磷恢復對磷饑餓銅綠微囊藻光合色素和部分抗氧化酶活性的影響

賈瀅暄 張樹林 張達娟 戴偉 畢相東

摘要：為探究磷饑餓及磷恢復對銅綠微囊藻光合色素、藻膽蛋白和抗氧化酶等生理指標的影響，將其進行磷饑餓處理7 d后再進行磷恢復，檢測磷恢復前后銅綠微囊藻的藻細胞密度、葉綠素a、類胡蘿卜素、藻藍蛋白（phycocyanin，PC）、別藻藍蛋白（allophycocyanin，APC）、藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和過氧化氫（H2O2）含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的變化。結果表明，銅綠微囊藻磷饑餓處理7 d后，藻細胞密度為2.54×107 cell·mL-1，顯著低于對照組（3.11×107 cell·mL-1）。磷恢復144 h后，處理組藻細胞密度為4.05×107 cell·mL-1，仍顯著低于對照組（4.32×107 cell·mL-1）；葉綠素a、類胡蘿卜素和PC、APC、PE含量均呈現(xiàn)升高趨勢，在144 h時分別達到5.96、1.44 μg·mL-1和0.031、0.02、0.065 mg·L-1；MDA、H2O2含量和SOD活性呈先上升后下降趨勢，均在48 h達到最大值，較對照組分別增加36.2%、47.7%、51.1%。由此表明，磷恢復后銅綠微囊藻的藻細胞密度、葉綠素a、類胡蘿卜素和藻膽蛋白含量雖呈升高趨勢，但難以恢復到對照水平；MDA、H2O2含量及SOD活性的變化也說明，從磷饑餓到磷恢復后銅綠微囊藻藻細胞受到氧化損傷，并對細胞膜系統(tǒng)產生破壞。

關鍵詞：磷恢復；磷饑餓；銅綠微囊藻；光合色素；藻膽蛋白；抗氧化酶

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0561

中圖分類號：S946.3 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2024）01007008

隨著我國經濟發(fā)展和生產工藝的增多，大量氮、磷等營養(yǎng)物質排入水體。水體富營養(yǎng)化問題日趨嚴重[12]，常導致藍藻門種群大量繁殖，成為優(yōu)勢種群，進而形成水華[34]。藍藻水華不僅使水生態(tài)環(huán)境惡化，還易產生毒素，通過生物積累影響人類健康。微囊藻（Microcystis）作為重要的藍藻水華種群之一，受到廣泛關注[5]。影響微囊藻生長的因素較多，包括浮游動物捕食等生物因素以及營養(yǎng)鹽、光照、溫度等非生物因素[6]。長期以來，普遍認為過多的營養(yǎng)元素會促使微囊藻爆發(fā)性增長[7]，水體中氮、磷濃度與微囊藻的生長關系密切，且磷對銅綠微囊藻生長有較大的限制作用[8]。

磷是藻類重要的營養(yǎng)元素，既是核酸、蛋白質和磷脂的主要成分，又是合成葉綠素的必需物質[9]。磷在水體中的形態(tài)主要以溶解態(tài)磷和顆粒態(tài)磷為主，微生物可直接利用溶解性無機磷[10-11]。微囊藻對磷鹽的利用主要通過自身核酸、葉綠素和磷脂等物質的合成來完成。當水體磷水平較高時，微囊藻細胞能吸收大量的含磷營養(yǎng)物質，并在細胞內以不同形式儲存，用來支持磷缺乏時藻細胞的正常生長和分裂[5]。因此磷元素被認為是影響微囊藻爆發(fā)性增長的重要限制性因素[12]。許海等[13]研究發(fā)現(xiàn)，不同形態(tài)的磷均能被銅綠微囊藻（Microcystis aeruginosa）吸收利用，且銅綠微囊藻在低磷水平下的生長速率高于高磷水平。岳冬梅等[14]發(fā)現(xiàn)，經過氮、磷饑餓的銅綠微囊藻在補充營養(yǎng)鹽后都能快速生長，然而，經氮饑餓處理的銅綠微囊藻在氮恢復后雖然可快速生長但容易出現(xiàn)衰亡；而磷饑餓處理的藻細胞在磷恢復后均以較穩(wěn)定的速率增長，且未出現(xiàn)衰亡，藻細胞的碳固定能力也可以恢復到最初水平。目前研究者大多關注不同氮磷的質量比或不同氮磷營養(yǎng)鹽來源、種類對銅綠微囊藻的影響，及在營養(yǎng)鹽恢復后微囊藻的生長情況，而有關生理指標及氧化損傷等方面的研究較少。

