CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在食源性病原菌檢測(cè)中的研究進(jìn)展

張 琪，龐立冬，蘇群超，宋丹靚敏，楊鑫焱，姜毓君，張 微

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

食品安全是目前全世界各國(guó)都面臨的公共問(wèn)題之一，長(zhǎng)期以來(lái)持續(xù)受到各國(guó)政府及民眾的高度關(guān)注[1]。在每年報(bào)道的食品安全事件中，由食源性病原菌所引起的食物中毒事件占45%，食源性疾病的頻發(fā)不但嚴(yán)重危及人體健康，而且給社會(huì)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。食源性病原菌主要包括產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等，食用這些病原菌或毒素污染的食品后會(huì)出現(xiàn)腹痛腹瀉、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重者則會(huì)損壞呼吸、神經(jīng)系統(tǒng)甚至危及生命[3]。因此，實(shí)現(xiàn)對(duì)食源性病原菌的及時(shí)、快速檢測(cè)在保障食品安全方面至關(guān)重要。

隨著食源性病原菌檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展，從最早期的傳統(tǒng)檢測(cè)手段開(kāi)始，已發(fā)展出多種新型檢測(cè)技術(shù)。很多經(jīng)典技術(shù)，如傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法，雖然一直被作為檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)周期長(zhǎng)、操作繁瑣等缺點(diǎn)限制了其在檢測(cè)中的應(yīng)用[4]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）也是較為常用的病原菌檢測(cè)手段，在檢測(cè)時(shí)間上優(yōu)于培養(yǎng)法，但對(duì)溫度及環(huán)境要求較為嚴(yán)格，此外還需要昂貴的儀器和專業(yè)的操作人員，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的要求。每種方法都有不同的技術(shù)操作缺點(diǎn)，這些局限性限制了其在分子檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用。而相對(duì)方便的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)在恒定溫度下可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的快速?gòu)?fù)制與積累，該方法無(wú)需特殊的儀器、核酸擴(kuò)增效率高，即使存在抑制成分也能達(dá)到優(yōu)異擴(kuò)增，適用于即時(shí)檢測(cè)（point of care testing，POCT），因此等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)被視為食源性病原菌檢測(cè)的理想方法，但其應(yīng)用受到非特異性擴(kuò)增的阻礙，容易造成結(jié)果的不準(zhǔn)確[5]。簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其關(guān)聯(lián)蛋白（CRISPRassociated protein，Cas）組成的CRISPR/Cas系統(tǒng)憑借自身新穎的反式切割活性進(jìn)行信號(hào)放大，被稱為“下一代分子診斷技術(shù)”。然而，在沒(méi)有預(yù)擴(kuò)增的情況下，CRISPR/Cas系統(tǒng)難以產(chǎn)生單個(gè)靈敏的檢測(cè)信號(hào)，這限制了其在食源性病原菌檢測(cè)中的應(yīng)用[6-7]?，F(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)存在一定劣勢(shì)，亟待新興檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn)及應(yīng)用，因此，將CRISPR/Cas系統(tǒng)與等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相結(jié)合，可以作為病原菌的快速檢測(cè)手段[8]。其原理為：首先以等溫方式對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增，之后由CRISPR系統(tǒng)中的向?qū)NA識(shí)別擴(kuò)增子的特定序列而產(chǎn)生特異性擴(kuò)增檢測(cè)信號(hào)。這種聯(lián)用技術(shù)將等溫?cái)U(kuò)增的高效率與CRISPR的準(zhǔn)確識(shí)別結(jié)合在一起，可以提高檢測(cè)的靈敏度和特異性，在實(shí)現(xiàn)食源性病原菌靈敏和精準(zhǔn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方面顯示出了巨大潛力[9-10]。

本文對(duì)CRISPR/Cas和等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)組合的快速檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，概述CRISPR/Cas系統(tǒng)的分類以及該系統(tǒng)與等溫?cái)U(kuò)增結(jié)合后在食源性病原菌檢測(cè)方面的研究進(jìn)展。進(jìn)一步對(duì)納米材料和功能核酸（functional nucleic acids，F(xiàn)NAs）介導(dǎo)的信號(hào)輸出方式在CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增組合中的應(yīng)用進(jìn)行相應(yīng)的歸納。最后，展望并分析CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增組合在食品安全控制應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)和未來(lái)前景，以期為該技術(shù)的推廣與應(yīng)用建立一定基礎(chǔ)。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)及分類

