北部灣植物內(nèi)生真菌的分離及次級(jí)代謝產(chǎn)物鑒定

王詩(shī)怡 王玉妃 劉江曄 劉碩 李子林 劉金燕 孔凡棟 王聰

摘要：目的 對(duì)北部灣3株藥用植物的內(nèi)生真菌進(jìn)行研究，研究小葉海金沙內(nèi)生真菌Spegazzinia sp. MDCW-573次級(jí)代謝產(chǎn)物。方法 通過(guò)10倍稀釋法分離小葉海金沙、野牡丹和蓮子草的內(nèi)生真菌，對(duì)小葉海金沙內(nèi)生真菌Spegazzinia sp. MDCW-573的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，通過(guò)NMR、MS、ECD等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，采用DPPH法進(jìn)行化合物抗氧化活性檢測(cè)，采用微量二倍稀釋法進(jìn)行抑菌活性測(cè)試。結(jié)果 從3株植物中分離到內(nèi)生真菌171株，從Spegazzinia sp. MDCW-573的次級(jí)代謝產(chǎn)物中共分離得到異香豆素類化合物3個(gè)，其中化合物1為新化合物?；衔?對(duì)金黃色葡萄球菌及MRSA、化合物3對(duì)MRSA的抑菌活性MIC均為128 μg/mL。結(jié)論 化合物1～3都是首次從斯氏霉屬真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物分離獲得，化合物1是1個(gè)新化合物，化合物1和3具有抑菌活性。

關(guān)鍵詞：廣西北部灣；內(nèi)生真菌；Spegazzinia sp.；次級(jí)代謝產(chǎn)物

中圖分類號(hào)：R978.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Isolation and secondary metabolites identification of endophytic fungi from plants in the Beibu Gulf

Wang Shiyi， Wang Yufei， Liu Jiangye， Liu Shuo， Li Zilin， Liu Jinyan， Kong Fandong， and Wang Cong

（Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products， State Ethnic Affairs Commission， Guangxi Key Laboratory of Chemistry and Engineering of Forest Products， Guangxi Collaborative Innovation Center for Chemistry and Engineering of Forest Products， Key Laboratory of universities in Guangxi for Excavation and Development of Ancient Ethnomedicinal Recipes，

Guangxi Minzu University， Nanning 530006）

Abstract Objective The endophytic fungi of three medicinal plants in the Beibu Gulf were studied， and the secondary metabolites of Spegazzinia sp. MDCW-573 from Lygodium microphyllum （Cav.） R. Br. were also investigated. Methods The endophytic fungi Lygodium microphyllum （Cav.） R. Br.， Melastoma candidum D. Don and Alternanthera sessilis （L.） R. Br. ex DC. were isolated by the ten-fold dilution method. The secondary metabolites of Spegazzinia sp. MDCW-573 from Lygodium microphyllum （Cav.） R. Br. were isolated and purified. The structures were identified by NMR， MS and ECD methods. The antioxidant activity of the compounds was detected by the DPPH method， and the antibacterial activity was tested by the micro-double dilution method. Results A total of 171 strains of endophytic fungi were isolated from these three plants. Three isocoumarin compounds were isolated from the secondary metabolites of Spegazzinia sp. MDCW-573， among which compound 1 was a new compound. Compounds 1 and 3 displayed antibacterial activitiesagainst MRSA with the same MIC value of 128 μg/mL. The MIC of compound 1 against Staphylococcus aureus was 128 μg/mL. Conclusion Compounds 1～3 were isolated from the secondary metabolites of Spegazzinia sp. for the first time. Compound 1 is a new compound， and compounds 1 and 3 showed antibacterial activity.

