針刀干預對膝骨關節(jié)炎模型兔膝關節(jié)軟骨應力變化的影響

杜 玫 邢龍飛 胡庭堯 朱文婷 馬薇薇 郭長青

(北京中醫(yī)藥大學,北京,100029)

膝骨關節(jié)炎(Knee Osteoarthritis,KOA)是以膝關節(jié)疼痛、活動受限、腫脹、僵硬等為主要臨床癥狀的骨關節(jié)疾病[1]。關節(jié)軟骨是維持膝關節(jié)功能的重要因素,其正常的力學環(huán)境對維持關節(jié)的穩(wěn)定性具有重要意義[2]。KOA發(fā)病機制復雜,生物力學因素是誘發(fā)KOA及其形成過程中的關鍵因素,膝關節(jié)力學的失衡導致局部關節(jié)軟骨承受的應力異常,加劇軟骨的磨損、疼痛,導致軟骨退變誘發(fā)KOA[3]。在此過程中,軟骨的化學成分、結構以及其他力學特征都發(fā)生顯著變化,使得其液體承載能力和纖維的抗拉伸能力受到嚴重削弱,從而引起軟骨變形、細胞凋亡以及纖維衰減[4-5]。由于關節(jié)軟骨出現(xiàn)破壞,滑膜細胞、軟骨細胞產(chǎn)生的炎癥介質作用于神經(jīng)元,引發(fā)疼痛[6]。研究表明,白細胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)在膝關節(jié)骨性關節(jié)炎疾病的發(fā)生發(fā)展中起著關鍵作用,作為炎癥介質二者協(xié)同激活炎癥信號通路后迅速傳遞信號,導致大量相關基因表達,增加炎癥介質、趨化因子、黏附因子以及酶分泌,加重關節(jié)炎癥和疼痛,導致關節(jié)軟骨破壞程度加劇,加速KOA進程,最終對關節(jié)的功能產(chǎn)生不利影響[7]。因此,恢復膝關節(jié)軟骨正常應力、抑制炎癥介質釋放是延緩軟骨退變從而治療KOA的有效方法。

前期研究已證實,針刀“調筋”可有效調節(jié)肌肉-肌腱力學特性進而恢復關節(jié)良性應力環(huán)境,改善軟骨組織合成和分解以緩解軟骨退變,發(fā)揮針刀“治骨”的作用[8]。但針刀對膝關節(jié)軟骨力學方面以及滑膜液炎癥介質的直接影響尚不清楚。本研究意在通過觀察針刀干預后膝關節(jié)、關節(jié)軟骨應力變化、軟骨形態(tài)學變化及炎癥介質表達的變化,分析針刀干預對軟骨受力、退變的影響,進一步探討針刀治療KOA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康24周齡的清潔級新西蘭雄性兔28只,體質量2.0～2.5 kg,分籠飼養(yǎng),室溫保持(20±2)℃,濕度為40%～60%,自然光線充足照射,標準飲食供給,自由攝食飲水,實驗室定期進行紫外線消毒。實驗場地由北京富龍騰飛實驗動物研究院有限公司提供,合格證號：SYXK(京)2018-0041。本研究通過實驗動物倫理委員會審批(倫理審批號：BUCM-4-2022010101-1097)。

