我國(guó)發(fā)酵魚制品菌群組成與風(fēng)味代謝相關(guān)性研究進(jìn)展

周冰倩，劉永樂(lè)，黃軼群，李向紅，王發(fā)祥，馬夏吟,*

（1.長(zhǎng)沙理工大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410114；2.湖南省水生資源食品加工工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410114）

發(fā)酵是一種古老的保存鮮魚的方法，通過(guò)發(fā)酵不僅可以延長(zhǎng)魚肉的保藏期，還使魚肉的風(fēng)味、質(zhì)地、色澤及營(yíng)養(yǎng)得到增強(qiáng)。發(fā)酵魚制品作為許多國(guó)家飲食文化的重要組成部分，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)，同時(shí)由于不同地區(qū)的發(fā)酵環(huán)境差異較大，發(fā)酵原料和工藝各具特色，因此各地的發(fā)酵魚制品風(fēng)味迥異。根據(jù)不同分類標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)前我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品可以分為以下幾類（圖1）。根據(jù)發(fā)酵方式可分為傳統(tǒng)發(fā)酵和接種發(fā)酵。傳統(tǒng)發(fā)酵法利用環(huán)境所帶的微生物進(jìn)行自然發(fā)酵，發(fā)酵魚產(chǎn)品品質(zhì)受環(huán)境、季節(jié)和經(jīng)驗(yàn)等因素的影響較大，主要存在于家庭式小作坊中；而接種發(fā)酵通過(guò)添加微生物發(fā)酵劑，能夠穩(wěn)定發(fā)酵魚中微生物組成、縮短發(fā)酵周期、提升風(fēng)味品質(zhì)，為傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品提供工業(yè)化發(fā)展方向[1]。發(fā)酵原料中碳水化合物含量也會(huì)影響發(fā)酵過(guò)程中微生物代謝過(guò)程，如在酸魚和鲊魚的制作工藝中通常會(huì)添加熟制米粉，碳水化合物分解后產(chǎn)生的糖類為后續(xù)發(fā)酵提供能量，同時(shí)也產(chǎn)生特殊風(fēng)味物質(zhì)[2-3]。發(fā)酵魚中食鹽添加量對(duì)微生物菌群組成及風(fēng)味形成有重要影響[2,4]。根據(jù)鹽添加量可將發(fā)酵魚分為高鹽發(fā)酵和低鹽發(fā)酵，高鹽發(fā)酵鹽添加量通常超過(guò)總質(zhì)量的20%，而低鹽發(fā)酵鹽添加量占總質(zhì)量的3%～8%[5]。在發(fā)酵過(guò)程中，多種微生物通過(guò)復(fù)雜的代謝過(guò)程促進(jìn)了原料中碳水化合物、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的分解和氧化反應(yīng)，從而產(chǎn)生了一系列低分子質(zhì)量風(fēng)味化合物，形成各地發(fā)酵魚獨(dú)特的風(fēng)味[6]，而不同類型的發(fā)酵魚制品中微生物組成及代謝存在較大差異，且同一種發(fā)酵魚制品的菌群組成隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)處于動(dòng)態(tài)演變的過(guò)程中，因此探究不同發(fā)酵魚制品中微生物菌群組成及其與風(fēng)味形成機(jī)制間的相關(guān)性是實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品產(chǎn)業(yè)化的研究重點(diǎn)之一。

圖1 我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品分類Fig.1 Classification of traditional fermented fish products in China

風(fēng)味物質(zhì)的形成與發(fā)酵魚中多種微生物的代謝活動(dòng)相關(guān)，發(fā)酵魚制品中的微生物豐富多樣，可根據(jù)其對(duì)發(fā)酵的作用分為有益菌、致病菌和腐敗菌。當(dāng)有益菌是優(yōu)勢(shì)菌群時(shí)能夠抑制雜菌生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)促進(jìn)良好風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生，例如，乳酸菌在多種發(fā)酵魚制品中被鑒定為優(yōu)勢(shì)發(fā)酵菌株，能有效抑制魏斯氏菌屬（Weissella）、毛殼菌屬（Chaetomium）等腐敗菌的生長(zhǎng)，并產(chǎn)生令人愉悅的氣味[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，宏基因組、宏轉(zhuǎn)錄組和宏蛋白組等多組學(xué)技術(shù)的聯(lián)用使人們對(duì)發(fā)酵魚中微生物的多樣性有了更多的認(rèn)識(shí)[7]，而基于多維液相/氣相色譜-質(zhì)譜及核磁共振技術(shù)的代謝組學(xué)技術(shù)推動(dòng)了發(fā)酵魚中微生物代謝調(diào)控及特征風(fēng)味的研究，進(jìn)一步促進(jìn)了發(fā)酵魚中微生物演替規(guī)律與風(fēng)味物質(zhì)形成相關(guān)性的研究[8]。不同發(fā)酵魚制品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的含量差別較大，據(jù)報(bào)道可將發(fā)酵魚中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)歸為醇類、醛類、酸類、酮類、酯類、酚類、含氮化合物、芳香化合物、含硫化合物、碳?xì)浠衔锏萚9]。其中醇類化合物主要與碳水化合物、氨基酸和脂肪的代謝相關(guān)，具有蘑菇氣味[10-11]；醛類化合物是脂質(zhì)氧化的降解產(chǎn)物或通過(guò)不飽和脂肪酸在微生物和酶的作用下降解產(chǎn)生[12]，具有令人愉快的氣味，如青草味、麥芽香味、水果香味和奶酪味[13-14]；酮類化合物是微生物發(fā)酵、氧化產(chǎn)生的多不飽和脂肪酸和氨基酸，具有甜味、花香和果香味[15]；酯類化合物通常是由醇和有機(jī)酸的非酶酯化反應(yīng)或微生物的酶催化反應(yīng)形成的，具有芳香氣味[16]。當(dāng)前，標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；莻鹘y(tǒng)發(fā)酵魚制品的發(fā)展趨勢(shì)，因此對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行規(guī)范化控制成為亟需解決的問(wèn)題，而探究發(fā)酵魚中微生物菌落組成及其代謝與風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)制的相關(guān)性則是規(guī)范化控制的理論基礎(chǔ)。本文針對(duì)我國(guó)主要發(fā)酵魚制品的菌落組成、關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)及其相關(guān)性的相關(guān)研究進(jìn)行總結(jié)，為今后探索發(fā)酵魚風(fēng)味形成機(jī)制及對(duì)發(fā)酵魚風(fēng)味進(jìn)行精準(zhǔn)調(diào)控提供參考方向。