因此本研究以銅綠微囊藻905藻株為研究對象，分析磷饑餓后恢復供磷對其生理指標（色素、藻膽蛋白及抗氧化酶等）的影響，為探討磷營養(yǎng)鹽在銅綠微囊藻生長中的作用以及預防和治理微囊藻水華提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗藻種

銅綠微囊藻905藻株購自中國武漢科學院水生生物研究所。使用BG11 培養(yǎng)基在光照強度40 μmol·m-2·s-1、（27±2） ℃、光照12 h/黑暗12 h的條件下進行培養(yǎng)。

1.2 試驗設計

試驗設置1個對照組和1個處理組，二者分別使用標準BG11培養(yǎng)基和不添加磷營養(yǎng)鹽的BG11培養(yǎng)基，每組分別設置3個平行。銅綠微囊藻初始密度均為2×107 cell·mL-1，進行不同水平磷處理7 d后，將對照組和處理組中的銅綠微囊藻離心，取藻泥，分別接種至標準的BG11培養(yǎng)基中。在磷恢復后的0、12、24、48、72、96、120、144 h取樣，測定各項生理指標。

1.3 生理指標的測定

1.3.1 藻細胞密度測定 用血球計數(shù)板對銅綠微囊藻進行細胞計數(shù)，每個平行樣品均重復計數(shù)3次，取平均值。

1.3.2 葉綠素a和類胡蘿卜素含量測定 參考戴立洲等[15]的方法測定葉綠素a（chlorophyll a，Chla）和類胡蘿卜素（carotenoid，Car）含量（μg·mL-1）。具體操作步驟如下：取10 mL 藻液，以4 000 r·min-1 離心10 min，得到藻泥沉淀，加入10 mL的95%（體積分數(shù)）乙醇，搖晃使乙醇與藻泥混合均勻，在4 ℃下進行8 h的提取，提取結束后再次離心取上清液，分別在665、649和470 nm波長下測定其吸光光度值，計算葉綠素a和類胡蘿卜素含量。

1.3.3 藻膽蛋白含量測定 參考戴立洲等[15]的方法并作修改。取5 mL藻液，在4 000 r·min-1條件下離心10 min，得到藻泥沉淀，向離心管中加入5 mL磷酸緩沖液（0.05 mol·L-1，pH 7.0）充分混勻，包錫紙，放入?80 ℃的超低溫冰箱冷凍8 h 以上；然后取出于室溫下避光溶解，反復凍融3次，再次離心取上清液，分別測定其在650、620和565 nm的吸光值并記錄。計算藻藍蛋白（phycocyanin，PC）、別藻藍蛋白（allophycocyanin，APC）和藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）含量（mg·L-1）。

1.3.4 丙二醛、超氧化物歧化酶和過氧化氫的測定 取2 mL 藻液以4 000 r·min-1 離心10 min，棄上清液，藻泥加入200 μL生理鹽水混勻，使用超微粉碎機進行破碎處理，得到破碎液待用。從破碎液中取50 μL，加入200 μL 的生理鹽水，以2 500 r·min-1離心10 min，取上清液用于測定蛋白含量；剩余的破碎液以4 000 r·min-1離心10 min，取250 μL上清液以10 000 r·min-1離心10 min，用于測定過氧化氫（H2O2）含量；剩余上清液用于丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的測定。以上指標測定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒測定，具體方法參考試劑盒說明書。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010 和SPSS 24.0 進行數(shù)據(jù)整理與統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 磷恢復對磷饑餓銅綠微囊藻生長的影響

磷恢復后銅綠微囊藻的生長趨勢如圖1所示。與對照組相比，磷饑餓7 d后，處理組銅綠微囊藻密度為2.54×107 cell·mL-1，顯著低于對照組；隨著磷的恢復，處理組銅綠微囊藻細胞密度呈現(xiàn)上升趨勢。在培養(yǎng)結束時（144 h），對照組藻密度為4.32×107 cell·mL-1；處理組藻密度為4.05×107 cell·mL-1，兩組間差異顯著（P<0.05）。由此表明，經過饑餓處理的銅綠微囊藻生長在恢復供磷后仍然難以恢復至對照生長水平。