1.1.2 試劑與儀器 3%戊巴比妥鈉溶液(Sigma,德國,貨號：P1110);乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid,EDTA)脫鈣液(塞維爾公司,貨號：G1105);蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染液套裝(塞維爾公司,貨號：G1003);磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)(塞維爾公司,貨號：G0002);酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒(南京建成生物工程研究有限公司,貨號：CB10058-Rb、CB10011-Hs);一次性無菌針灸(蘇州針灸用品有限公司,規(guī)格：0.2 mm×13 mm);韓氏穴位神經(jīng)刺激儀(北京華衛(wèi),型號：LH202);一次性針刀(北京卓越華友醫(yī)療器械有限公司,規(guī)格：0.3 mm×30 mm);臺式高速冷凍離心機[大龍興創(chuàng)實驗儀器(北京)股份公司,型號：D3024];酶標檢測儀(BioTeK,美國,型號：Epoch);磁共振成像系統(tǒng)(飛利浦,日本,型號：Achieva3.0T)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選取健康清潔級24周齡雄性新西蘭兔28只,適應性飼養(yǎng)7 d后,將實驗動物按照隨機數(shù)字表法隨機分為空白組、模型組、針刀組、電針組4組,每組7只?？瞻捉M正常飼養(yǎng),對模型組、電針組、針刀組進行兔左下肢制動。造模前對兔禁食,持續(xù)10～16 h,禁食結束后對耳緣靜脈進行消毒,以30 mg/kg的標準確定劑量后進行麻醉。麻醉后,將兔仰臥位固定,將其左后肢牽拉至伸直位,保證膝關節(jié)處于180°伸直位、踝關節(jié)則保持背屈60°。將高分子繃帶軟化后,從腹股溝纏繞至足踝部進行固定；留出兔足趾部分以便觀察其供血情況。為防止兔啃咬破壞模型，使用透明膠紙在外部進行纏繞，保護高分子繃帶[9]。定期觀察模型損壞、松動情況以及兔左下肢供血情況，有效制動持續(xù)6周。

1.2.2 干預方法 拆除各組固定后開始進行干預。1)空白組：正常飼養(yǎng),不作任何處理,每天正常抓取。2)模型組：造模后每天正常抓取。3)電針組：造模成功后,根據(jù)《實驗針灸學》動物穴位定位,取以下四穴進行干預：梁丘、血海、內膝眼、外膝眼。采用0.2 mm×13 mm一次性無菌針灸對上述腧穴進行治療,選用波形疏密波行電針治療,強度3 mA,頻率2/100 Hz,20 min/次,隔天治療1次,治療3周。4)針刀組：造模成功后,選取兔膝關節(jié)股內外側肌肌腱止點、股直肌肌腱止點、股二頭肌肌腱止點及鵝足滑囊處為治療點。常規(guī)備皮、消毒后,選用規(guī)格0.3 mm×30 mm一次性針刀刺入,針刀刀刃平行于肌腱,刀體與皮膚切面垂直,刺入后沿肌腱與骨連接方向進行松解,出針刀后進行按壓止血。治療頻率為1次/周,治療3周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 取材 各組動物于KOA模型制備前、造模后、治療結束后分別以3%戊巴比妥麻醉,采用3.0T MRI對兔患側膝關節(jié)進行活體掃描,獲取相關MRI圖像數(shù)據(jù)。治療結束后將各組動物以3%戊巴比妥麻醉過量致死后提取家兔左后肢關節(jié)液。切開、分離皮下組織后,暴露髕骨韌帶。膝關節(jié)彎曲45°,選取髕骨韌帶中部和股骨下緣進入針頭,在膝關節(jié)充分彎曲和拉伸后將關節(jié)液收集到凍干管中,在4 ℃下以1 000 r/min,離心半徑15 cm,離心15 min,去除細胞和關節(jié)碎片,于-80 ℃下保存。打開關節(jié)腔,在無菌環(huán)境中使用直徑4 mm的環(huán)鉆對關節(jié)軟骨面進行操作。從兔膝關節(jié)脛骨和股骨軟骨面的中心負重區(qū)垂直切割出圓柱狀的軟骨-軟骨下骨結合體組織塊,鉆取深度為3 mm。

1.2.3.2 光鏡HE染色觀察軟骨組織 對組織塊進行沖洗,使用生理鹽水清潔其附著的血液、黏液及污物等,浸入4%多聚甲醛溶液中固定72 h。將軟骨標本進行脫鈣、脫水、透明、透蠟后進行石蠟包埋,切片4 μm,進行HE染色,在光鏡下觀察兔膝關節(jié)軟骨,并參照Mankin評分標準進行評估。

1.2.3.3 ELISA檢測 采用ELISA法測定滑膜液中IL-1β和TNF-α的含量。取出冷凍的滑膜液,恢復至室溫后離心取上清液。樣品按照ELISA試劑盒程序進行檢測,用酶標記儀器在450 nm處測量吸光度值。通過與標準物質比較,計算IL-1β和TNF-α的含量。