1 我國(guó)發(fā)酵魚制品菌群組成與風(fēng)味代謝相關(guān)性

目前我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品的種類約有8 種，其中關(guān)于酸魚、臭鱖魚、魚露及魚醬的研究報(bào)道較多，而魚茶、魚鲊等發(fā)酵魚制品的相關(guān)研究較少。由表1可知，在不同地區(qū)因原料不同導(dǎo)致在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生菌群也存在差異，因而每個(gè)地區(qū)發(fā)酵魚制品的風(fēng)味獨(dú)具一格。

表1 我國(guó)常見(jiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品Table 1 Common traditional fermented fish products in China

1.1 固態(tài)發(fā)酵魚

1.1.1 酸魚

酸魚是貴州省黔東南地區(qū)及江浙地區(qū)的一種傳統(tǒng)佳肴，根據(jù)食鹽添加量可將制作工藝分為高鹽發(fā)酵和低鹽發(fā)酵2 種。貴州地區(qū)的傳統(tǒng)高鹽發(fā)酵酸魚食鹽添加量約為20%，發(fā)酵條件為室溫（25 ℃左右）發(fā)酵4～7 個(gè)月，因其鹽含量較高，因此產(chǎn)品中生物胺、揮發(fā)性鹽基氮和丙二醛含量較低，具有較高安全性[17]。與高鹽發(fā)酵相比，低鹽酸魚食鹽添加量?jī)H為2%～6%，更容易滋生腐敗微生物，因此在傳統(tǒng)發(fā)酵中往往通過(guò)控制發(fā)酵溫度或縮短發(fā)酵時(shí)間來(lái)提高酸魚品質(zhì)，一般發(fā)酵條件為室溫（25 ℃左右）發(fā)酵4 周左右或在較低溫度（15 ℃左右）發(fā)酵24 d左右[4,18-19]。近年來(lái)采用低鹽與發(fā)酵劑結(jié)合強(qiáng)化發(fā)酵法制作酸魚，不僅能縮短發(fā)酵時(shí)間，還起到提升風(fēng)味、提高產(chǎn)品安全性的作用[20]。

