藜麥SOD 家族基因的鑒定及其對(duì)混合鹽堿脅迫的響應(yīng)

鄧玉榮 韓聯(lián) 王金龍 韋興翰 王旭東 趙穎 魏小紅 李朝周

摘要：超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是植物抗氧化系統(tǒng)的關(guān)鍵酶，在保護(hù)植物免受生物和非生物脅迫方面發(fā)揮重要作用。以擬南芥SOD為基礎(chǔ)，通過(guò)序列比對(duì)在藜麥基因組中鑒定出12個(gè)SOD 基因，分別定位于細(xì)胞核、微體及線粒體，在11條染色體上不均勻分布，其編碼蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示Cu/Zn-SODs與Fe-SODs為同源二聚體，Mn-SODs為同源四聚體。CqSOD 基因內(nèi)含子/外顯子分布模式不盡相同，內(nèi)含子數(shù)介于4～7個(gè)，保守基序差異明顯。系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系顯示，SOD蛋白可分為Cu/Zn-SODs、Fe-SODs及Mn-SODs 3個(gè)亞族。此外，所有的CqFe-SODs 及CqMn-SODs 啟動(dòng)子區(qū)都含有脫落酸激素反應(yīng)順式元件，CqSOD12 與11 個(gè)CqSOD蛋白及4個(gè)CqCAT蛋白存在相互作用。表達(dá)譜分析表明，12個(gè)CqSOD 基因?qū)旌消}堿及硝普鈉均有較強(qiáng)響應(yīng)。研究結(jié)果為SOD 基因在植物發(fā)育和脅迫響應(yīng)中的作用及分子機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：藜麥；SOD 家族基因；鹽堿脅迫；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析

doi：10.13304/j.nykjdb.2022.0558

中圖分類號(hào)：S519 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：10080864（2024）01002812

在自然條件下，植物容易受到干旱、鹽、極端溫度、重金屬及其他對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育產(chǎn)生重大影響的非生物因素脅迫[1]。當(dāng)植物受到脅迫時(shí)，會(huì)在其細(xì)胞中產(chǎn)生更多的活性氧（reactive oxygenspecies，ROS）來(lái)氧化蛋白質(zhì)、破壞細(xì)胞膜并導(dǎo)致DNA損害。ROS主要在質(zhì)外體、線粒體、質(zhì)膜、葉綠體、過(guò)氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞壁中形成[2]，其主要包括羥基自由基（·OH）、超氧陰離子自由基（O2· -）、過(guò)氧化氫（H2O2）和單線態(tài)氧（1O?），能引起細(xì)胞膜的損傷、大分子的過(guò)氧化和變質(zhì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。ROS也被認(rèn)為是不同生物體中的信號(hào)分子，可以影響植物的各種生理過(guò)程。使用活性氧清除劑可以通過(guò)調(diào)節(jié)酶反應(yīng)家族基因，如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathioneperoxidase，GPX）等編碼基因的表達(dá)來(lái)抵抗環(huán)境脅迫[3]。因此，為了減輕ROS的毒性，植物建立了組織良好的復(fù)合抗氧化防御系統(tǒng)，包括許多非酶和酶抗氧化劑。

SOD是一種金屬酶，首先在紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，然后在細(xì)菌、脊椎動(dòng)物和高等植物中進(jìn)行了研究[4]。SODs可以催化O2· -進(jìn)行歧化反應(yīng)生成H2O2和O2，SOD可在植物的根、果實(shí)、葉子和種子中檢測(cè)到，其為細(xì)胞抵御氧化應(yīng)激提供了必要的保護(hù)[5]。根據(jù)SOD 與金屬輔助因子的結(jié)合模式，可分為鐵SOD（FeSOD）、銅/鋅SOD（Cu/ZnSOD）、錳SOD（MnSOD）、和鎳SOD（NiSOD）[6]4 個(gè)亞型，不同亞型具有不同的功能。此外，它們具有不同的氨基酸序列、體外亞細(xì)胞定位和晶體結(jié)構(gòu)以及不同的過(guò)氧化氫敏感性[7]，某些SOD單獨(dú)分布在細(xì)胞隔室中，在氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。Cu/ZnSODs主要分布在葉綠體、細(xì)胞外空間和細(xì)胞質(zhì)中，也存在于某些細(xì)菌和所有真核生物中，而MnSODs主要存在于植物線粒體中[8]。植物基因組中的MnSOD 在消除線粒體ROS 中發(fā)揮作用[9]。FeSODs主要分布在原生動(dòng)物、原核生物、細(xì)胞質(zhì)和植物葉綠體中，而NiSODs存在于鏈霉菌和一些藍(lán)細(xì)菌中，但在植物中不存在[2]。