1.2.3.4 關節(jié)軟骨接觸面間壓力分布測試 導入核磁掃描文件Dicom,可以得到3種方位視圖,一是軸向視圖,第二、三為矢狀面、冠狀面,由切層數(shù)據(jù)獲得。調節(jié)閾值范圍使得模型各斷層面達到最高清晰度后生成3D模型,點擊Smooth調整模型表面光滑度、完整度,實現(xiàn)各部分整體表面盡可能符合實體,如此便可獲得較為逼真的兔膝關節(jié)3D模型。見圖1。將處理好的3D模型保存為Stl文件,導入到Ansa軟件中進行有限元前處理。進入軟件點擊表面化處理(To surface)功能生成幾何模型,根據(jù)不同部位進行拆分、定義,生成殼網(wǎng)格。網(wǎng)格單元多位四邊形、少數(shù)三角形,即定義其為混合單元。將殼模型定義為實體模型,并將其劃分為四面體網(wǎng)格模型。對各部分賦予相應的材料彈性模量及泊松比[9](表1)。建立接觸面集合(Set),根據(jù)實際情況將緊密連接的面設定為綁定(Tie)關系。

表1 兔膝關節(jié)有限元模型中各組成部分材料參數(shù)

圖1 兔膝關節(jié)3D模型

2 結果

2.1 各組兔軟骨HE光鏡觀察結果比較 在空白組兔的膝關節(jié)軟骨中,可以清晰觀察到表淺層、移行層、輻射層以及鈣化層。這4部分從淺至深的結構完整且明確,潮線清晰可見;細胞核、細胞質均清晰可見,分別呈藍紫色、紫紅色;未觀察到軟骨細胞聚集及血管通過。鈣化層軟骨可觀察到少量血管。模型組兔膝關節(jié)軟骨結構混亂,4層結構模糊不清,表層和移形層軟骨出現(xiàn)分層剝落,部分區(qū)域剝離到輻射層;潮線扭曲且不規(guī)則,可觀察到有血管延伸至非鈣化層軟骨。電針組兔膝關節(jié)軟骨組織結構尚清晰,軟骨表面可見不規(guī)則及部分剝脫,部分細胞出現(xiàn)凋亡,潮線模糊不清,未觀察到血管翳的產(chǎn)生。針刀組兔膝關節(jié)軟骨結構明顯,但是軟骨表面并不完全平滑。同時,軟骨細胞的層次分布也比較均勻,潮線呈現(xiàn)出規(guī)則且清晰的特點,偶有重復的潮線出現(xiàn)。此外,有少數(shù)血管穿過至非鈣化層軟骨,但是未觀察到血管翳形成。見圖3。

圖3 各組兔膝關節(jié)軟骨組織病理觀察(HE染色,×200)

2.2 各組兔軟骨Mankin評分 造模后,與空白組比較,模型組兔軟骨Mankin評分升高(P<0.05)。進行干預后,電針組、針刀組兔軟骨Mankin評分較模型組降低(P<0.05);針刀組較電針組兔軟骨Mankin評分降低更為明顯(P<0.05)。見表2。

表2 各組兔關節(jié)軟骨Mankin評分比較

2.3 各組兔膝關節(jié)滑液中炎癥介質水平比較 與空白組比較,模型組TNF-α、IL-1β水平均顯著升高(P<0.01);與模型組比較,電針組、針刀組TNF-α、IL-1β水平均顯著降低(P<0.01),且針刀組明顯低于電針組(P<0.01)。見表3。

表3 各組兔膝關節(jié)滑液中TNF-α、IL-1β水平比較

2.4 各組兔有限元結果分析 與空白組比較,模型組膝關節(jié)整體應力顯著降低(P<0.01)、關節(jié)軟骨最大應力顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);與模型組比較,電針組和針刀組膝關節(jié)整體應力、關節(jié)軟骨最大應力均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);針刀組與電針組比較,膝關節(jié)整體應力和關節(jié)軟骨最大應力均增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組兔膝關節(jié)整體應力及關節(jié)軟骨最大應力數(shù)據(jù)見表4。與空白組比較,模型組膝關節(jié)整體應力、關節(jié)軟骨最大應力均顯著降低(P<0.01),對比空白組與模型組應力云圖可以觀察到,關節(jié)軟骨表面存在明顯的應力集中區(qū)域,主要出現(xiàn)在膝關節(jié)內側,且模型組應力集中趨勢較空白組更加明顯,應力分布出現(xiàn)明顯的不均勻分布;與模型組比較,電針組和針刀組膝關節(jié)整體應力、關節(jié)軟骨最大應力均升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);針刀組與電針組比較,膝關節(jié)整體應力和關節(jié)軟骨最大應力均增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);觀察電針組、針刀組應力云圖可發(fā)現(xiàn),針刀組較電針組應力分布更加均勻、應力集中區(qū)域減少。各組兔關節(jié)軟骨應力云圖見圖4。