鹽含量及發(fā)酵條件的差異導(dǎo)致不同酸魚制品中微生物菌群出現(xiàn)差異。在高鹽發(fā)酵酸魚中常見(jiàn)報(bào)道的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌菌屬為植物乳植桿菌屬、四鏈球菌屬、葡萄球菌屬及魏斯氏菌屬[21-23]。其中植物乳植桿菌在發(fā)酵及風(fēng)味形成中具有主導(dǎo)作用，且其耐鹽能力可達(dá)到20%左右[23]，其菌落數(shù)量與含鹽量具有顯著相關(guān)性[5]。四鏈球菌屬和葡萄球菌屬的耐鹽能力普遍較高，在30%鹽含量下仍然能生長(zhǎng)[55]。而低鹽酸魚制品中菌群組成受發(fā)酵條件的影響較大。在Zang Jinhong等[24]的研究中，鯉魚肉經(jīng)過(guò)3 g/100 mL鹽水腌制48 h、干燥3 h及與玉米粉混合后，在25 ℃條件下發(fā)酵4 周，期間酸魚中植物乳植桿菌和微球菌占主導(dǎo)地位，但其豐度在4 周內(nèi)有較大的波動(dòng)，此外葡萄球菌、乳酸乳球菌、明串珠菌、腸球菌及片球菌屬均占有一定的豐度；在Wang Zehan等[19]的研究中，鯉魚肉經(jīng)過(guò)5%食鹽干腌、干燥、與香料混合后，在8%鹽含量下15 ℃發(fā)酵24 d，期間葡萄球菌在酸魚發(fā)酵前期及中期占絕對(duì)的主導(dǎo)地位，魏斯氏菌屬的豐度則在發(fā)酵后期（8～24 d）才逐漸由0.3%上升至46%左右，而植物乳植桿菌在其中占比非常少。除細(xì)菌外，酵母菌，如釀酒酵母、柯達(dá)酵母、結(jié)合酵母等，因其耐鹽性好且偏好在酸性環(huán)境中生長(zhǎng)，也是酸魚中的常見(jiàn)微生物，與乳酸菌在酸魚風(fēng)味的形成中起協(xié)同作用。相比自然發(fā)酵，接菌強(qiáng)化發(fā)酵對(duì)穩(wěn)定酸魚中菌群組成起到了顯著作用[25]，微生物菌群的差異性及動(dòng)態(tài)變化是造成酸魚制品間或發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)差異性的主要原因，低鹽發(fā)酵酸魚因其微生物組成更為豐富，且符合當(dāng)今減鹽發(fā)酵的健康理念，成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。臧金紅[4]根據(jù)氣味活度值從傳統(tǒng)低鹽酸魚中篩選出乳酸乙酯、十六酸乙酯、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、2-辛烯醛、2-乙?；秽?、辛酸乙酯、苯甲醛和異戊酸等關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。相關(guān)研究表明，醇類和酯類物質(zhì)是低鹽酸魚風(fēng)味組成中的重要部分，其中醇類物質(zhì)在發(fā)酵初期含量較高，而酯類物質(zhì)的含量在成熟期逐步升高[4,18-19]。Zang Jinhong等[24]通過(guò)層次聚類分析將酸魚的發(fā)酵過(guò)程分為3 個(gè)階段：第1階段（0 d）特征風(fēng)味物質(zhì)為1-辛烯-3-醇、丙酮、2-丁酮和2-乙基呋喃；第2階段（0～2 周）產(chǎn)生大量的酸、醛和醇類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，奠定了酸魚的整體風(fēng)味；第3階段（2～4 周）脂類大量產(chǎn)生，增加了酸魚的芳香氣味。脂類風(fēng)味物質(zhì)主要是通過(guò)酯化和醇解途徑生成的，可分為乙酸酯和脂肪酸乙酯2 類。風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生與發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群演變密不可分，在植物乳植桿菌、木糖葡萄球菌及釀酒酵母混菌發(fā)酵的低鹽酸魚中，酵母菌豐度不斷降低，植物乳植桿菌豐度逐步提升，與之成正相關(guān)的乙酸異戊酯、乳酸乙酯及辛酸乙酯等酯類物質(zhì)含量隨之增加[27]。在3 株菌單獨(dú)接種發(fā)酵中，植物乳植桿菌對(duì)酯類物質(zhì)產(chǎn)生的促進(jìn)作用最為顯著，而釀酒酵母對(duì)醇類物質(zhì)含量的促進(jìn)作用最為顯著[11]。同時(shí)Gao Pei等[26]對(duì)植物乳植桿菌、木糖葡萄球菌及釀酒酵母的脂肪代謝及乙酸酯合成能力進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)3 株菌均具有一定的酯酶活性，在低pH值和低水分活度條件下，植物乳植桿菌酯酶活性仍可以維持較高水平；此外，植物乳植桿菌產(chǎn)生乙酸酯的能力強(qiáng)于其余2 種發(fā)酵菌株，被認(rèn)為是參與乙酸異戊酯生成的重要菌株[26]，主要通過(guò)堿性條件下酯化作用和酸性條件下醇解作用2 種途徑生成乙酸酯，其中涉及到的關(guān)鍵酶有羧酸酯酶、醇脫氫酶和醇?；D(zhuǎn)移酶[27]。以上研究表明釀酒酵母與酸魚前期醇類物質(zhì)的產(chǎn)生相關(guān)，而植物乳植桿菌與酸魚發(fā)酵后期酯類風(fēng)味物質(zhì)的增加具有密切聯(lián)系。目前酸魚中菌群組成及特征風(fēng)味物質(zhì)如表2所示。

表2 不同發(fā)酵工藝酸魚中的優(yōu)勢(shì)菌與特征風(fēng)味物質(zhì)Table 2 Dominant bacteria and characteristic flavor substances in traditional high-salt fermented fish produced by different fermentation processes

除發(fā)酵菌株對(duì)脂肪的利用外，微生物對(duì)碳水化合物、蛋白質(zhì)的分解利用及相關(guān)風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生也受到越來(lái)越多關(guān)注[28]。酸魚發(fā)酵過(guò)程中肌漿、肌原纖維蛋白不斷分解成可溶性肽及游離氨基酸，使酸魚鮮味得到提升[29]，一方面有助于發(fā)酵有益菌（植物乳植桿菌和釀酒酵母）快速成為優(yōu)勢(shì)菌株[30]，另一方面，游離氨基酸可作為前體物質(zhì)通過(guò)微生物代謝為多種風(fēng)味物質(zhì)[31]。酸魚中高級(jí)醇、醛，如苯乙醇、苯甲醛和3-甲基-1-丁醇主要通過(guò)氨基酸代謝產(chǎn)生，涉及到的關(guān)鍵酶包括氨基酸脫羧酶、氨基酸轉(zhuǎn)移酶和酮酸脫羧酶，且分析表明，亮氨酸能夠在支鏈氨基酸轉(zhuǎn)氨酶和亮氨酸轉(zhuǎn)氨酶催化下生成3-甲基-1-丁醇，該代謝過(guò)程與葡萄球菌屬密切相關(guān)[25]。Zang Jinhong等[29]利用代謝組學(xué)分析酸魚發(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)形成的代謝途徑及與之相關(guān)聯(lián)的微生物，發(fā)現(xiàn)3 種酵母菌參與糖酵解過(guò)程，而隨后的丙酮酸代謝及混菌發(fā)酵過(guò)程由不同的微生物參與，其中植物乳植桿菌屬、片球菌屬及腸球菌屬參與乙酰輔酶A、有機(jī)酸、醇和醛生成的諸多過(guò)程，酸魚發(fā)酵中碳水化合物的利用過(guò)程不能由某一種屬的微生物單獨(dú)完成，即便是豐度較低的微生物也對(duì)發(fā)酵風(fēng)味的形成有一定的貢獻(xiàn)，但是目前微生物利用碳水化合物及氨基酸產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的代謝途徑還有待深入研究。