最近的研究表明，SODs 可以保護(hù)植物免受熱、干旱、寒冷、脫落酸、鹽和乙烯等非生物脅迫的影響[10]。SOD 基因可以在不同的植物中受到熱、干旱、冷、鹽、滲透脅迫、氧化脅迫和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等條件下誘導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄。近年來(lái)，越來(lái)越多植物基因組信息的發(fā)布使SOD 基因家族研究成為熱點(diǎn)，Su等[6]在油菜（Brassica campestris）中鑒定了31個(gè)SOD 基因，其中8個(gè)在不同激素和非生物脅迫條件下顯著上調(diào)；丹參（Salvia miltiorrhiza）的8 個(gè)SOD 基因?qū)?、鹽、干旱、重金屬和植物激素表現(xiàn)出不同的響應(yīng)特征[11]；大麥（Hordeum vulgare）的SOD 基因家族共有7 個(gè)成員，其中HvSOD1、HvSOD4 和HvSOD5 在干旱和鹽脅迫下表達(dá)量顯著變化[12]；在番茄（Solanum lycopersicum）中，SlSOD1 是9 個(gè)SlSOD 基因中唯一顯著上調(diào)的基因，而SlSOD2、SlSOD5、SlSOD6 和SlSOD8 受鹽脅迫的調(diào)節(jié)；Feng 等[13] 發(fā)現(xiàn)，SlSOD2、SlSOD5、SlSOD6 和SlSOD8 4個(gè)基因的表達(dá)水平在強(qiáng)干旱環(huán)境下明顯提高。此外，同一類型的SOD 基因在不同物種中的表達(dá)模式也不盡相同，氧化脅迫下擬南芥中MnSODs 的表達(dá)沒(méi)有變化，而鹽脅迫下豌豆（Pisum sativum）和小麥（Triticum aestivum）中MnSODs 的表達(dá)有顯著變化[14]。以上研究表明，不同的SOD 基因在不同環(huán)境脅迫下的表達(dá)模式不同。迄今為止，SOD 基因家族已在許多植物中得到解析鑒定，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、高粱（Sorghum bicolor）、菜豆（Phaseolus vulgaris）和楊樹（Populus）[15]。藜麥起源于南美洲安第斯山脈，為藜科藜屬一年生四倍體雙子葉草本植物，是世界重要的經(jīng)濟(jì)和營(yíng)養(yǎng)作物[16]，具有較強(qiáng)的耐旱、耐鹽、耐瘠薄特性。趙穎等[17]發(fā)現(xiàn)，藜麥種子能耐受較高水平的混合鹽堿脅迫，有些品種抗鹽性極強(qiáng)，是抗鹽作物棉花的2～3 倍。劉文瑜等[18]發(fā)現(xiàn)，隨NaCl含量的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，藜麥幼苗葉片葉綠素含量先升高后下降，可溶性糖、脯氨酸和丙二醛含量逐漸升高，SOD、POD、CAT和抗壞血酸過(guò)氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性增強(qiáng)以提高藜麥應(yīng)對(duì)鹽脅迫的能力。但關(guān)于藜麥分子方面研究較少，有研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下藜麥大多數(shù)基因在轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化[19]，目前尚未見(jiàn)SOD 家族的報(bào)道。因此，本研究深入分析藜麥中SOD 基因在不同組織中的系統(tǒng)發(fā)育譜系、基因結(jié)構(gòu)、基本基序及非生物脅迫下的表達(dá)差異等，為藜麥SOD 基因的功能鑒定奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和處理