Key words Beibu Gulf of Guangxi; Endophytic fungi; Spegazzinia sp.; Secondary metabolites

內(nèi)生真菌（endophyte）是一類生長(zhǎng)在宿主植物體中而不引起明顯病害現(xiàn)象的共生微生物。內(nèi)生真菌與宿主在長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中互惠共生[1-2]，宿主為內(nèi)生真菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，內(nèi)生真菌產(chǎn)生生物活性物質(zhì)使得宿主免受生物和非生物脅迫的影響，增強(qiáng)宿主在生存競(jìng)爭(zhēng)中的優(yōu)勢(shì)[3-5]。目前所知研究已報(bào)道的內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物有酚類、醌類、萜類、生物堿、類固醇、黃酮類、香豆素類[6]， 具有抗癌[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、抗炎[9]、抗菌[10]、抗結(jié)核[11]、抗糖尿病[12]、驅(qū)蟲(chóng)[13]等諸多有益生物活性。此外，還有研究證明內(nèi)生真菌可以與宿主植物產(chǎn)生相似的代謝物如類黃酮、皂苷、酚酸、萜烯等被認(rèn)為是結(jié)構(gòu)新穎、活性獨(dú)特化合物的重要來(lái)源[14]。

北部灣地處熱帶和亞熱帶，藥用植物資源豐富。蘇秀麗等[15]在黃花倒水蓮的1株鏈格孢屬HNLF-44內(nèi)生真菌發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)黃酮類物質(zhì)，DPPH清除率在80%以上，具有較強(qiáng)的清除活性。Luo等[16]在廣西地不容塊根的一株橘青霉DBR-9內(nèi)生真菌的發(fā)酵物中鑒定出2種活性聚酮類化合物，對(duì)于病原真菌具有較強(qiáng)抑制作用。宋靜靜等[17]發(fā)現(xiàn)夾竹桃的內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抑制水產(chǎn)病原菌生長(zhǎng)的作用。龔斌

等[18]發(fā)現(xiàn)廣西柳樹(shù)桑寄生的1株擬盤多毛孢屬內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)A549和H460具有較強(qiáng)抑制作用。

本研究選取小葉海金沙[Lygodium microphyllum （Cav.） R. Br.]、野牡丹[Melastoma candidum D. Don]和蓮子草[Alternanthera sessilis （L.） R. Br. ex DC.] 3種廣西藥用植物為研究對(duì)象。小葉海金沙藥用成分包括黃酮類、酚酸及酚苷類、甾類、萜類、揮發(fā)油等，具有抑菌及抗氧化降血糖等藥理作用[19]。野牡丹藥用成分包括甾體、黃酮、有機(jī)酸、萜類、酰胺類、氨基酸、酯類等，具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、降血糖等藥理活性[20]。蓮子草藥用成分包括黃酮類、萜類、甾醇類、有機(jī)酸類、氨基酸類、生物堿、酰胺等，具有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗肝炎、抑菌等藥理作用[21]。通過(guò)10倍稀釋法對(duì)3種藥用植物樣品進(jìn)行真菌分離，使用兩種培養(yǎng)基對(duì)獲得的菌株進(jìn)行發(fā)酵。通過(guò)菌株形態(tài)排重結(jié)合化學(xué)排重（HPLC、TLC）共獲得171株真菌。從中選取小葉海金沙的內(nèi)生真菌Spegazzinia sp. MDCW-573為目標(biāo)菌株，其次級(jí)代謝產(chǎn)物經(jīng)分離鑒定后得到3個(gè)異香豆素類化合物，化合物1是新化合物，抑菌和抗氧化活性測(cè)試表明化合物1與化合物3有抑菌活性，化合物2抑菌活性不顯著，3個(gè)化合物均未表現(xiàn)出顯著的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

小葉海金沙、野牡丹和蓮子草均采自廣西北部灣，小葉海金沙（21°54′16′′，108°36′49′′）、野牡丹（21°54′14′′，108°36′48′′）、蓮子草（21°54′5′′，108°36′50′′）。