表4 各組兔膝關節(jié)整體應力及關節(jié)軟骨最大應力比較

圖4 KOA兔膝關節(jié)屈曲60°關節(jié)軟骨最大應力

3 討論

KOA屬于中醫(yī)學“骨痹”“痹病”“膝痹”等范疇[10]。正常膝關節(jié)運動依賴于骨骼和韌帶提供的靜態(tài)穩(wěn)定性以及由肌肉產(chǎn)生的動態(tài)穩(wěn)定性來確保膝蓋部位良性壓力分布,以維持其健康狀態(tài)下軟骨合成與分解過程的平衡,并保護其功能正常[11]。若膝部周圍的軟組織出現(xiàn)力學異?；蛘呦リP節(jié)的動靜態(tài)失衡,《素問·痿論篇》曰“宗筋主束骨而利機關”的生理功能受到嚴重損害,關節(jié)軟骨會出現(xiàn)退變、磨損,削弱軟骨的抗拉伸能力,進而導致關節(jié)對位匹配不良、關節(jié)穩(wěn)定性下降,使應力集中更加明顯逐漸引發(fā)疼痛[12]。關節(jié)失穩(wěn)后異常應力環(huán)境加速軟骨退變,最終導致膝關節(jié)的骨骼受損,從而引發(fā)筋骨共病,惡性循環(huán)發(fā)展為KOA[13-14]。本團隊前期研究表明,針刀根據(jù)“以痛為輸”原則對軟組織損傷點即壓痛點進行松解,并在現(xiàn)代膝關節(jié)“力學平衡理論”指導下對膝周韌帶、肌肉-肌腱等高應力點進行松解,“調筋”可以有效地改善韌帶和肌腱的生物力學特性,同時能夠調節(jié)軟骨細胞的合成代謝過程,從而使得針刀發(fā)揮“治骨”作用[15-17]。

在正常的關節(jié)軟骨中,其基質內液會通過物理壓力的作用而與滑液互相轉換,從而為軟骨細胞提供必要的養(yǎng)分以保持其健康的形態(tài)、功能以及新陳代謝[18]。關節(jié)及軟骨受到的應力大小能夠在一定程度上調控細胞合成、分泌基質等正常生理活動。當軟骨受壓過大或關節(jié)負荷失衡,那么軟骨細胞和基質的構造就會遭受損害并導致軟骨的退化[19]。本團隊在前期研究中發(fā)現(xiàn),針刀能夠通過松解膝周高應力點改善軟骨彈性模量,但對整體膝關節(jié)及軟骨的應力變化研究還未涉及。因此,本實驗選擇有限元模擬進行膝關節(jié)整體及軟骨的應力分析。有限元分析法是一種理論型的模擬生物力學變化的研究方法,利用現(xiàn)代仿真技術建立逼真的兔膝關節(jié)模型,通過變化參數(shù)來模擬模型的力學變化情況,解決了傳統(tǒng)生物力學檢測中無法兼顧的全關節(jié)動態(tài)力學變化[20]。實驗結果顯示,與空白組比較,模型組膝關節(jié)整體應力及關節(jié)軟骨最大應力均明顯下降,同時HE染色觀察到,關節(jié)軟骨組織層次紊亂、出現(xiàn)分層剝脫、潮線扭曲并有血管通過,且到達非鈣化層軟骨,Mankin評分降低。當軟骨處于較低的應力環(huán)境時,由于缺乏充足的、生理性的應力刺激,使得軟骨細胞的功能受到抑制、軟骨基質的生成量減少。與此同時,軟骨細胞的病變也會促使其異常產(chǎn)生能夠引發(fā)基質金屬蛋白酶產(chǎn)生的細胞因子,該蛋白酶的增加會引起軟骨基質降解,這進一步增加了軟骨基質的損傷程度,同時也削弱了其形成能力。二者相互影響,最終導致軟骨損傷逐漸加重[21]。在實驗中我們發(fā)現(xiàn),有限元模擬檢測表明電針組、針刀組兔膝關節(jié)整體應力及軟骨最大應力均有提升;HE染色觀察到軟骨組織結構均有所改善,Mankin評分均有所升高,且針刀組較電針組更為顯著。因此可以推測針刀干預能夠恢復膝關節(jié)及軟骨應力,進而改善膝關節(jié)軟骨損傷程度。