以‘隴藜2號(hào)（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供）為試驗(yàn)材料。藜麥種子用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇滅菌30 s，無(wú)菌水洗滌2次，10%次氯酸鈉滅菌15 min，用無(wú)菌水洗滌5次，然后接種在MS固體培養(yǎng)基上，種子在光照培養(yǎng)箱25 °C、光照16 h/黑暗8 h下培養(yǎng)48 h直至發(fā)芽，然后將發(fā)芽的種子種植在含有沙子、珍珠巖和泥炭（體積比1∶1∶1）的托盤中，并在生長(zhǎng)室中培養(yǎng)，條件為：相對(duì)濕度60%～70%，光照強(qiáng)度4 000 lx，時(shí)間12 h，白28 ℃/晝18 ℃。幼苗生長(zhǎng)2個(gè)月至6葉期，參照趙穎等[17]的方法配置混合鹽堿處理液，分別進(jìn)行混合鹽堿（200 mmol·L?1，堿性鹽比例遞增）脅迫及混合鹽堿+外源NO供體硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP，150 μmol·L?1）噴施處理，噴施100 mL SNP后24 h，每盆噴施100mL混合鹽堿，均勻噴施于葉片上。共計(jì)12個(gè)處理（表1），每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。在處理后第9天收集葉片，于?80 ℃的冰箱中儲(chǔ)存，用于后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量試驗(yàn)。

1.2 藜麥SOD 基因家族的鑒定

以擬南芥的7個(gè)SOD 基因編碼的氨基酸序列（CAA43270、AAD10208、AAC24833、AAA32791、CAA73188、AAC24834 和AAC24832）為比對(duì)序列，通過(guò)BLAST搜索藜麥氨基酸序列文件，藜麥的基因組、氨基酸序列以及GFF 注釋文件來(lái)自Phytozome 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）。使用Pfam（https：//pfam.xfam.org/）[20]、SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）與NCBICDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）數(shù)據(jù)庫(kù)獲得和鑒定候選蛋白質(zhì)序列，CqSOD 家族最終由SOD保守結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)序列確定。

1.3 理化特性及亞細(xì)胞定位

使用ProtParam 工具（http：//web. expasy. org/protparam/）計(jì)算CqSOD蛋白的理化特性，包括氨基酸數(shù)、分子量、理論等電點(diǎn)（isoelectric point，pI）和親水性的總平均值。用ProtComp 9.0（http：//linux1.softberry.com/）預(yù)測(cè)CqSOD蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.4 CqSODs 的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)與染色體定位

采用ExPASy（https：//www.expasy.org/）提供的SOPMA 和SWISS MODEL 在線服務(wù)器分析CqSODs的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。通過(guò)分子可視化軟件VMD（https：//www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/）檢測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。使用NetPhos 3.1 Server分析CqSOD的磷酸化位點(diǎn)。通過(guò)NetOGlyc-4.0分析糖基化位點(diǎn)。根據(jù)藜麥GFF文件，預(yù)測(cè)CqSOD 基因在染色體上的位置。

1.5 CqSOD 的基因結(jié)構(gòu)與保守基序預(yù)測(cè)

CqSOD 基因家族的cDNA和DNA序列取自基因組數(shù)據(jù)庫(kù)。利用基因結(jié)構(gòu)展示服務(wù)器GSDS2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）對(duì)其基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并解析各CqSOD 的內(nèi)含子分布模式。使用默認(rèn)設(shè)置的MEME Suite（http：//meme-suite.org/）預(yù)測(cè)保守的蛋白質(zhì)基序。

1.6 CqSOD 的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

為研究不同植物之間SODs 的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，使用Clustal W 以默認(rèn)參數(shù)比對(duì)多個(gè)SOD蛋白序列，并使用MEGA X.10.0.5 使用鄰接（neighborjoining，NJ）方法和Poisson model 模型，引導(dǎo)程序設(shè)置1 000次重復(fù)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.7 CqSOD 基因的啟動(dòng)子序列分析及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