1.1.2 分離培養(yǎng)基（氯霉素添加量為5 mg/100 mL）

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20.0 g/100 mL，葡萄糖2.0 g/

100 mL，瓊脂2.0 g/100 mL，海水素3.3 g/100 mL。

真菌2號(hào)培養(yǎng)基：味精1.0 g/100 mL，磷酸二氫鉀0.05 g/100 mL，海水素3.3 g/100 mL，酵母膏0.3 g/

100 mL，瓊脂2.0 g/100 mL，麥芽糖2.0 g/100 mL，葡萄糖1.0 g/100 mL，甘露醇2.0 g/100 mL。

孟加拉紅培養(yǎng)基：瓊脂2.0 g/100 mL，孟加拉紅3.6 g/100 mL，海水素3.3 g/100 mL，pH 7.0。

1.1.3 發(fā)酵培養(yǎng)基

真菌2號(hào)培養(yǎng)基：味精1.0 g/100 mL，磷酸二氫鉀0.05 g/100 mL，海水素3.3 g/100 mL，酵母膏

0.3 g/100 mL，瓊脂2.0 g/100 mL，麥芽糖2.0 g/100 mL，

葡萄糖1.0 g/100 mL，甘露醇2.0 g/100 mL。

大米培養(yǎng)基：大米80 g，海水120 mL。

1.1.4 試劑和儀器

HCB-1300V潔凈工作臺(tái)（青島海爾特種電器有限公司）；Agilent 1260 HPLC（美國(guó)Agilent公司）；硅膠板（青島海洋化工廠）；AL104分析天平（瑞士梅特勒公司）；YXQ-LS-75SII 高壓滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；半制備C18柱（Nacalai tesque公司）; Brucker AVANCE 400 MHz核磁共振波譜儀（美國(guó)Brucker公司）；MAGNA-1R550傅里葉變換紅外光譜（Thermo公司）；K3 TOUCH酶標(biāo)儀（飛世爾實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；CR-080R 型春霖超聲波清洗機(jī)（深圳市春霖清洗設(shè)備有限公司）；LRH-500A生化培養(yǎng)箱（廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司）；Mariner API-TOF型質(zhì)譜儀（美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Agilent Cary 60紫外可見(jiàn)光譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；提取分離用乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司）均為工業(yè)用化學(xué)純產(chǎn)品。

1.2 樣品預(yù)處理與菌株分離及保藏

樣品預(yù)處理：將樣品用自來(lái)水沖洗干凈后帶入超凈臺(tái)，用無(wú)菌水將植物樣品洗凈后取其根、莖、葉和花各部位的一小部分加入適量無(wú)菌水進(jìn)行研磨，用無(wú)菌槍頭吸取10 mL于離心管作為母液。取1 mL母液加9 mL無(wú)菌水混合即得10倍稀釋液。

菌株分離：采用10倍稀釋法分離純化樣品真菌，各取1 mL稀釋液均勻地涂布于3種分離培養(yǎng)基平板（孟加拉紅培養(yǎng)基、真菌2號(hào)培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基），每個(gè)稀釋度涂布兩個(gè)平板，放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d。挑取培養(yǎng)基中的單菌落進(jìn)行純化，若出現(xiàn)染菌則挑取此菌落做進(jìn)一步劃線分離，重復(fù)操作直至獲得單菌落。

菌株保藏：將純化得到的菌株接入PDA斜面培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)后于4 ℃冰箱進(jìn)行斜面保藏; 將純化菌株接入含有20%甘油的PDA液體培養(yǎng)基甘油管，28 ℃恒溫培養(yǎng)后于-20 ℃冰箱進(jìn)行甘油管保藏。

1.3 菌株的篩選

1.3.1 菌株發(fā)酵

保藏于斜面的菌株接種到滅菌的真菌二號(hào)培養(yǎng)基及大米培養(yǎng)基中靜置發(fā)酵30 d。

1.3.2 菌株鑒定

植物內(nèi)生真菌MDCW-573菌株鑒定，包括基因組DNA的提取、擴(kuò)增、純化和測(cè)序，均在上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行?；谛螒B(tài)及生理生化特征、運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)真菌ITS序列進(jìn)行比較，運(yùn)用軟件MEGA（Version 7.0）對(duì)菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行繪制。