1.1.2 臭鱖魚

臭鱖魚的傳統(tǒng)制作工藝分為干腌發(fā)酵法和水腌發(fā)酵法2 種：干腌法采用食鹽擦拭魚體，放入桶內(nèi)自然發(fā)酵；而水腌發(fā)酵法則用淡鹽水噴灑魚體，層層鋪在容器內(nèi)發(fā)酵，待魚鰓仍存淡紅、魚鱗未脫、魚肉散發(fā)出淡臭的風(fēng)味但尚未變質(zhì)時(shí)得到成品[32]。臭鱖魚的發(fā)酵過(guò)程是在低鹽（4%～8%）及厭氧條件下進(jìn)行的短期發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間一般不超過(guò)8 d，參與發(fā)酵的微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜且動(dòng)態(tài)變化較大，因此掌控發(fā)酵程度，進(jìn)行適度發(fā)酵才能產(chǎn)生似臭非臭的獨(dú)特風(fēng)味[1]。對(duì)湖南、湖北和安徽地區(qū)14 個(gè)品牌的臭鱖魚進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著，漫游球菌屬、梭菌屬、嗜冷桿菌屬、植物乳植桿菌屬及肥大桿菌屬等在不同品牌臭鱖魚中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，而真菌菌群結(jié)構(gòu)主要由霉菌構(gòu)成，其中被孢霉門、毛殼霉菌屬、枝孢霉屬及赤霉菌屬的豐度較為相似[33-34]。另一方面，由于臭鱖魚多為整魚發(fā)酵，魚體背部與腹部的菌群組成也存在差異性，其中梭桿菌屬在臭鱖魚腹部的含量顯著高于其在背部魚肉中的含量，而變形菌屬含量則在魚肉腹部較高，這可能與腹部魚肉脂肪含量較高，更適合變形菌屬生長(zhǎng)有關(guān)[35]。

目前臭鱖魚中微生物代謝與風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生機(jī)制的相關(guān)研究多是通過(guò)多組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行的相關(guān)性分析（表3），不同種類臭鱖魚風(fēng)味物質(zhì)鑒定結(jié)果表明，芳樟醇、醛類物質(zhì)、吲哚及三甲胺等含氮物質(zhì)是其中的特征風(fēng)味物質(zhì)[1,8,35-36]。其中含氮化合物是臭鱖魚特征性“臭味”主要來(lái)源，一些細(xì)菌，如希瓦氏菌、弧菌能在厭氧環(huán)境下將三甲胺氧化物還原為三甲胺[36]，梭菌屬則參與吲哚的產(chǎn)生，其前體物質(zhì)可能為色氨酸[15]；嗜冷桿菌和弧菌可通過(guò)微生物酶的作用將脂肪氧化成脂肪醛類，從而促進(jìn)己醛、庚醛、壬醛含量增多[9]；弓形菌屬、嗜冷菌屬和希瓦氏菌是鱖魚發(fā)酵產(chǎn)品中產(chǎn)生風(fēng)味化合物芳樟醇、壬醛、三甲胺、D-檸檬烯、桉樹(shù)醇、己醛、1-辛烯-3-醇的主要微生物[37]；嗜冷桿菌、梭桿菌和氨基酸球菌有助于芳樟醇、三甲胺、吲哚和乙酸香葉酯等風(fēng)味物質(zhì)的形成，但嗜冷桿菌與梭桿菌的過(guò)度發(fā)酵可能會(huì)導(dǎo)致風(fēng)味降低[9]。此外，Yang Daqiao等[8]通過(guò)多肽組學(xué)分析臭鱖魚風(fēng)味肽形成過(guò)程中的蛋白酶，其中內(nèi)肽酶主要為金屬內(nèi)肽酶、天冬氨酸內(nèi)肽酶和半胱氨酸內(nèi)肽酶，而外肽酶主要為氨肽酶和羧肽酶，進(jìn)一步通過(guò)代謝組學(xué)及相關(guān)性分析探究關(guān)鍵肽酶及風(fēng)味肽的形成與漫游球菌、腸球菌、冷桿菌、乳球菌等菌屬之間的關(guān)系，與風(fēng)味物質(zhì)相關(guān)的具體微生物代謝通路尚有待實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