分析CqSODs 啟動(dòng)子中的順式元件有助于了解基因表達(dá)調(diào)控的信息。每個(gè)CqSOD 基因起始密碼子的2.0 kb上游序列作為啟動(dòng)子區(qū)。然后，使用PlantCARE 服務(wù)器（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/search_CARE.html）預(yù)測(cè)CqSOD 基因啟動(dòng)子中的順式元件，通過(guò)TBtools（https：//github.com/CJ-Chen/TBtools）中的啟動(dòng)子可視化工具繪制啟動(dòng)子的分布圖。為預(yù)測(cè)藜麥中SOD家族的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用與藜麥SOD 基因直系同源的擬南芥SOD 基因通過(guò)STRING構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖。

1.8 混合鹽堿及SNP 處理下CqSOD 基因家族的實(shí)時(shí)定量PCR

使用HiPure HP Plant RNA Mini Kit（Magen）提取總RNA。使用NanoDrop 2000C 分光光度計(jì)（Thermo）評(píng)估提取RNA的純度和質(zhì)量濃度，以無(wú)RNase水作為空白。用HiScript Ⅱ Q RT SuperMixⅡ（Vazyme Biotech Co.， Ltd.）合成cDNA。將單次40 μL反應(yīng)中約1 μL（1 000 ng·μL?1）的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，稀釋50 倍備用。按照ChamQTMSYBR qPCR Master Mix（Vazyme Biotech Co.， Ltd.）說(shuō)明書中方法，在Roche LightCycler 96 PCR 系統(tǒng)中進(jìn)行qRT-PCR分析。20 μL反應(yīng)體系包含10 μLSYBR qPCR Master Mix、5 μL 稀釋cDNA、0.5 μL正向和反向引物（10 μmol·L?1）（引物序列見(jiàn)表2）和4 μL ddH2O。反應(yīng)程序如下：95 ℃變性30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)基因進(jìn)行3次重復(fù)。CqActin （GenBank accession：LOC110715281）用作標(biāo)準(zhǔn)化CqSOD 基因表達(dá)的內(nèi)部對(duì)照。使用2-ΔΔCt [21]方法計(jì)算基因的表達(dá)水平。

1.9 數(shù)據(jù)處理

使用Excel繪制圖表，使用Dunnett檢驗(yàn)分析統(tǒng)計(jì)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 CqSOD 家族基因的鑒定及理化性質(zhì)分析

基于已知擬南芥SOD 蛋白序列進(jìn)行BLAST搜索以及SMART和Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定，在藜麥中鑒定了12 個(gè)SOD 基因家族成員，將其命名為CqSOD01～CqSOD12。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)域分析，將12個(gè)CqSODs 分為3 類：Cu/Zn-SODs（CqSOD01～CqSOD06）、Fe-SODs（CqSOD07～CqSOD10）和Mn-SODs（CqSOD11～CqSOD12）。其中，CqSOD01～CqSOD06 都包含1 個(gè)保守的SOD_Cu 結(jié)構(gòu)域（Pfam： PF00080），該結(jié)構(gòu)域?yàn)镃u/Zn-SOD蛋白的典型特征。CqSOD07～CqSOD10 和CqSOD11～CqSOD12中都存在N端鐵/錳SOD-α發(fā)夾結(jié)構(gòu)域（Pfam：PF00081）和C 端鐵/錳SOD 結(jié)構(gòu)域（Pfam：PF02777），表明它們均屬于Fe/Mn-SODs亞家族。理化分析（表3）表明，12個(gè)CqSOD蛋白的氨基酸序列長(zhǎng)度、分子量、等電點(diǎn)（pI）、脂肪酸指數(shù)和疏水性不盡相同。CqSOD 蛋白的氨基酸數(shù)在130（CqSOD06）～295（CqSOD11），存在較大差別；分子量在13.41～32.43 kD，pI 在 5.28～8.80。脂肪酸指數(shù)介于69.71～93.63；所有 CqSOD蛋白的疏水性指數(shù)均小于0，都屬于親水性蛋白質(zhì)；不穩(wěn)定指數(shù)介于15.37～41.28，其中11個(gè)蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)小于40，屬于穩(wěn)定蛋白。亞細(xì)胞定位顯示，6個(gè)Cu/Zn-SODs亞家族成員定位于細(xì)胞質(zhì)，4個(gè)Fe-SODs 定位于微體，2 個(gè)Mn-SODs 成員定位于線粒體基質(zhì)中。此外，潛在磷酸化位點(diǎn)的數(shù)量介于11～77，其中CqSOD03磷酸化位點(diǎn)最多（77個(gè)），潛在的磷酸化位點(diǎn)越多，多功能的可能性就越大。