1.3.3 發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離

大米培養(yǎng)基下發(fā)酵：發(fā)酵結(jié)束后將大米搗碎，用等體積的乙酸乙酯浸泡并超聲萃取3次，經(jīng)減壓濃縮得浸膏。真菌二號(hào)培養(yǎng)基下發(fā)酵：加入等體積乙酸乙酯并用破碎機(jī)破碎，超聲萃取3次后減壓濃縮得浸膏。

1.4 活性測(cè)試

1.4.1 抗氧化活性測(cè)試

采用DPPH法測(cè)定化合物的抗氧化活性[22]，評(píng)價(jià)其自由基清除能力。以MeOH為溶劑，分別配制

20 μmol/L樣品溶液（a）和VC溶液（b）及0.15 μmol/L的DPPH溶液（c）。將樣品+DPPH（160 μL a + 40 μL c）、樣品對(duì)照（160 μL a + 40 μL MeOH）、VC+DPPH（160 μL b + 40 μL c）、陽(yáng)性對(duì)照（160 μL b + 40 μL MeOH）、陰性對(duì)照（160 μL MeOH + 40 μL c）、空白（200 μL MeOH）加至96孔板，每孔設(shè)置3個(gè)平行。使用酶標(biāo)儀測(cè)量517 nm處的A值，自由基清除率采用以下公式計(jì)算：

清除率=[A陰性對(duì)照-（A樣品+DPPH-A樣品對(duì)照）]/A陰性對(duì)照×100%

1.4.2 抑菌活性測(cè)試

采用微量二倍稀釋法對(duì)化合物進(jìn)行抑菌活性評(píng)價(jià)[23]， 96孔板中加入100 μL稀釋100倍的菌液，測(cè)試藥物濃度為256～0.5 μg/mL。使用環(huán)丙沙星為陽(yáng)性對(duì)照，檢測(cè)化合物對(duì)金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）抑菌活性。

1.4.3 ECD計(jì)算

在Gaussian 09軟件中使用密度泛函理論（DFT）進(jìn)行計(jì)算[24]。具體步驟為：使用hyperchem軟件進(jìn)行初步構(gòu)象搜索，在B3LYP/6-31G（d）水平上進(jìn)行進(jìn)一步的幾何優(yōu)化，用SCRF/PCM方法在相同的DFT水平上評(píng)價(jià)了甲醇溶液的溶劑效應(yīng)，用B3LYP/6-31G（d）下的TDDFT計(jì)算了化合物甲醇中的電子激發(fā)能和旋轉(zhuǎn)強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離

采用10倍稀釋法從小葉海金沙、野牡丹和蓮子草等3種植物樣品中分離獲得171株真菌，形態(tài)見(jiàn)圖1，菌株分離情況統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖2。

（1）小葉海金沙（64株）： MDCW-428、MDCW-431、MDCW-440、MDCW-455、MDCW-458～460、MDCW-463～464、MDCW-475、MDCW-478、MDCW-479、MDCW-481、MDCW-484～485、MDCW-491～492、MDCW-496～497、MDCW-513～515、MDCW-517、MDCW-519、MDCW-522～523、MDCW-526～528、MDCW-532、MDCW-536～540、MDCW-541、MDCW-542、MDCW-545、MDCW-547、MDCW-548、MDCW-550、MDCW-554、MDCW-556～558、MDCW-560、MDCW-563、MDCW-565、MDCW-566、MDCW-571～575、MDCW-578、MDCW-581、MDCW-583～584、MDCW-586～588、MDCW-593、MDCW-595、MDCW-596～597。

（2）野牡丹（33株）： MDCW-433、MDCW-435、MDCW-468、MDCW-477、MDCW-480、MDCW-493、MDCW-495、MDCW-499、MDCW-502、MDCW-504、MDCW-505、MDCW-507、MDCW-511、MDCW-516、MDCW-525、MDCW-530、MDCW-543、MDCW-544、MDCW-546、MDCW-551、MDCW-552、MDCW-555、MDCW-559、MDCW-568、MDCW-579、MDCW-580、MDCW-582、MDCW-585、MDCW-589、MDCW-590、MDCW-591、MDCW-592、MDCW-605。

