高效液相色譜法測定花生中β-谷甾醇的含量

摘 要：目的：建立超聲波輔助萃取-高效液相色譜法快速檢測花生中β-谷甾醇的分析方法，并應(yīng)用該方法對遼寧、山東和河南3個花生種植大省不同品種花生中β-谷甾醇的含量進(jìn)行分析測定。方法：樣品經(jīng)85%乙醇溶液（乙醇∶水=85∶15，V∶V）超聲提取，離心，中性氧化鋁去色素和雜質(zhì)后，經(jīng)Agilient ZORBAX SB-C18色譜柱分離，二極管陣列檢測器檢測，外標(biāo)法定量。結(jié)果：β-谷甾醇在1.0～100.0 mg·L-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，回歸方程為y=10.070x+2.348（r=0.999 9）；平均加標(biāo)回收率為88.5%～106.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.31%～4.73%（n=6），檢出限為0.5 mg/100 g。運用該方法對30個花生樣品進(jìn)行檢測，不同品種花生β-谷甾醇含量在31.6～77.0 mg/100 g。結(jié)論：該方法簡單快捷、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度和靈敏度較高，適用于花生中β-谷甾醇的快速檢測。

關(guān)鍵詞：花生；β-谷甾醇；超聲波輔助萃取；高效液相色譜法（HPLC）

Determination of β-Sitosterol in Peanuts by High Performance Liquid Chromatography

YAN Chaojie1， ZHANG Cheng1， ZHANG Xudong1， WANG Shiqi1， SUN Xiaodong2*

（1.Comprehensive Technical Service Center of Jinzhou Customs， Jinzhou 121013， China; 2.College of Environment and Bioresources， Dalian Minzu University， Dalian 116600， China）

Abstract： Objective： To establish a rapid analytical method for the determination of β-sitosterol in peanuts by ultrasonic-assisted extraction-high performance liquid chromatography （HPLC）.The method was applied to determine the contents of β-sitosterol in different peanut varieties from Liaoning， Shandong and Henan province. Method： The samples were extracted with 85% ethanol （ethanol∶water=85∶15， V∶V） by ultrasonic， after centrifugation and removing pigments and impurities with neutral alumina， separated by Agilient ZORBAX SB-C18 column， and then detected by diode array detector， and quantitated by external standard method. Result： β-sitosterol showed a good linear relationship with peak area in the range of 1.0～100.0 mg·L-1， and the regression equation was y=10.070x+2.348 （r=0.999 9）. The average recoveries were 88.5%～106.9%， with RSD of 2.31%～4.73%， and the limit of detection was 0.5 mg/100 g. The method was used to detect 30 peanut samples， the content of the content of β-sitosterol in different peanuts ranged from 31.6 mg/100 g to 77.0 mg/100 g. Conclusion： The method has the advantages of simple， convenient， good repeatability， high accuracy and sensitivity， which can meet the requirements of rapid analysis of β-sitosterol in peanuts.

Keywords： peanut; β-sitosterol; ultrasonic-assisted extraction; high performance liquid chromatography （HPLC）

花生是我國重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物[1]，目前我國花生種植面積排全球第二位，年總產(chǎn)量居世界首位[2-3]。在我國，花生常被人們稱為長壽果，其不僅是一種具有很高營養(yǎng)價值的食品，也是一味可以入藥的保健良品。花生中除了含有人體所必需的油酸、亞油酸等多種脂肪酸及亮氨酸、色氨酸等氨基酸外[4]，還含有豐富的維生素、微量元素、糖類、多酚類、膽堿、膳食纖維和植物甾醇等營養(yǎng)成分[5-6]，其中植物甾醇為食品中公認(rèn)的抗癌抗腫瘤營養(yǎng)成分?；ㄉ泻械闹参镧薮家驭?谷甾醇含量最高，已有研究證明β-谷甾醇在降低血液膽固醇含量、抑制乳腺增生、抑制腫瘤、防治前列腺增生和調(diào)節(jié)免疫方面都有重要作用[7-9]。2004年歐盟就已經(jīng)批準(zhǔn)允許在特定食品中使用植物甾醇，2010年我國原衛(wèi)生部也批準(zhǔn)并認(rèn)證植物甾醇為新資源食品[10]，由此可見β-谷甾醇具有很高的應(yīng)用價值。因此，花生作為β-谷甾醇含量較高的經(jīng)濟(jì)作物種類，應(yīng)在高甾醇品種培育和深加工提取方面予以重點關(guān)注、研究和推廣。