2.2 CqSOD 蛋白結(jié)構(gòu)及染色體定位分析

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析對(duì)于了解其功能具有重要意義。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析（表4）表明，CqSOD蛋白主要由α螺旋、延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲組成，5個(gè)Cu/Zn-SODs中無(wú)規(guī)則卷曲>延伸鏈>α螺旋；所有的Fe-SODs與Mn-SODs的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成均為無(wú)規(guī)則卷曲>α 螺旋>延伸鏈。染色體定位顯示，除CqSOD06、CqSOD07 定位于同一染色體外，其余10個(gè)基因均定位于不同的染色體上。

三級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明， 所有Cu/Zn-SODs 和Fe-SODs 都是同源二聚體，Mn-SODs 都是同源四聚體。除了CqSOD03與CqSOD04外，所有CqSODs都有不同數(shù)量的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，其中CqSOD01、CqSOD02、CqSOD05 與CqSOD06 螯合2 個(gè)銅離子，CqSOD07～CqSOD10 螯合2 個(gè)鐵離子，CqSOD11～CqSOD12 螯合4 個(gè)錳（Ⅱ）離子。以上3 種金屬離子全部通過(guò)非共價(jià)鍵與肽鏈結(jié)合。

2.3 基因結(jié)構(gòu)與基本基序分析

基于CqSODs 的cDNA和相應(yīng)的DNA序列分析基因結(jié)構(gòu)（圖1），所有CqSOD基因均含有4～7個(gè)內(nèi)含子，其中，4 個(gè)CqFe-SODs、1 個(gè)CqMn-SODs（CqSOD11）和1個(gè)CqCu/Zn-SODs（CqSOD11）均包含7個(gè)內(nèi)含子，CqSOD06 包含最小數(shù)量的內(nèi)含子（4個(gè)）。此外，在8個(gè)基因的兩端發(fā)現(xiàn)了UTR非編碼區(qū)。值得注意的是，CqSOD08 和CqSOD10，CqSOD07 和CqSOD09 在基因結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出高度相似性，它們的cDNA和DNA序列高度一致，表明這2對(duì)Fe-SOD 基因很可能是重復(fù)的。

利用MEME 軟件分析保守基序，共鑒定出10個(gè)保守基序（圖2），在3個(gè)亞族間可以清晰觀察到motif 的差異。其中，與Cu-Zn 結(jié)構(gòu)域（PF00080）相關(guān)的motif 1 在6 個(gè)Cu/Zn-SOD 中都能觀察到，motif 5 與motif 6 僅存在于Cu/Zn-SOD蛋白中。所有Fe-SOD和Mn-SOD都包含motif 2、motif 3與motif 4，這些基序涉及C端Fe/Mn SOD結(jié)構(gòu)域（PF02777）。motif 2包含Mn-SODs和Fe-SODs的保守金屬結(jié)合域“DVWEHAYY”，motif 7、motif 8與motif 9僅存在于Fe-SODs中。

2.4 藜麥SOD 蛋白系統(tǒng)發(fā)育分析

為更準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)CqSODs 的功能，進(jìn)一步探討SOD蛋白在不同物種間的進(jìn)化關(guān)系，對(duì)擬南芥、水稻、小麥、陸地棉等5個(gè)物種的SOD蛋白氨基酸序列進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析（圖3）。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，SOD蛋白可分為3個(gè)亞族，其中第Ⅰ亞族均為Cu/Zn-SODs，第Ⅱ亞族均為Fe-SODs，第Ⅲ亞族均為Mn-SODs。此外，在藜麥中存在6對(duì)旁系同源基因（CqSOD01/CqSOD02、CqSOD03/CqSOD04、CqSOD05/CqSOD06、CqSOD07/CqSOD09、CqSOD08/CqSOD10、CqSOD11/CqSOD12）。上述結(jié)果表明，SOD 基因在整個(gè)進(jìn)化過(guò)程中可能發(fā)生了基因丟失或復(fù)制事件，特定SOD 基因成員的獲得和損失導(dǎo)致其基因功能的差異。