（3）蓮子草（74株）： MDCW-426～427、MDCW-429～430、MDCW-432、MDCW-434、MDCW-436～439、MDCW-442～462、MDCW-465～467、MDCW-469～474、MDCW-476、MDCW-482、MDCW-483、MDCW-486～490、MDCW-494、MDCW-498、MDCW-500～501、MDCW-503、MDCW-506、MDCW-508～510、MDCW-512、MDCW-518、MDCW-520～521、MDCW-524、MDCW-529、MDCW-531、MDCW-533～534、MDCW-539、MDCW-549、MDCW-553、MDCW-561～562、MDCW-564、MDCW-567、MDCW-569～570、MDCW-576～577、MDCW-594。

2.2 菌株鑒定

PCR擴(kuò)增MDCW-573菌株的ITS序列長(zhǎng)度為568 bp，與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的斯氏霉屬菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上處于同一分支如圖3所示，呈現(xiàn)出高度的相似性[25]。對(duì)其形態(tài)特征做進(jìn)一步觀察，發(fā)現(xiàn)與斯氏霉屬菌株的形態(tài)特征一致。故初步鑒定菌株MDCW-573（GenBank 登錄號(hào)OR 121523）為斯氏霉屬菌株，并命名為 Spegazzinia sp. MDCW-573。

2.3 化合物的分離與鑒定

對(duì)Spegazzinia sp. MDCW-573 （來(lái)源：小葉海金沙；真菌二號(hào)分離培養(yǎng)基；10倍稀釋菌液）真菌二號(hào)發(fā)酵培養(yǎng)基（發(fā)酵6 L）中的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離，采用凝膠柱色譜技術(shù)，以1：1的比例使用二氯甲烷和甲醇進(jìn)行洗脫，并進(jìn)行TLC檢測(cè)以合并共得到4個(gè)組分Fr.1～Fr.4。Fr.4通過(guò)HPLC半制備（C18半制備柱，甲醇：水 ＝ 45：55，流量4 mL/min）純化，得到化合物1 （21.2 mg，tR ＝ 9.0 min），2 （35.6 mg，tR ＝ 10.0 min），3 （11.3 mg，tR ＝ 20.0 min）。通過(guò)MS和NMR鑒定3個(gè)化合物分別為3-epi-lignicol，lignicol和6-demethylkigelin（圖4）。

化合物1：藍(lán)色固體；+47.6 （c 1.1， MeCN）；正離子高分辨質(zhì)譜HR-ESI-MS在m/z 241.0703給出準(zhǔn)分子離子峰[M+H]+，提示分子式為C11H12O6。紅外光譜給出羥基和羰基（3373 cm-1和1660 cm-1）等官能團(tuán)的特征吸收峰。UV（nm）： 306 （0.16）， 272 （0.43）， 218 （0.82）nm，

該化合物與已知化合物lignicol（2）[26]具有相同的紫外吸收，初步判斷其也為異香豆素類化合物?；衔?的13C-NMR（表1）和HSQC譜圖給出1個(gè)羰基碳（δC 171.3）、6個(gè)苯環(huán)或雙鍵碳（δC 158.4， 157.3， 139.1， 136.2， 108.5， 101.3）、2個(gè)含氧sp3次甲基（δC/H 79.8/4.63， 67.6/4.41）以及2個(gè)甲基（δC/H 60.9/3.84， 16.3/1.48），包括1個(gè)含氧甲基。這些數(shù)據(jù)與化合物2的核磁共振波譜數(shù)據(jù)非常相似[26]，只是化合物1中C-2、C-3和C-4的化學(xué)位移（δC 16.3、79.8和67.6）與化合物2中（δC 18.1、81.3和69.4）相比均向高場(chǎng)位移。化合物1的1H-1H COSY給出H-2/H-3的相關(guān)信號(hào)；其HMBC譜圖給出H-2與C-3、C-4，H-3與C-2、C-4，H-4與C-3、C-5、C-9、C-10，H-5與C-1、C-4、C-6、C-7、C-9，以及H-11與C-7的相關(guān)信號(hào)（圖5）。以上數(shù)據(jù)提示化合物1和2具有相同的平面結(jié)構(gòu)，區(qū)別僅是C-3和C-4位手性碳的相對(duì)構(gòu)型不同，故化合物1的H-3和H-4被確定為同面，與化合物2中相反。1的絕對(duì)構(gòu)型是通過(guò)量子化學(xué)ECD計(jì)算確定的，計(jì)算和擬合結(jié)果顯示化合物1的實(shí)測(cè)ECD譜圖和（3S，4S）-1的計(jì)算譜圖具有較好的吻合（圖6），證明化合物的絕對(duì)構(gòu)型為3S和4S?；衔?的名字命名為3-epi-lignicol。