目前，現(xiàn)已報道的用液相色譜法檢測花生中β-谷甾醇的樣品前處理方法普遍較為復(fù)雜。例如，張建書等[11]用高效液相色譜法對山東、廣東、河南3個地區(qū)共45個花生品種中植物甾醇的組成及含量進(jìn)行分析測定時，采用正己烷浸提萃取花生油，再對花生油皂化回流進(jìn)行植物甾醇提??；張志舟等[12]用反向高效液相色譜法測定花生中β-谷甾醇時，采取花生樣品先皂化回流，再用正己烷液液萃取，最后再進(jìn)行過濾和定容。以上前處理方法中，花生樣品需要經(jīng)過浸提、皂化、萃取、過濾和定容等多個環(huán)節(jié)才能進(jìn)行液相色譜上機檢測，相對費時費力，整個過程消耗的有機試劑量較大，也會導(dǎo)致分析物的回收率相對較低。因此，本研究建立了超聲波輔助提取，結(jié)合高效液相色譜法檢測花生中β-谷甾醇含量的方法，擬為我國篩選富含β-谷甾醇的花生品種提供技術(shù)支持，也為快速檢測花生中β-谷甾醇含量提供方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

花生樣品由錦州海關(guān)綜合技術(shù)服務(wù)中心收集，供試的30個花生樣品（編號為P1～P30）來自遼寧、河南、山東3個省份。所有花生樣品均產(chǎn)于2022年。

β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥98.9%，上海安譜實驗科技股份有限公司）；乙醇（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、中性氧化鋁（分析純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）；甲醇、乙腈（色譜純，美國J.T.Baker公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1100型高效液相色譜儀帶二極管陣列檢測器、ZORBAX SB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）（美國安捷倫公司）；B-400粉碎機（德國BUCHI公司）；BS 323 S千分之一天平、BSA 224 S萬分之一天平（德國賽多利斯公司）；KH7200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；T 25均質(zhì)分散器、MS 3 digital旋渦混合器（德國IKA公司）；3-15臺式大容量離心機（德國Sigma公司）；0.22 μm有機系濾膜（上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 花生中β-谷甾醇的提取

將收集的花生樣品，去殼，選取成熟飽滿、大小均一、無腐敗損傷的花生仁用高速粉碎機粉碎。稱取花生粉末5 g（精確至0.001 g）于100 mL具塞聚乙烯離心管中，加入30 mL 85%乙醇溶液，用均質(zhì)分散器（轉(zhuǎn)速18 000 r·min-1）均質(zhì)100 s后，放于25 ℃水浴中超聲30 min；4 000 r·min-1離心5 min，將上清液倒入另一個干凈離心管中，再以少量85%乙醇溶液洗滌殘渣，4 000 r·min-1 離心5 min后合并濾液，并向濾液中加入5 g中性氧化鋁，混勻振蕩2 min后，4 000 r·min-1離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL具塞玻璃管中定容，用微量移液器取1 mL過0.22 μm濾膜后進(jìn)行高效液相色譜檢測分析。如提取后的樣品不能及時上機檢測，需要放到4 ℃條件下避光冷藏保存。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液。精密稱取β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品10 mg置于10 mL棕色容量瓶中，加入無水乙醇溶解并定容，配制成1 000 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃避光保存，有效期2個月。

（2）β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)工作液。用無水乙醇將

1 000 mg·L-1 β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成濃度分別為1.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、25.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1和100.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4 ℃避光冷藏備用。

1.3.3 液相色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇∶乙腈（40∶60，V∶V）；流速為1.0 mL·min-1；檢測波長設(shè)定為210 nm；柱溫箱溫度為30 ℃；樣品進(jìn)樣量為30 μL。

1.3.4 測定

取30 μL樣品溶液進(jìn)行高效液相色譜測定，在上述色譜條件下測定試樣中β-谷甾醇的峰面積。由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的線性回歸方程計算花生樣品溶液中β-谷甾醇的濃度。

1.3.5 結(jié)果計算

花生樣品中β-谷甾醇含量的計算公式為

式中：X為樣品中β-谷甾醇的含量，mg/100 g；ρ為花生樣品溶液中β-谷甾醇的濃度，mg·L-1；V為試樣最終定容體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的選擇

目前，食品和藥物中β-谷甾醇檢測的前處理方法主要有皂化回流提取法、萃取提取法、超聲波輔助萃取法、吸附法和絡(luò)合法等[13-14]，但大多數(shù)前處理方法的提取過程都比較煩瑣、步驟繁多。同時，由于植物甾醇通常存在于復(fù)雜的植物基質(zhì)中，樣品溶液中有多種潛在干擾物，花生中蛋白質(zhì)和脂肪含量又較高，所以本研究既要縮短前處理時間，簡化操作步驟，還要去除提取溶液中的干擾成分，最終選用提取效率較高同時又操作簡便的超聲波輔助提取法。從圖1中可以看出均質(zhì)后的花生樣品經(jīng)過超聲波提取再高速離心，加入中性氧化鋁可以去除樣品溶液中的大量色素和部分雜質(zhì)，不僅在花生樣品的提取溶液中保留了β-谷甾醇成分，還可以防止基質(zhì)中蛋白質(zhì)和脂肪等成分的干擾。實驗結(jié)果表明，應(yīng)用超聲波-離心前處理法提取效率高，速度快，適用于花生中β-谷甾醇的快速提取檢測。