表3 不同發(fā)酵工藝臭鱖魚中的優(yōu)勢(shì)菌與特征風(fēng)味物質(zhì)Table 3 Dominant bacteria and characteristic flavor substances in stinky mandarin fish produced by different fermentation processes

不同于大部分酸魚制品中占優(yōu)勢(shì)地位的乳酸菌，臭鱖魚中的優(yōu)勢(shì)微生物多為腐敗菌或條件致病菌，如梭桿菌屬和嗜冷桿菌屬，這些微生物對(duì)臭鱖魚風(fēng)味形成既有促進(jìn)作用，同時(shí)也有負(fù)面影響，因此利用臭鱖魚中優(yōu)勢(shì)菌屬進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵的相關(guān)研究較少，而接種乳酸菌發(fā)酵成為改善臭鱖魚口感和風(fēng)味的方法[37]。Bao Ruiqi等[1]在臭鱖魚中接種乳酸乳球菌M10和食竇魏斯氏菌M3可縮短29%的發(fā)酵時(shí)間，且2 株菌能促進(jìn)吲哚含量的增加。周迎芹等[34]發(fā)現(xiàn)，接種清酒乳桿菌SMF-L5發(fā)酵的臭鱖魚比自然發(fā)酵臭鱖魚具有更好的色澤、質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味品質(zhì)，清酒乳桿菌SMF-L5可作為優(yōu)良的乳酸菌發(fā)酵劑在臭鱖魚工業(yè)化生產(chǎn)上具有應(yīng)用潛力。

1.2 半固態(tài)發(fā)酵魚

魚醬是一種深受我國(guó)消費(fèi)者喜愛(ài)的半固體調(diào)味品，傳統(tǒng)制作方法需將魚塊與香辛料混合發(fā)酵1 年左右[39]，在發(fā)酵過(guò)程中，魚肉蛋白在內(nèi)源酶及微生物蛋白酶的作用下發(fā)生水解，逐步由固體變成半固體狀，因此現(xiàn)代生產(chǎn)工藝中，往往通過(guò)破碎魚肉、添加外源蛋白酶或添加蛋白酶產(chǎn)量高的發(fā)酵劑加快蛋白的水解過(guò)程，縮短發(fā)酵周期至8 周左右[40]。研究表明，傳統(tǒng)發(fā)酵魚醬酸與采用現(xiàn)代發(fā)酵工藝制作的魚醬在菌群組成上具有顯著差異：雷山魚醬酸中占優(yōu)勢(shì)地位的細(xì)菌菌屬為節(jié)桿菌屬（11.246%）和雷爾氏菌屬（10.929%）[41]；而在實(shí)驗(yàn)室中自然發(fā)酵的魚辣椒醬優(yōu)勢(shì)菌屬為乳桿菌（45.76%）和魏斯氏菌（36.49%）[41]，這可能與二者發(fā)酵環(huán)境及發(fā)酵時(shí)間的差異有關(guān)。

另一方面，傳統(tǒng)市售魚醬酸調(diào)味品的特征揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)為酸類、烯萜類和酯類，這3 類風(fēng)味物質(zhì)含量占揮發(fā)性物質(zhì)總量80%以上[41]，其中烯萜類物質(zhì)大多數(shù)來(lái)自于香辛料和辣椒[41-42]，這類烯烴氣味強(qiáng)烈、閾值較低。在實(shí)驗(yàn)室中，由具有較好蛋白分解能力的畢赤酵母、木糖葡萄球菌、肉葡萄球菌、戊糖片球菌和乳酸片球菌組成的混合發(fā)酵劑被用來(lái)制作魚醬[40,43-44]，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)強(qiáng)化發(fā)酵魚醬的風(fēng)味組成發(fā)生變化：在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中，酯類物質(zhì)含量顯著提升，而醇類物質(zhì)含量則減少，這與菌株的脂肪水解能力相關(guān)；氨基酸總量也顯著提升，其中甜味氨基酸（絲氨酸和甘氨酸）、鮮味氨基酸（谷氨酸和天冬氨酸）及風(fēng)味物質(zhì)前體氨基酸（支鏈氨基酸）含量與自然發(fā)酵組相比顯著增加[43]。在Zhou Yue等[45]對(duì)發(fā)酵魚醬的研究中，通過(guò)代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，接種貝萊斯芽孢桿菌對(duì)氨基酸代謝通路的影響最為顯著，其中賴氨酸、丙氨酸、精氨酸、谷氨酸、支鏈氨基酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝均受到影響，氨基酸含量的增加不僅提供了甜味和咸味物質(zhì)，同時(shí)氨基酸代謝的加強(qiáng)促進(jìn)了琥珀酸、乙酸等風(fēng)味物質(zhì)生成。因此在魚醬的強(qiáng)化發(fā)酵中，菌株的酯酶活性和蛋白酶活性是首要考慮因素[45]，此外，還可以通過(guò)添加外源賴氨酸的方法提高發(fā)酵魚醬風(fēng)味品質(zhì)[46]。