化合物2：白色固體，ESI-MS： m/z 241.0 [M+H]+，分子式為C11H12O6，比旋光值+38.6 （c 2.8， MeCN）。1H NMR（CD3OD，400 MHz）δ： 6.60（1H，s，H-5），4.44（2H，m，H-3，4），3.83（3H，s，H-11），1.44（3H，d，J = 5.9 Hz，H-2）；13C-NMR（CD3OD，100 MHz） δ： 170.4（s，C-1），158.7（s，C-6），157.3（s，C-8），140.2（s，C-10），135.6（s，C-7），106.5（d，C-5），100.8 （s，C-9），81.3（d，C-3），69.4（d，C-4），60.9（q，C-11），18.1（q， C-2）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]對(duì)比，鑒定化合物2為 lignicol。

化合物3：白色固體，ESI-MS： m/z 225.0 [M+H]+，分子式為C11H12O5，比旋光值-35.3 （c 0.9， MeOH）。1H NMR（CD3OD，400 MHz）δ： 6.28（1H，s，H-5），4.68～4.63（1H，m，H-3），3.82（3H，s，H-11），2.90～2.75（2H，m，H-4），1.46（3H，d，J= 6.2 Hz，H-2）；13C NMR（CD3OD，100 MHz）δ： 171.8（s，C-1），158.4（s，C-8），157.6（s，C-6），137.5（s，C-10），135.0（s，C-7），107.8（d，C-5），102.2（s，C-9），77.6（d，C-3），60.9（q，C-11），35.1（t，C-4），20.8（q，C-2）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]對(duì)比，鑒定此化合物3為6-demethylkigelin。

2.4 活性測(cè)試結(jié)果

2.4.1 抗氧化活性測(cè)試結(jié)果

在20 μmol/L的濃度下3個(gè)化合物均不顯示明顯的抗氧化活性，其DPPH清除率分別是6.9%、26.1%和13.5%，陽(yáng)性對(duì)照VC的清除率為92.1%。

2.4.2 抑菌活性測(cè)試結(jié)果

對(duì)3個(gè)單體化合物進(jìn)行抑菌活性測(cè)試后，發(fā)現(xiàn)化合物1、3對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制活性，此外化合物1還對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有抑制活性?；衔?、3的最小抑菌濃度（MIC）如表2所示。

3 討論

本研究通過(guò)10倍稀釋法從來(lái)源于廣西北部灣的3種藥用植物小葉海金沙、野牡丹、蓮子草中分離獲得了171株真菌，其中10倍稀釋液分離真菌數(shù)量多于母液。對(duì)從小葉金海沙中分離的內(nèi)生真菌Spegazzinia sp. MDCW-573的真菌2號(hào)液體發(fā)酵次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離鑒定，獲得3個(gè)異香豆素類化合物且化合物1為新化合物?；衔?對(duì)金黃色葡萄球菌及MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）具有抑菌活性，MIC為128 μg/mL?；衔?對(duì)MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）具有抑菌活性，MIC為128 μg/mL。化合物1～3均不顯示明顯的抗氧化活性。