2.2 磷恢復對磷饑餓銅綠微囊藻色素的影響

由圖2可知，恢復供磷對磷饑餓銅綠微囊藻的葉綠素a含量影響顯著。在整個培養(yǎng)期，處理組的葉綠素a含量均顯著或極顯著低于對照組。經7 d磷饑餓處理的葉綠素a含量較對照組顯著降低0.99 μg·mL-1；恢復供磷后，隨著培養(yǎng)時間的延長處理組藻細胞的葉綠素a含量呈上升趨勢，在144 h時升至5.96 μg·mL-1，但仍顯著低于對照組。

銅綠微囊藻類胡蘿卜素含量變化如圖3 所示，在磷恢復0 h時，處理組銅綠微囊藻的類胡蘿卜素含量為1.12 μg·mL-1，顯著低于對照組（0.14 μg·mL-1）；在磷恢復144 h時，處理組藻細胞的類胡蘿卜素含量升至1.44 μg·mL-1，與對照組差異不顯著。

2.3 磷恢復對磷饑餓銅綠微囊藻藻膽蛋白含量的影響

由圖4可知，在磷恢復144 h內，處理組銅綠微囊藻的藻藍蛋白（PC）含量極顯著低于對照組。經7 d磷饑餓處理后，處理組PC含量極顯著低于對照組；恢復供磷后，隨著培養(yǎng)時間的延長，處理組PC含量逐漸上升至0.031 mg·L-1，但仍極顯著低于對照組。經7 d磷饑餓處理后，處理組藻細胞的別藻藍蛋白（APC）含量為0.013 mg·L-1，極顯著低于對照組；隨著培養(yǎng)時間的延長，APC含量呈上升趨勢，在144 h時升至0.020 mg·L-1，但仍極顯著低于對照組。經7 d磷饑餓處理后，處理組藻細胞的藻紅蛋白（PE）含量極顯著低于對照組；在恢復供磷144 h時，對照組與處理組的PE含量分別為0.071和0.065 mg·L-1，二者差異顯著。

2.4 磷恢復對磷饑餓銅綠微囊藻MDA 及H2O2含量的影響

由圖5可知，對照組銅綠微囊藻細胞MDA含量在培養(yǎng)期相對穩(wěn)定；經7 d磷饑餓處理后的處理組MDA含量為1.63 nmol·mg-1，與對照組差異不顯著，隨后MDA含量呈現(xiàn)上升趨勢，在48 h時升至2.52 nmol·mg-1，較對照組極顯著增加36.2%。在磷恢復48～144 h，處理組MDA含量逐漸下降并趨于穩(wěn)定；在144 h時處理組與對照組間無顯著差異。在恢復供磷0～48 h，處理組藻細胞的H2O2含量逐漸升高，并在48 h時升至10.41 mmol·g-1，較對照組極顯著增加47.7%；隨后H2O2含量逐漸下降，并在120～144 h趨于穩(wěn)定，在144 h時處理組H2O2含量為5.40 mmol·g-1，與對照組差異不顯著（圖5）。

2.5 磷恢復對磷饑餓銅綠微囊藻SOD 活性的影響

磷恢復對磷饑餓藻細胞SOD 活性有顯著影響（圖6）?；謴凸┝缀螅幚斫M藻細胞SOD活性顯著升高，并在48 h時升至10.62 U·mg-1，較對照組極顯著提高51.1%；48 h后，SOD活性逐漸降低并趨于穩(wěn)定，在144 h時，處理組藻細胞SOD活性為7.70 U·mg-1，較對照組極顯著高20.9%。

3 討論

前人對環(huán)境因素對微囊藻生長的影響進行了大量研究[16]。磷是微藻細胞組成和合成ATP的重要元素，參與細胞膜構建、能量傳遞和信號傳導等代謝活動。謝靜等[17]研究發(fā)現(xiàn)，氮、磷元素均對銅綠微囊藻生長有顯著影響，但高磷水平對其生長的影響更為顯著。微囊藻的胞內磷主要以有機磷形式存在，因此，其生長速度也取決于胞內磷含量[18]，微囊藻對磷的最大攝取速率較高，具有比其他藻類更強的儲磷能力。磷限制會影響藻類的生長繁殖、光合作用、產毒及胞內物質合成等[19]，當外界環(huán)境磷缺乏時，微藻可以利用自身儲存的磷營養(yǎng)鹽繼續(xù)生長[20-21]。