IL-1β和TNF-α是參與骨關節(jié)炎的常見炎癥介質[22]。通過實驗結果可以觀察到,與空白組比較,模型組IL-1β和TNF-α表達明顯增高,這可能是由于模型組膝關節(jié)受力能力降低、加劇軟骨磨損引發(fā)炎癥反應而發(fā)生的變化。研究發(fā)現(xiàn),當關節(jié)軟骨組織遭受非正常的機械應力時,會生成一種一氧化氮(Nitric Oxide,NO)分子。這種小分子在軟骨內迅速擴散后會在其內部快速傳播,并且刺激軟骨細胞產(chǎn)生大量的IL-1β,基質金屬蛋白酶出現(xiàn)持續(xù)高水平表達。這些細胞因子的過量產(chǎn)生會導致基質中的大分子物質遭到破壞而引發(fā)軟骨病變的發(fā)生[23]。IL-1β等物質會由于軟骨變性后基質纖維片段及其他分子產(chǎn)物的產(chǎn)生而持續(xù)高水平表達,使基質金屬蛋白酶的釋放和活性持續(xù)處于高水平狀態(tài)。其中,IL-1β、TNF-α的過量表達與骨關節(jié)炎病理變化密切相關。IL-1β是一種重要的炎癥介質,是引起KOA產(chǎn)生并逐漸加重的關鍵因素,它可以獨立誘導炎癥反應和軟骨分解,也能夠與其他介質一同作用,其表達水平可以有效體現(xiàn)骨性關節(jié)炎發(fā)展過程中軟骨基質降解、滑膜破壞的程度。IL-1β水平與骨關節(jié)受損程度成正相關,它能夠影響滑膜細胞的生長、分化,使滑膜細胞、軟骨細胞協(xié)同合成并釋放前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)和膠原酶,抑制蛋白多糖的合成及軟骨細胞的增殖,從而加快了軟骨基質的降解[24]。TNF-α是由軟骨細胞、成纖維細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的肽類激素,通過炎癥反應抑制蛋白聚糖的合成以及骨膠原的產(chǎn)生,進而干擾軟骨的合成加速關節(jié)軟骨破壞。有研究表明,TNF-α能夠通過誘導骨母細胞產(chǎn)生一種能夠促使骨吸收的破骨因子,并可與IL-1β、單核粒細胞刺激因子細胞等共同構成炎癥介質參與軟骨的吸收,介導骨關節(jié)組織的炎癥反應和破壞[25]。本研究結果表明,在經(jīng)過電針、針刀的干預后,2組兔IL-1β和TNF-α表達水平均有所下降,且針刀組優(yōu)于電針組。由此可以認為,針刀能夠通過干預肌肉-肌腱生物力學特性以恢復關節(jié)異常應力環(huán)境,降低KOA關節(jié)軟骨中炎癥介質的含量,改善軟骨細胞的生長和代謝。

因此,通過以上實驗結果可以認為,針刀干預能夠恢復關節(jié)及軟骨良性應力環(huán)境,有效抑制KOA軟骨破壞,促進炎癥的吸收和消散,延緩軟骨退變,從而發(fā)揮“治骨”的重要作用。本實驗中僅選取單一角度對兔膝關節(jié)及軟骨力學環(huán)境進行分析,對針刀干預膝關節(jié)實時力學的動態(tài)變化還有待進一步研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明無利益沖突。