4， 6， 8-三羥基-7-甲氨基-3-甲基二氫異香豆素（lignicol）首次分離于柱頂孢霉屬Scytalidium sp.，而后又在Parapyenchaeta sp. SGSF449的發(fā)酵物中被分離。本研究首次從斯氏霉屬Spegazzinia sp.菌株中分離得到lignicol。以往研究證明lignicol對(duì)于丁香假單胞菌（P. syringae）、水稻黃單胞菌（X. oryzae）、青枯勞爾菌（R. solanacearum）有微弱的抗菌活性，MIC為500 μg/mL。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在藥物濃度為256～0.5 μg/mL下其對(duì)金黃色葡萄球菌和MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）無(wú)明顯抑菌活性。

6-demethylkigelin可作為植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑抑制高濃度下IAA對(duì)植物根生長(zhǎng)的抑制作用。以往研究表明該化合物對(duì)丁香假單胞菌（P. syringae）、青枯勞爾菌（R. solanacearum）、甘藍(lán)黑腐黃單胞菌（X. campestrus）、水稻黃單胞菌（X. oryzae）具有微弱的抑菌活性MIC為500 μg/mL。本研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)MRSA（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）具有抑菌活性，MIC為128 μg/mL。

目前對(duì)于廣西北部灣植物內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物活性研究相對(duì)較少，以前的研究多數(shù)停留在菌株分離鑒定及粗提物活性初篩上，對(duì)菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究尚不深入。迄今為止，針對(duì)斯氏霉屬真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物研究很少，本研究得到的3個(gè)化合物均為首次從斯氏霉屬真菌中分離得到，本研究結(jié)果極大豐富了斯氏霉屬內(nèi)生真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物多樣性研究，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用北部灣真菌資源打下了基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

Ding Y， Zhu X J， Hao L L， et al. Bioactive indolyl diketopiperazines from the marine derived endophytic Aspergillus versicolor DY180635[J]. Mar Drugs， 2020， 18（7）： 338.

Badawy A A， Alotaibi M O， Abdelaziz A M， et al. Enhancement of seawater stress tolerance in barley by the endophytic fungus Aspergillus ochraceus[J]. Metabolites， 2021， 11（7）： 428.

Wang L S， Zong S K， Wang H T， et al. Dothideomins A-D， antibacterial polycyclic bisanthraquinones from the endophytic fungus Dothideomycetes sp. BMC-101[J]. J Nat Prod， 2022， 85（12）： 2789-2795.

Shi L J， Wu Y M， Yang X Q， et al. The cocultured nigrospora oryzae and collectotrichum gloeosporioides， irpex lacteus， and the plant host dendrobium officinale bidirectionally regulate the production of phytotoxins by anti-phytopathogenic metabolites[J]. J Nat Prod， 2020， 83（5）： 1374-1382.

Abdelaziz A M， Elwakil D A， Attia M S， et al. Inhibition of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in Zea mays L. using endophytic Aspergillus fumigatus[J]. J Fungi， 2022， 8（5）： 482.

Manganyi M C， Ateba C N. Untapped potentials of endophytic fungi： A review of novel bioactive compounds with biological applications[J]. Microorganisms， 2020， 8（12）： 1934.

Usama W H， Lamia T， Abouei-kassem T L. Anticancer and antiviral diketopiperazine produced by the red sea endophytic fungus Penicillium chrysogenum[J]. Lett Org Chem. 2019， 16（5）： 409-414.

Rauf M， Ur-rahman A， Arif M， et al. Immunomodulatory molecular mechanisms of luffa cylindrica for downy mildews resistance induced by growth-promoting endophytic fungi[J]. J Fungi， 2022， 8（7）： 689.

Tan Y Z， Guo Z K， Zhu M Y， et al. Anti-inflammatory spirobisnaphthalene natural products from a plant-derived endophytic fungus Edenia gomezpompae[J]. Chin Chem Lett， 2020， 31（6）： 1406-1409.