1.3 液態(tài)發(fā)酵魚

魚露是一種由低值魚類及其加工副產(chǎn)物發(fā)酵制成的液體調(diào)味品，汁液呈棕紅色或紅褐色，不僅滋味鮮美且富含小分子、蛋白肽、礦物質(zhì)元素、?；撬岬戎匾獱I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是東南亞地區(qū)普遍使用的一種水產(chǎn)調(diào)味品。傳統(tǒng)魚露發(fā)酵方法是將原料與鹽混合，置于日光下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間腌漬和自然發(fā)酵后將發(fā)酵物進(jìn)行過(guò)濾，再通過(guò)后期勾兌、煮沸滅菌等工藝得到成品[49]。傳統(tǒng)魚露發(fā)酵周期可長(zhǎng)達(dá)2～3 年，因此食鹽添加量很高（可達(dá)20%）[50]，現(xiàn)代魚露在傳統(tǒng)工藝的基礎(chǔ)上，通過(guò)加曲、加酶、保溫等技術(shù)可達(dá)到縮短釀造周期、降低鹽度及減少腥味的目的[51-54]。傳統(tǒng)魚露發(fā)酵中占優(yōu)勢(shì)地位的多為耐鹽能力較強(qiáng)的微生物，李春生等[52]研究魚露在12 個(gè)月發(fā)酵過(guò)程中的菌群演替規(guī)律，發(fā)現(xiàn)在前6 個(gè)月中鹽厭氧菌屬為主要優(yōu)勢(shì)屬，其豐度從初期的3.08%增長(zhǎng)至42.46%，但隨后鹽厭氧菌屬豐度有所下降，而發(fā)光桿菌屬、四聯(lián)球菌屬、鹽單胞菌屬的相對(duì)豐度增加，在發(fā)酵后期則以鹽單胞菌屬為主要優(yōu)勢(shì)菌屬。Du Fangmin等[53]也有類似報(bào)道，在發(fā)酵后期四聯(lián)球菌屬代替鹽厭氧菌屬成為優(yōu)勢(shì)菌屬。

目前已有研究報(bào)道了不同發(fā)酵工藝制作魚露中菌群組成及特征性風(fēng)味物質(zhì)，如表4所示。其中以耐鹽菌為主的發(fā)酵促使魚露形成了獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)，在一些研究中3-甲硫基丙醛和1-辛烯-3-醇為魚露特征風(fēng)味化合物[54-57]，其中3-甲硫基丙醛帶有土豆香味，1-辛烯-3-醇帶有蘑菇香味。通過(guò)代謝組學(xué)的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)3-甲硫基丙醛和1-辛烯-3-醇的產(chǎn)生與鹽厭氧菌具有正相關(guān)性[53]。此外，鹽厭氧菌屬還與魚露中三甲胺的產(chǎn)生具有正相關(guān)性，與乙酸乙酯的產(chǎn)生呈顯著負(fù)相關(guān)，尤其在發(fā)酵后期鹽單胞菌屬（Halomonas）對(duì)魚露的揮發(fā)性風(fēng)味起到了重要的作用，從而抑制水果香味的形成，促進(jìn)魚腥味的產(chǎn)生[54]。

表4 不同發(fā)酵工藝魚露中的優(yōu)勢(shì)菌與特征風(fēng)味物質(zhì)Table 4 Dominant bacteria and characteristic flavor substances in fish sauce produced by different fermentation processes

研究發(fā)現(xiàn)，耐鹽菌體內(nèi)的各種酶類在魚露的高鹽環(huán)境下也能保持活性，Wang Yueqi等[57]利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析魚露在12 個(gè)月發(fā)酵過(guò)程中的蛋白變化，發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵中期（3～6 個(gè)月）魚露中的蛋白質(zhì)含量最高、變化最大，而在所有鑒定的蛋白質(zhì)中，氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)與代謝相關(guān)的酶類蛋白質(zhì)含量最高，肽酶在發(fā)酵過(guò)程中的變化較大。經(jīng)過(guò)基因組比對(duì)分析，這些蛋白質(zhì)多來(lái)自于鹽厭氧菌屬、嗜冷菌屬、發(fā)光桿菌屬和四聯(lián)球菌屬[58]。蛋白酶及肽酶水解蛋白質(zhì)產(chǎn)生的氨基酸是多種風(fēng)味物質(zhì)前體，且研究[59]表明，魚露發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶活性與風(fēng)味物質(zhì)呈正相關(guān)。