2.5 CqSOD 蛋白互作分析

為探索藜麥SOD 蛋白及其調(diào)控功能之間的關(guān)系，使用STRING軟件構(gòu)建了擬南芥和藜麥之間的SOD家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（圖4）。根據(jù)預(yù)測(cè)，CqSOD 蛋白出現(xiàn)在已知的擬南芥SOD蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中。CqSOD 和AtSOD 蛋白之間存在密切關(guān)系，暗示可以通過(guò)已知AtSOD 基因的功能預(yù)測(cè)CqSOD 基因的未知功能。結(jié)果顯示，藜麥CqSOD12與11個(gè)CqSOD蛋白及4個(gè)CqCAT蛋白相互作用，而擬南芥中SOD 與CAT 基因在應(yīng)對(duì)多種生物脅迫及非生物脅迫中起著關(guān)鍵作用，推測(cè)藜麥中SOD 基因可能具有類似的功能。

2.6 CqSOD 基因啟動(dòng)子元件分析

為進(jìn)一步確定CqSOD 在各種脅迫下的作用，分析CqSOD 基因啟動(dòng)子序列中的順式元件（表5），CqSOD 基因家族的啟動(dòng)子區(qū)域富含非生物脅迫順式調(diào)節(jié)元件和植物激素反應(yīng)元件。順式元件分為激素反應(yīng)性、應(yīng)激反應(yīng)性和組織特異表達(dá)3個(gè)亞族。激素響應(yīng)方面，參與ABA反應(yīng)的順式調(diào)節(jié)元件（ABRE）廣泛存在于所有的CqFe-SODs 與CqMn-SODs 的啟動(dòng)子區(qū)，參與MeJA反應(yīng)的順式調(diào)節(jié)元件（TGACG 基序）在大多數(shù)CqCu/Zn-SODs、CqFe-SODs 與CqMn-SODs 的啟動(dòng)子區(qū)均有發(fā)現(xiàn)。而參與SA反應(yīng)的順式調(diào)節(jié)元件（CCATCTTTTT基序）在所有的CqFe-SODs 的啟動(dòng)子區(qū)均存在。在壓力響應(yīng)方面，與低溫脅迫相關(guān)的響應(yīng)元件存在于CqSOD02～CqSOD04、CqSOD06， CqSOD10 與CqSOD11 的啟動(dòng)子區(qū)，CqSOD02、CqSOD07、CqSOD11 與CqSOD12 的啟動(dòng)子具有1個(gè)與干旱誘導(dǎo)相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)。CqSOD06～CqSOD08、CqSOD11 與CqSOD12 的啟動(dòng)子區(qū)具有與應(yīng)急反應(yīng)相關(guān)的元件。在組織特異表達(dá)方面，ARE元件參與厭氧反應(yīng)，存在于所有的CqSOD 中（除CqSOD07），且在CqSOD03 的啟動(dòng)子區(qū)具有7 個(gè)ARE元件。CAT-box元件是與分生組織表達(dá)有關(guān)的順式作用調(diào)控元件，存在于CqSOD05 與CqSOD11 的啟動(dòng)子區(qū)。CqSOD08 的啟動(dòng)子具有MYB結(jié)合位點(diǎn)，參與黃酮類生物合成基因調(diào)控，暗示CqSOD08 可能與黃酮類生物合成有關(guān)。O2-site是玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控順式調(diào)控作用元件，以單拷貝的形式存在于CqSOD01、CqSOD02、CqSOD05、CqSOD08 與CqSOD12 的啟動(dòng)子區(qū)。