CRISPR/Cas系統(tǒng)是存在于細(xì)菌和古細(xì)菌中的一系列防御機(jī)制，最早在大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)[11]。這種防御機(jī)制的基本原理是入侵因子如病毒、質(zhì)粒等衍生的短片段被捕獲并整合到CRISPR序列位點(diǎn)中建立遺傳記憶，隨后將這些DNA轉(zhuǎn)錄加工成成熟的CRISPR RNA（crRNA）作為向?qū)NA，與Cas效應(yīng)蛋白組裝后形成的復(fù)合物可以特異性識(shí)別并切割與crRNA互補(bǔ)的靶標(biāo)序列，從而使細(xì)菌能更好地識(shí)別并防御外來(lái)入侵因子的侵害。憑借這一優(yōu)勢(shì)，CRISPR/Cas系統(tǒng)成為一種靈活的基因編輯工具[12]。

在目前的研究中，根據(jù)Cas效應(yīng)蛋白的不同可將CRISPR系統(tǒng)分為2 類：第1類是具有多亞基效應(yīng)子的系統(tǒng)，每種效應(yīng)蛋白在CRISPR生物傳感系統(tǒng)中發(fā)揮單一作用，第2類是具有單效應(yīng)子的系統(tǒng)，每種效應(yīng)子在系統(tǒng)中發(fā)揮多種功能[13-14]。Cas效應(yīng)蛋白具體可分為6 種類型（I～VI），第1類包括I型、III型、IV型，第2類包括II型、V型和VI型[15]。目前，所應(yīng)用的CRISPR/Cas系統(tǒng)多數(shù)基于II型的Cas9、V型的Cas12、Cas14和VI型的Cas13效應(yīng)蛋白，其可高效完成靶標(biāo)序列的識(shí)別和切割，已被廣泛應(yīng)用于生物傳感領(lǐng)域[16-17]。其中V、VI型Cas效應(yīng)蛋白具有反式切割活性，即效應(yīng)蛋白的切割活性一經(jīng)激活后可以以極高的活性切割任意序列的單鏈DNA（single-stranded DNA，ssDNA），利用這一特性CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13及CRISPR/Cas14系統(tǒng)已被開(kāi)發(fā)成高靈敏度核酸檢測(cè)工具。根據(jù)Cas效應(yīng)蛋白特性的不同，用于病原菌快速檢測(cè)的CRISPR/Cas系統(tǒng)可分為3 種類型：1）當(dāng)靶標(biāo)物質(zhì)存在時(shí)，向?qū)NA可特異性地對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)識(shí)別并結(jié)合進(jìn)行檢測(cè)，此類CRISPR系統(tǒng)所依賴的Cas效應(yīng)蛋白通常具有特異性識(shí)別并捕獲靶標(biāo)的功能而不表現(xiàn)核酸酶切活性，如Cas9蛋白的突變體dCas9[18]；2）當(dāng)靶標(biāo)物質(zhì)存在時(shí)，向?qū)NA激活Cas效應(yīng)蛋白對(duì)靶標(biāo)物質(zhì)的切割活性，對(duì)其進(jìn)行特異性識(shí)別并切割，以達(dá)到快速檢測(cè)的目的，此類Cas效應(yīng)蛋白包括Cas9及其突變體Cas9nD10A；3）當(dāng)靶標(biāo)物質(zhì)存在時(shí)，向?qū)NA將激活Cas效應(yīng)蛋白的切割活性，引導(dǎo)效應(yīng)蛋白對(duì)非靶標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行切割，這類CRISPR系統(tǒng)常用的效應(yīng)蛋白為Cas12a、Cas13a和Cas14a。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為第1個(gè)用于真核生物細(xì)胞基因編輯的CRISPR平臺(tái)，Cas9效應(yīng)蛋白在其中充當(dāng)核酸內(nèi)切酶的角色，包括HNH和RuvC 2 個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域，由反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）和crRNA賦予其切割雙鏈DNA（double-stranded DNA，dsDNA）的功能，并且tracrRNA與crRNA可連接成單一向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）[19]。在識(shí)別DNA時(shí)，目標(biāo)序列下方需要有一個(gè)特定的短DNA序列片段，稱為原間隔相鄰序列（protospacer adjacent motif，PAM）。Cas9通常識(shí)別富含G的PAM，保障不會(huì)切除自身DNA，因此特性，其參與防止自身免疫疾病的機(jī)制[20]。sgRNA作為Cas9的向?qū)NA，與Cas9結(jié)合使其產(chǎn)生活性，通過(guò)HNH結(jié)構(gòu)域可切割位于PAM上游3 bp處與crRNA互補(bǔ)的DNA鏈；通過(guò)RuvC結(jié)構(gòu)域可切割位于PAM上游3～8 bp處與crRNA非互補(bǔ)的DNA鏈[21-22]。研究人員還通過(guò)對(duì)HNH和RuvC 2 種催化結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變形成Cas9n和dCas9 2 種蛋白突變體，其中CRISPR/Cas9n系統(tǒng)用于基因編輯可大幅降低脫靶活性[23]。

