）： 561-566.

33胡國(guó)策， 蔣家月， 田坤紅， 等. 氮素形態(tài)和水平對(duì)茶樹(shù)生理特性的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2018， 45（4）： 588-593.

Hu G C， Jang J Y， Tian K H， et al. Effects of nitrogen forms and nitrogen levels on the physiological characteristics of tea plants [J]. Journal of Anhui Agricultural University， 2018， 45（4）： 588-593.

34李勇. 茶樹(shù)響應(yīng)鋁的遺傳變異及鋁富集候選基因挖掘[D]. 武漢： 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2017.

Li Y. The genetic variation of tea plant [Camellia sinensis （L.） O. Ktze.] in response to aluminum and candidate genes related to its Al accumulation [D]. Wuhan： Huazhong Agricultural University， 2017.

35李營(yíng)營(yíng). 茶樹(shù)根系酸鋁脅迫與茶氨酸合成積累的相關(guān)性研究[D]. 合肥： 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2019.

Li Y Y. Study on the correlation between aluminum stress under acidic conditions and theanine synthesis and accumulation in roots of tea plant （Camellia sinensis L.） [D]. Hefei： Anhui Agricultural University， 2019.

36Ruan J Y， Gerendas J， H?rdter R， et al. Effect of root zone pH and form and concentration of nitrogen on accumulation of quality-related components in green tea [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture， 2007， 87（8）： 1505-1516.

37Newman L， Duffus A L J， Lee C. Using the free program MEGA to build phylogenetic trees from molecular data [J]. The American Biology Teacher， 2016， 78（7）： 608-612.

38Chen C J， Chen H， Zhang Y， et al. TBtools： an integrative toolkit developed for interactive analyses of big biological data [J]. Molecular Plant， 2020， 13（8）： 1194-1202.

39Tang D D， Jiao Z X， Zhang Q F， et al. Glutamate dehydrogenase isogenes CsGDHs cooperate with glutamine synthetase isogenes CsGSs to assimilate ammonium in tea plant （Camellia sinensis L.） [J]. Plant Science， 2021， 312： 111031. doi： 10.1016/j.plantsci.2021.111031.

40湯丹丹. 茶樹(shù)胞質(zhì)型谷氨酰胺合成酶基因CsGS1s的克隆及其對(duì)不同氮源的響應(yīng)[D]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2018.

Tang D D. Isolation of cytosolic glutamine synthetase genes CsGS1s and their experssion in tea plant （Camellia sinensis L.） under different nitrogen forms [D]. Beijing： Chinese Academy of Agricultural Sciences， 2018.

41Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the? method [J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

42Tian W H， Ye J Y， Cui M Q， et al. A transcription factor STOP1-centered pathway coordinates ammonium and phosphate acquisition in Arabidopsis [J]. Molecular Plant， 2021， 14（9）： 1554-1568.

43Sun L， Di D W， Li G， et al. Endogenous ABA alleviates rice ammonium toxicity by reducing ROS and free ammonium via regulation of the SAPK9-bZIP20 pathway [J]. Journal of Experimental Botany， 2020， 71（15）： 4562-4577.

44彭文婷. 大豆GmSTOP1s基因家族的克隆和功能研究[D]. 廣州： 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2016.

Peng W T. Isolation and function analysis of GmSTOP1s gene family [D]. Guangzhou： South China Agricultural University， 2016.

45韓慶芬， 陳海飛， 張振華. 不同生態(tài)型擬南芥耐銨毒害差異的生理機(jī)制[J]. 植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)， 2019， 25（7）： 1185-1193.

Han Q F， Chen H F， Zhang Z H， et al. Physiological mechanisms of tolerance to ammonium toxicity in different ecotypes of Arabidopsis thaliana [J]. Journal of Plant Nutrition and Fertilizers， 2019， 25（7）： 1185-1193.

46Vega-Mas I， Rossi M T， Gupta K J， et al. Tomato roots exhibit in vivo glutamate dehydrogenase aminating capacity in response to excess ammonium supply [J]. Journal of Plant Physiology， 2019， 239（1）： 83-91.

47Tokizawa M， Enomoto T， Ito H， et al. High affinity promoter binding of STOP1 is essential for early expression of novel aluminum-induced resistance genes GDH1 and GDH2 in Arabidopsis [J]. Journal of Experimental Botany， 2021， 72（7）： 2769-2789.

48Liu M Y， Tang D D， Shi Y Z， et al. Short-term inhibition of glutamine synthetase leads to reprogramming of amino acid and lipid metabolism in roots and leaves of tea plant （Camellia sinensis L.） [J]. BMC Plant Biology， 2019， 19（1）： 425. doi： 10.1186/s12870-019-2027-0.