藻類依靠光合作用將有機物固定在體內，因此光合作用是藻類生長過程中最重要的生理過程之一[22]，葉綠素a與類胡蘿卜素在光合作用中起著重要作用。田雅琪[23]研究發(fā)現(xiàn)，不同氮、磷水平及氮磷比對微囊藻生長的影響相似，均表現(xiàn)為低水平抑制，高水平促進；隨著氮、磷水平的升高，β-胡蘿卜素含量呈先增加后下降趨勢，葉綠素a呈直線上升趨勢。葉倩[24]研究發(fā)現(xiàn)，缺磷時銅綠微囊藻的藻細胞中葉綠素a和類胡蘿卜素含量都呈現(xiàn)顯著下降趨勢，其生長受到抑制，并在培養(yǎng)后期逐漸衰亡。李曉梅等[25]指出，磷限制會使三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum Bohlin）葉綠素a含量降低。在缺磷環(huán)境中，藻類的細胞分裂受阻，且對光能的吸收和利用能力降低，營養(yǎng)物質可能會更多地流向其他代謝過程，而對光合色素合成上的投入減少。本研究中磷饑餓會抑制銅綠微囊藻的生長，且在磷恢復后處理組銅綠微囊藻的生長速率仍難以恢復；磷饑餓導致藻細胞葉綠素a和類胡蘿卜素含量顯著降低，隨著磷恢復后培養(yǎng)時間的延長，二者含量逐漸升高，但在培養(yǎng)末期仍未恢復至對照水平，可見磷饑餓對銅綠微囊藻的生長及葉綠素a和類胡蘿卜素含量有明顯的抑制作用。

藻膽蛋白主要存在于藍藻、紅藻、隱藻和少數(shù)甲藻中，是重要的捕光色素蛋白，在一些藻類中也可作為儲藏蛋白[26]。鄭彩云等[27]研究表明，隨著氮水平的上升，紫球藻（Porphyridium cruentum）的藻膽蛋白含量明顯增多，在一定范圍內其含量與氮含量呈正相關。劉潔等[28]指出，低水平Ni增加銅綠微囊藻PC含量，而高水平Ni則降低其含量；但不同Ni水平均使APC含量降低。本研究表明，磷恢復后銅綠微囊藻的藻膽蛋白含量均呈上升趨勢，且與葉綠素a 含量和藻細胞生長呈正相關。由此可見，磷恢復后，隨著藻細胞葉綠素a含量升高，光合作用能力逐漸提高，對培養(yǎng)基中磷源的利用能力增強，合成藻膽蛋白含量增加[27]。

抗氧化酶系統(tǒng)是生物體減輕細胞遭受氧化損傷的重要防御系統(tǒng)，通過清除細胞中的活性氧（reactive oxide species，ROS）提高細胞對氧化壓力耐受性，是生物的一種保護機制。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體清除ROS的關鍵酶，能催化O-2發(fā)生歧化反應，生成H2O2，后者再被其他抗氧化酶去氧化生成水分子，是藻體防御ROS的第一道防線。MDA是膜脂過氧化的產物，能夠反映膜氧化損傷程度[2930]。H2O2是光合電子傳遞鏈的天然產物，對藻類具有毒害作用[31]。Li等[32]探究了磷限制對小球藻（Chlorella）的影響，結果表明隨著磷水平的增加藻細胞MDA含量和SOD活性均逐漸降低。王小冬等[33]發(fā)現(xiàn)，磷饑餓抑制了赤潮異彎藻（Heterosigma akashiwo）和海洋卡盾藻（Chattonella marina）生長，藻細胞SOD 活性提高以緩解脅迫損傷。馬金華等[31]研究發(fā)現(xiàn)，鏈狀亞歷山大藻（Alexandrium catenella）在衰亡期及高、低氮條件下，藻細胞內H2O2 含量明顯上升，說明脅迫條件下藻細胞會產生過量的O-2，致使H2O2積累。楊蕾[34]研究發(fā)現(xiàn)，在不同鹽脅迫下發(fā)狀念珠藻（Nostoc flaglliforme）藻細胞的O-2 和H2O2含量隨脅迫時間的延長而升高，表明鹽脅迫對其膜系統(tǒng)造成破壞。本研究發(fā)現(xiàn)，磷恢復后銅綠微囊藻藻細胞的MDA、H2O2含量及SOD活性均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，表明磷饑餓處理使細胞生長受到抑制，造成蛋白質降解，產生大量的ROS，使得H2O2 和MDA 含量上升；細胞的抗氧化系統(tǒng)被激活，SOD等抗氧化酶活性上升，以緩解ROS等有害物質對機體造成的損傷[31]。

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（責任編輯：張冬玲）