Deshmukh S K， Gupta M K， Prakash V， et al. Endophytic fungi： a source of potential antifungal compounds[J]. J Fungi， 2018， 4（3）： 77.

Wijeratne E M K， He H， Franzblau S G， et al. Phomapyrrolidones A-C， antitubercular alkaloids from the endophytic fungus PhoIma sp. NRRL 46751[J]. J Nat Prod. 2013， 76（10）： 1860-1865.

Agrawal S， Samanta S， Deshmukh S K. The antidiabetic potential of endophytic fungi： Future prospects as therapeutic agents[J]. Biotechnol Appl Biochem. 2022， 69（3）： 1159-1165.

Zhang P， Yuan X L， Du Y M， et al. Angularly prenylated indole alkaloids with antimicrobial and insecticidal activities from an endophytic fungus Fusarium sambucinum TE-6L[J]. J Agric Food Chem. 2019， 67（43）： 11994-20001.

Singh A， Singh D K， Kharwar R N， et al. Fungal endophytes as efficient sources of plant-derived bioactive compounds and their prospective applications in natural product drug discovery： Insights， avenues， and challenges[J]. Microorganisms， 2021， 9（1）： 197.

蘇秀麗， 李惠敏， 唐輝， 等. 黃花倒水蓮內(nèi)生真菌生物活性評(píng)價(jià)及HNLF-44菌株鑒定[J]. 廣西植物， 2023， 43（1）： 88-95.

黃浩， 黃哲， 韋瑩， 等. 特色壯藥廣西地不容研究進(jìn)展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2023， 43（5）： 38-44.

宋靜靜， 羅美苗， 李露， 等. 廣西夾竹桃內(nèi)生真菌的多樣性和抑制幾種水產(chǎn)病原菌活性篩選[J]. 廣西植物， 2023， 43（1）： 148-154.

龔斌， 巫鑫， 韋婷， 等. 廣西柳樹(shù)桑寄生內(nèi)生真菌的分離鑒定與抗腫瘤活性菌株篩選[J]. 廣西植物， 2017， 37（5）： 634-641.

趙鵬輝， 鞏江， 高昂， 等. 海金沙的鑒別及藥學(xué)研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011， 39（14）： 8380-8381.

胡營(yíng)， 唐美瓊， 冀曉雯， 等. 廣西野牡丹科藥用植物資

源[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥， 2017， 28（9）： 2232-2235.

馬卓， 李瓊婭， 范文乾， 等. 蓮子草屬藥用植物的研究進(jìn)

展[J]. 化學(xué)與生物工程， 2008， （2）： 1-6.

Liu P P， Wang C， Lu Z Y， et al. New isochromane derivatives from the mangrove fungus Aspergillus ustus 094102 [J]. Nat Prod Commun， 2015， 10（12）： 2123-2126.

陳默， 王志偉， 胡長(zhǎng)鷹， 等. 酶標(biāo)儀法快速評(píng)價(jià)香蘭素的抑菌活性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)， 2009， 35（5）： 63-66.

Sai C M， Li D H， Xue C M， et al. Two pairs of enantiomeric alkaloid dimers from macleaya cordata[J]. Org lett， 2015， 17（16）： 4102-4105.

Samarakoon B C， Phookamsak R， Wanasinghe D N， et al. Taxonomy and phylogenetic appraisal of Spegazzinia musae sp. nov. and S. deightonii （Didymosphaeriaceae， Pleosporales） on Musaceae from Thailand[J]. MycoKeys， 2020， 70： 19-37.

Ayer W A， Lu P P， Orszanska H. Deoxyscytalidin and lignicol： New metabolites from scytalidium species[J]. J Nat Prod， 1993， 56（10）： 1835-1838.

婁水珠， 朱婭寧， 馬肖燕， 等. 表觀遺傳試劑誘導(dǎo)滇重樓內(nèi)生真菌Hypomyces sp. CLG4次生代謝產(chǎn)物的研究[J]. 云南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2021， 30（1）： 17-21.