2.7 CqSODs 在混合鹽堿脅迫下的qRT-PCR分析

為了解藜麥SOD 基因的作用，使用qRT-PCR分析SOD 基因在混合鹽堿脅迫下的表達(dá)模式（圖5）。與CK 相比，CqSOD 基因在不同處理下的表達(dá)水平存在顯著差異，其表達(dá)模式具有復(fù)雜性。然而總體上可以觀察到3個(gè)亞族基因間（6個(gè)Cu/Zn-SOD、4個(gè)Fe-SOD 和2個(gè)Mn-SOD 基因）具有相似的表達(dá)模式。本研究發(fā)現(xiàn)，不同比例的混合鹽堿處理均顯著誘導(dǎo)了SOD 基因的表達(dá)，對(duì)于不同組合的鹽堿處理而言，E處理下11個(gè)CqSOD 基因（除CqSOD12）的表達(dá)量均達(dá)到最大值，A處理下12個(gè)CqSOD 基因的表達(dá)量均較CK增加最少。而在外源施加150 μmol·L?1 的SNP 后，6 個(gè)Cu/Zn-SOD （CqSOD01～CqSOD06） 與4 個(gè)Fe-SOD（CqSOD07～CqSOD10）基因的表達(dá)量在A+處理下達(dá)到最大值。

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái)，逆境脅迫不斷制約著作物的生產(chǎn)。超氧化物歧化酶（SOD）在植物應(yīng)對(duì)鹽、干旱和金屬毒性等不同脅迫中發(fā)揮著重要作用，SOD 基因家族廣泛分布于多種植物中，如擬南芥、谷子[22]、水稻[23]、高粱[24]、棉花、番茄[13]、楊樹[15]和日本落葉松[25]等。本研究對(duì)藜麥SOD 家族基因進(jìn)行了系統(tǒng)和全面的全基因組進(jìn)化分析，結(jié)果顯示，SOD 參與了大量氧化過(guò)程，是保護(hù)植物免受ROS侵害的關(guān)鍵酶，是所有抗氧化酶中的核心酶，是最早參與清除活性氧的物質(zhì)之一。當(dāng)植物應(yīng)答逆境脅迫時(shí)，SODs 可清除生物在脅迫下產(chǎn)生的過(guò)量活性氧，從而有效減少氧化應(yīng)激。SOD 基因在植物適應(yīng)非生物脅迫中的重要作用已被大量研究所證實(shí)，例如植物的異質(zhì)表達(dá)賦予了它們對(duì)多種非生物脅迫的耐受性[26]。本研究在藜麥基因組中鑒定了12個(gè)CqSOD基因，SOD蛋白的氨基酸分子量在13.41～32.43 kD，呈現(xiàn)出顯著的變化。此外，進(jìn)化枝之間的差異可能與外顯子/內(nèi)含子的不同功能和多樣性以及保守的基序結(jié)構(gòu)有關(guān)。根據(jù)結(jié)構(gòu)域和基序?qū)⑵浞譃? 種類型（6 個(gè)Cu/Zn-SOD、4 個(gè)Fe-SOD 和2 個(gè)Mn-SOD），其成員數(shù)量高于擬南芥（7 個(gè)）、蒺藜（7個(gè)）、番茄（8個(gè)）、水稻（8個(gè)）、谷子（8個(gè)）和黃瓜（9 個(gè)），與葡萄（10 個(gè)）、香蕉（13 個(gè)）相近[11]。然而，Cu/ZnSOD、Fe-SOD 和Mn-SOD 的基因數(shù)量在不同物種中出現(xiàn)差異，例如谷子和番茄中有4個(gè)Cu/Zn-SODs、3個(gè)Fe-SODs 和1個(gè)Mn-SOD，而本研究發(fā)現(xiàn)了6 個(gè)Cu/Zn-SODs、4 個(gè)Fe-SODs 和2 個(gè)Mn-SODs。SOD 家族成員數(shù)量的差異可能是由不同物種的基因組大小不同或基因重復(fù)造成的。亞細(xì)胞定位進(jìn)一步研究了SOD 之間的多樣性，12個(gè)SOD 基因分別定位于細(xì)胞質(zhì)（50%）、微體（33%）、線粒體（17%），CqSOD基因的定位需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