2 發(fā)酵魚中菌群組成與風(fēng)味物質(zhì)研究方法

2.1 發(fā)酵魚中風(fēng)味物質(zhì)的測(cè)定方法

風(fēng)味在中文中是指嗅覺(jué)、味覺(jué)和三叉神經(jīng)特性的復(fù)雜結(jié)合，包括滋味和氣味兩部分[60]，一直以來(lái)發(fā)酵食品的滋味和氣味都是研究熱點(diǎn)。因?yàn)榘l(fā)酵魚肉中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的成分具有復(fù)雜性和不穩(wěn)定性，不同提取方法、檢測(cè)方法及判斷標(biāo)準(zhǔn)得到的樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成及含量可能存在差異。目前發(fā)酵魚制品揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)提取及檢測(cè)鑒定的最常用方法為HS-SPME-GC-MS，該方法對(duì)大分子風(fēng)味物質(zhì)具有較高靈敏度，但對(duì)低分子質(zhì)量及痕量化合物的分辨能力較弱[61]。一些研究中采用HS-GC-IMS方法測(cè)定揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，能夠顯著提高精確度和靈敏度，同時(shí)HS-GC-IMS可以清楚地反映發(fā)酵過(guò)程中魚肉風(fēng)味物質(zhì)組成變化，但是GC-IMS數(shù)據(jù)庫(kù)具有局限性，阻礙了對(duì)風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)一步定量分析[9]。人類嗅覺(jué)系統(tǒng)對(duì)不同的風(fēng)味化合物存在不同的閾值，而GC-MS或GC-IMS只能通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定出化合物的種類及含量，無(wú)法用于確定單一揮發(fā)性成分對(duì)最終整體風(fēng)味的貢獻(xiàn)大小，因此，氣味活性值（odor active value，OAV）通常被用于評(píng)價(jià)風(fēng)味物質(zhì)對(duì)整體香氣的貢獻(xiàn)，對(duì)某種香氣物質(zhì)而言，其OAV為含量與閾值的比值，OAV大于1時(shí)表明該物質(zhì)是食品的關(guān)鍵風(fēng)味成分[8,62]。在發(fā)酵食品中，一些含量較低的揮發(fā)性物質(zhì)不能被GC-MS或GC-IMS檢測(cè)出，但其嗅覺(jué)閾值較低，OAV較高，可能是重要風(fēng)味物質(zhì)。隨著分子感官科學(xué)發(fā)展，GC-O逐步被用于發(fā)酵魚制品關(guān)鍵特征性風(fēng)味物質(zhì)的檢測(cè)中[31]。GC-O法是一種將嗅覺(jué)和儀器檢測(cè)結(jié)合起來(lái)的分析技術(shù)，利用人類嗅覺(jué)比任何儀器都要靈敏的特點(diǎn)，令嗅辨員在氣味儀出口處記錄所聞到的香氣，定性描述香氣信息及香氣強(qiáng)度[62]。此外，電子鼻是快速分析樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的一種方法，但該方法不能對(duì)風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定[63]。

以上所述的風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，因此一些研究采用了多種方法結(jié)合的手段來(lái)準(zhǔn)確、全面地分析發(fā)酵魚制品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，如利用HS-SPME-GC-MS和GC-IMS結(jié)合、HS-SPME-GC-MS和電子鼻結(jié)合甚至3 種方法結(jié)合的手段鑒定風(fēng)味物質(zhì)。Nie Shi等[64]研究發(fā)酵鱸魚風(fēng)味物質(zhì)，分別利用GC-IMS和GC-MS鑒定出36、104 種風(fēng)味化合物，其中20 種物質(zhì)被2 種方法共同檢出，一些烴類化合物僅在GC-MS方法中被檢測(cè)到，這可能與GC-MS中采用了HS-SPME的提取方法從而獲得了更多的風(fēng)味化合物有關(guān)。在對(duì)發(fā)酵草魚關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的研究中，利用HS-SPME-GC-MS和GC-O的方法分別鑒定出80、44 種風(fēng)味化合物，共有21 種物質(zhì)被2 種方法共同鑒定出來(lái)，其中OAV大于1的關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)主要包括與水果香氣相關(guān)的乙酸乙酯、己酸乙酯等酯類，以及與刺激性氣味和不良風(fēng)味相關(guān)的醛類（乙醛、己醛等）；此外，還可以將GC-O與GC-MS結(jié)合，采用GC-O-MS方法對(duì)特征風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行定量描述[65]。

在對(duì)發(fā)酵魚制品非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的研究中，探究游離氨基酸、游離脂肪酸及有機(jī)酸的組成及含量是分析影響發(fā)酵魚制品滋味的重要因素。此外，一些研究對(duì)樣品中可能的風(fēng)味肽進(jìn)行探究，Yang Daqiao等[8]通過(guò)組學(xué)技術(shù)研究表明，漫游球菌、消化鏈球菌、不動(dòng)桿菌、嗜冷桿菌、腸球菌屬產(chǎn)蛋白酶微生物屬對(duì)鮮味肽的形成起主要作用。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，組學(xué)分析的方法越來(lái)越多地被用在發(fā)酵魚制品微生物組成及其代謝的研究中，代謝組學(xué)技術(shù)逐步被應(yīng)用在發(fā)酵魚制品的風(fēng)味物質(zhì)檢測(cè)中，該技術(shù)能夠分析揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)代謝物譜，并說(shuō)明風(fēng)味物質(zhì)與非揮發(fā)性物質(zhì)之間的相關(guān)性。