2.2 流動相的選擇

高效液相色譜法檢測β-谷甾醇常用的流動相有乙腈[11]、乙腈/異丙醇[12]、甲醇[15-16]、甲醇/水[17-18]、甲醇/0.1%磷酸[19]、甲醇/0.15%甲酸[20]等。本研究分別采用色譜實驗室常用的100%甲醇、甲醇/水和甲醇/乙腈體系分離花生樣品提取溶液中的β-谷甾醇。其中以100%甲醇為流動相時，β-谷甾醇出峰時間較早，保留時間在7 min左右，但分離度較低，使β-谷甾醇的色譜峰與后面緊鄰的其他植物甾醇色譜峰基線不能實現(xiàn)有效分離；以不同比例的甲醇/水為流動相時，β-谷甾醇色譜峰的峰形不佳。最終采用甲醇∶乙腈=40∶60為流動相時，β-谷甾醇色譜峰的峰形較好，分離度能夠到達(dá)檢測需求，出峰時間也較適宜。這是由于反相色譜柱中溶劑的洗脫能力隨樣品極性的增強而減弱，甲醇的極性強于乙腈，故在流動相中加入洗脫能力更強的乙腈更有利于β-谷甾醇的分離。

2.3 線性范圍和方法檢出限

用無水乙醇將β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成質(zhì)量濃度為1.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、10.0 mg·L-1、25.0 mg·L-1、50.0 mg·L-1和100.0 mg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，上機測定，以β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x，mg·L-1）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)，得到的線性方程為y=10.070x+2.348，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，由此可見，β-谷甾醇在1.0～100.0 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。以3倍信噪比計算檢出限，最終確定該方法β-谷甾醇的檢出限為0.5 mg/100 g。

2.4 重復(fù)性實驗

取P18號花生樣品，按1.3.1前處理方法平行制備6份供試樣品溶液，按1.3.3色譜條件測定。該樣品中β-谷甾醇平均含量為31.6 mg/100 g，RSD為1.35%（n=6），結(jié)果表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5 回收率測定

稱取已知β-谷甾醇含量的花生樣品5 g（精確至0.001 g），在花生樣品中分別添加低濃度（5 mg/100 g）、中濃度（25 mg/100 g）、高濃度（50 mg/100 g）3個水平的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照1.3.1和1.3.4進(jìn)行6平行樣品前處理和上機檢測，不同添加濃度的加標(biāo)回收率保持在88.5%～106.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.31%～4.73%。由表1可見，該方法具有較好的精密度和回收率，滿足實驗要求。

2.6 花生樣品β-谷甾醇含量的檢測結(jié)果

采用本研究建立的方法對遼寧、山東和河南3個省份2022年新產(chǎn)的30份花生樣品的β-谷甾醇含量分別進(jìn)行檢測分析，每個樣品做3個平行。結(jié)果如表2所示，花生樣品β-谷甾醇的含量在31.6～77.0 mg/100 g。由此可見，不同產(chǎn)地不同花生樣品中β-谷甾醇含量差異較大。

3 結(jié)論與討論

目前，我國尚未發(fā)布適用于花生中β-谷甾醇檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)方法，氣相色譜法常用于檢測植物甾醇，但樣品提取需要經(jīng)過衍生化處理，比較煩瑣，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀也因價格昂貴，不適用于尚未配備該儀器的基層實驗室。此外，現(xiàn)已公開發(fā)表的液相色譜法檢測花生中β-谷甾醇時，花生樣品需要經(jīng)過浸提、皂化、萃取、過濾和定容等多個環(huán)節(jié)才能上機檢測，相對費時費力。因此，本研究通過優(yōu)化前處理條件，建立了超聲波輔助-離心快速提取，高效液相色譜法檢測花生仁中β-谷甾醇含量的方法。該方法具有前處理簡單、檢測速度快、特異性強、成本低等優(yōu)點，該方法的檢出限為0.5 mg/100 g，因花生中含有豐富的植物甾醇成分，所以可以滿足花生中β-谷甾醇定量分析的要求。通過實際檢測，不同濃度β-谷甾醇添加量的加標(biāo)回收率為88.5%～106.9%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.31%～4.73%，表明本方法快速實用、準(zhǔn)確可靠，解決了現(xiàn)有方法提取步驟煩瑣、檢測時限長的問題。

本研究通過對遼寧、山東、河南3個地區(qū)共30個花生樣品的β-谷甾醇含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明花生仁中β-谷甾醇含量在31.6～77.0 mg/100 g，不同花生品種β-谷甾醇的含量差異較大。本研究結(jié)果可為花生和其他堅果中β-谷甾醇的快速檢測提供新的選擇，也為篩選富含β-谷甾醇的花生品種提供了方法支持。

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基金項目：遼寧省自然科學(xué)基金項目（2022-MS-455）。

作者簡介：閆超杰（1979—），女，遼寧錦州人，碩士，高級農(nóng)藝師。研究方向：食品安全檢測分析。

通信作者：孫曉東（1979—），女，遼寧丹東人，博士，副教授。研究方向：食品安全檢測及功能微生物應(yīng)用。E-mail：sxd@dlnu.edu.cn。