研究表明，藻類和苔蘚植物中僅有Fe-SOD 和Mn-SOD，而不存在Cu/Zn-SOD，Cu/Zn-SOD 僅出現(xiàn)于高等植物中，這意味著Fe-SOD 和Mn-SOD 進(jìn)化時(shí)間較早[27]。隨著地球環(huán)境的不斷變化，植物面臨的逆境挑戰(zhàn)變得更加復(fù)雜。Fe-SOD 和Mn-SOD 不足以應(yīng)答復(fù)雜的逆境，因此進(jìn)化出了功能更復(fù)雜的Cu/Zn-SOD 以抵御不利的外部環(huán)境條件，保證植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育[28]。

基因結(jié)構(gòu)分析表明，12個(gè)CqSOD 基因內(nèi)含子數(shù)量不一。已有研究表明，植物SOD 基因的內(nèi)含子模式高度保守，并且在大多數(shù)細(xì)胞質(zhì)和葉綠體SOD 中存在7 個(gè)內(nèi)含子[29]。同樣，本研究中6 個(gè)CqSOD 基因包含7個(gè)內(nèi)含子。SOD 基因結(jié)構(gòu)的差異可能歸因于外顯子/內(nèi)含子的插入/缺失機(jī)制[30]。值得注意的是，CqSOD08 和CqSOD10，CqSOD07和CqSOD09 表現(xiàn)出相似的內(nèi)含子/外顯子組織模式，它們編碼的蛋白質(zhì)高度一致，并在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚集在一起。但是，它們啟動(dòng)子中的順式元件不同，表明它們可以對(duì)不同的逆境條件作出反應(yīng)。內(nèi)含子和外顯子變異在不同基因的進(jìn)化中起主要作用。內(nèi)含子/外顯子和基序結(jié)構(gòu)的變化表明，不同物種之間SOD 基因存在高度的復(fù)雜性。

通過(guò)對(duì)SOD 基因啟動(dòng)子中的順式元件分析發(fā)現(xiàn)，CqSOD 基因存在與非生物脅迫和激素反應(yīng)相關(guān)的2種主要類型的順式元件以及與發(fā)育過(guò)程和組織特異性表達(dá)相關(guān)的順式元件。在SOD 基因啟動(dòng)子中鑒定出一系列與非生物脅迫反應(yīng)相關(guān)的順式元件，如MBS、LTR、富含TC 的重復(fù)序列，它們可能在多種脅迫下調(diào)節(jié)基因表達(dá)。擬南芥、香蕉、水稻、番茄、楊樹、棉花和其他不同植物中的大多數(shù)SOD 基因可以被誘導(dǎo)響應(yīng)各種非生物脅迫，如熱、冷、干旱和鹽度[13，27]，與本研究結(jié)果一致。

非生物脅迫導(dǎo)致的過(guò)量ROS 會(huì)對(duì)藜麥幼苗及產(chǎn)量構(gòu)成威脅。SOD在各種非生物脅迫引起的植物ROS清除響應(yīng)中發(fā)揮著積極作用[31]。藜麥對(duì)混合鹽分的具體響應(yīng)尚不清楚，qRT-PCR使了解CqSOD 基因在藜麥應(yīng)答混合鹽堿脅迫中的功能成為可能。基于對(duì)CqSOD 基因啟動(dòng)子的順式元件的評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)主要存在于光、非生物脅迫和激素反應(yīng)相關(guān)的3種主要順式元件類型。CqSOD 啟動(dòng)子中的順式元件包括富含TC的基序、LTR基序、MBS 基序、ARE 基序和ABRE 基序，為參與非生物脅迫反應(yīng)提供了可能。這些基序參與了植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)，例如香蕉、番茄、蕓苔屬植物、煙草和小米[32-34]。本研究中，12個(gè)CqSOD 基因在混合鹽堿脅迫下的表達(dá)水平發(fā)生了顯著變化，同時(shí)對(duì)混合鹽堿處理的幼苗外源施加SNP也顯著誘導(dǎo)了CqSOD 基因的表達(dá)，表明藜麥SOD 基因在鹽堿脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。上述結(jié)果表明，CqSOD 在鹽脅迫期間對(duì)ROS的解毒具有積極作用，而SNP則不同程度提高了在混合鹽堿脅迫期間CqSOD 基因?qū)OS的解毒能力。

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（責(zé)任編輯：胡立霞）