2.2 發(fā)酵魚中微生物菌群組成研究方法

復(fù)雜的微生物代謝是發(fā)酵魚制品風(fēng)味形成的關(guān)鍵，因此，探究發(fā)酵魚制品中微生物菌群組成及其代謝網(wǎng)絡(luò)成為研究的熱點(diǎn)。近幾年，國(guó)內(nèi)外對(duì)微生物的分析技術(shù)主要以高通量測(cè)序?yàn)橹?，由于?xì)菌在發(fā)酵魚制品風(fēng)味品質(zhì)的形成中占主導(dǎo)作用，因此研究多針對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V3～V4序列進(jìn)行分析，探究發(fā)酵魚中細(xì)菌的菌群組成[19,36-37]；此外，發(fā)酵酸魚的研究中有學(xué)者以內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列為對(duì)象分析其中的真菌菌群組成[15]。除高通量測(cè)序以外，基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)也被用來(lái)分析發(fā)酵魚制品中細(xì)菌的菌群組成[1]。以上2 種方法分別對(duì)發(fā)酵魚中的細(xì)菌和真菌菌群的組成及豐度進(jìn)行分析，對(duì)樣品中全部微生物豐度進(jìn)行分析的相關(guān)研究較少，而宏基因組學(xué)可以較好地解決該問(wèn)題[19]。同時(shí)，宏基因組學(xué)能夠?qū)Νh(huán)境樣品所包含的全部微生物的遺傳組成及其群落功能進(jìn)行分析，不僅能夠得到樣品中微生物菌群組成及豐度，還可以對(duì)微生物基因功能分布及次生代謝物生物合成途徑進(jìn)行深入分析。

2.3 微生物代謝與風(fēng)味物質(zhì)形成的相關(guān)性研究

當(dāng)前對(duì)發(fā)酵魚中微生物組成及代謝與風(fēng)味物質(zhì)形成之間的相關(guān)性，存在包括Spearman相關(guān)性分析、冗余分析、偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLS）分析、正交偏最小二乘回歸分析及雙向正交偏最小二乘（bidirectional orthogonal partial least squares，O2PLS）等多種分析方法。其中Spearman相關(guān)性分析僅能對(duì)2 組變量進(jìn)行線性分析，而不能檢測(cè)多個(gè)變量之間的關(guān)系，一般用于微生物菌落與風(fēng)味物質(zhì)間相關(guān)性的初步分析[15,33-34,36]，此外，Yuan Li等[28]采用利氏腸球菌和乳酸腸球菌混合接種發(fā)酵，與自然發(fā)酵13 d的發(fā)酵魚進(jìn)行研究，通過(guò)Spearman相關(guān)性分析表明蛋白酶活性和發(fā)酵魚質(zhì)構(gòu)與辛醛、壬醛等多種風(fēng)味物質(zhì)呈顯著正相關(guān)。更為常用的組學(xué)數(shù)據(jù)分析方法為PLS，PLS結(jié)合冗余分析不僅可用于微生物組學(xué)數(shù)據(jù)與關(guān)鍵風(fēng)味化合物之間的相關(guān)性分析[10]，也可以用于多組風(fēng)味化合物數(shù)據(jù)之間的比較分析[19]。而多組學(xué)數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性常用O2PLS模型進(jìn)行整合，O2PLS模型是偏最小二乘法的擴(kuò)展，使用O2PLS模型進(jìn)行組學(xué)相關(guān)性分析不僅可以獲得相關(guān)性系數(shù)，還可以獲得變量在模型中的權(quán)重變量投影重要性（variable important for the projection，VIP），該方法被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵魚制品中主要游離氨基酸、脂肪酸、特征性風(fēng)味物質(zhì)、關(guān)鍵微生物菌屬及關(guān)鍵酶類的預(yù)測(cè)。Yang Daqiao等[8]利用O2PLS模型，依據(jù)VIP≥1.2選取對(duì)臭鱖魚鮮味形成有貢獻(xiàn)的38 種鮮味肽，對(duì)臭鱖魚中產(chǎn)蛋白酶的10 株菌株與38 種鮮味肽進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，得出漫游球菌屬、消化鏈球菌屬、不動(dòng)桿菌屬、嗜冷桿菌屬、腸球菌屬對(duì)34 簇同源性基團(tuán)鮮味肽的形成有重要作用。

3 結(jié)語(yǔ)

發(fā)酵魚制品因其較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和感官、風(fēng)味品質(zhì)具有良好的市場(chǎng)前景和發(fā)展?jié)摿?，但發(fā)酵過(guò)程中微生物菌群組成的不確定性導(dǎo)致的風(fēng)味品質(zhì)不穩(wěn)定是阻礙其市場(chǎng)化及規(guī)?；闹饕?，因此研究發(fā)酵魚制品微生物菌群組成與風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生的相關(guān)性機(jī)制成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。綜上所述，當(dāng)前研究存在以下幾點(diǎn)問(wèn)題：微生物菌群組成與風(fēng)味物質(zhì)形成的關(guān)系研究多是基于2 種或多種組學(xué)數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性分析，結(jié)論多基于分析預(yù)測(cè)，缺少代謝通路、關(guān)鍵酶及關(guān)鍵基因在某類風(fēng)味物質(zhì)產(chǎn)生過(guò)程中的功能驗(yàn)證等；得出的相關(guān)性分析結(jié)果未能反向指導(dǎo)發(fā)酵魚的生產(chǎn)過(guò)程，缺乏基于微生物菌群控制的發(fā)酵魚風(fēng)味調(diào)控技術(shù)，相關(guān)理論有待進(jìn)一步研究；利用優(yōu)良菌株進(jìn)行強(qiáng)化發(fā)酵是發(fā)酵魚產(chǎn)品工業(yè)化的發(fā)展方向，因此強(qiáng)化發(fā)酵條件下發(fā)酵劑對(duì)微生物菌群組成及風(fēng)味物質(zhì)代謝的影響機(jī)制有待進(jìn)一步研究。