與Cas9相似，Cas12效應(yīng)蛋白在CRISPR系統(tǒng)中也充當(dāng)核酸內(nèi)切酶的角色，近幾年逐漸成為Cas9的替代品用于基因編輯。Cas12可以識(shí)別并切割與富含T的PAM序列相鄰的靶標(biāo)dsDNA，憑借這一特點(diǎn)在多重基因編輯方面得到廣泛應(yīng)用[24]。Cas12效應(yīng)蛋白包括Cas12a和Cas12b，其中Cas12a來(lái)自V-A-CRISPR系統(tǒng)，又稱為Cpf1，Cas12b來(lái)自V-B-CRISPR系統(tǒng)，又稱為C2c1。常用的Cas12a通常由單個(gè)crRNA作為向?qū)NA，Cas12b則需要tracrRNA和crRNA同時(shí)引導(dǎo)。此外，Cas12a和Cas12b的核酸結(jié)構(gòu)域也有不同：Cas12a的核酸結(jié)構(gòu)域?yàn)镽uvC和Nuc，Nuc結(jié)構(gòu)域不直接影響靶DNA，而是協(xié)助RuvC間接起作用；Cas12b的核酸結(jié)構(gòu)域僅為RuvC。

Cas13效應(yīng)蛋白是近幾年發(fā)現(xiàn)的，與Cas9和Cas12不同的是，Cas13僅可靶向識(shí)別并切割單鏈RNA（singlestranded RNA，ssRNA），由于其沒(méi)有RuvC結(jié)構(gòu)域，不具備DNA酶活性，對(duì)于dsRNA、ssDNA和dsDNA無(wú)靶向識(shí)別和切割功能[25-26]。Cas13效應(yīng)蛋白也分為Cas13a（被稱為C2c2）和Cas13b 2 種亞型，其中Cas13a較為常用[27]。二者在切割底物機(jī)制方面存在一些差異，Cas13a僅需要crRNA作為向?qū)NA，能夠在沒(méi)有tracrRNA的情況下識(shí)別含有前間隔側(cè)翼序列（protospacer flanking sequence，PFS）的位點(diǎn)，通過(guò)2 個(gè)結(jié)構(gòu)域HEPN切割RNA，顯示其非特異性反式切割活性。目前Cas13b的作用機(jī)制尚未研究成熟，但部分研究顯示，與Cas13a相比，Cas13b在RNA編輯方面更為精確，可由成熟的crRNA輔助識(shí)別PFS位點(diǎn)，從而進(jìn)行非特異性的RNA切割[28]。

Cas14是近幾年發(fā)現(xiàn)的新興效應(yīng)蛋白，與其他效應(yīng)蛋白相比，Cas14僅由400～700 個(gè)氨基酸組成，幾乎是其他效應(yīng)蛋白體積的一半[29]。Cas14效應(yīng)蛋白作為由RNA引導(dǎo)的DNA核酸酶，可在crRNA和tracrRNA的指導(dǎo)下通過(guò)RuvC識(shí)別并切割ssDNA，正是由于Cas14效應(yīng)蛋白極小的體積，在切割ssDNA時(shí)不需要特定的PAM序列，對(duì)于DNA的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）的特異性更高[30]。此外，在識(shí)別靶標(biāo)DNA的同時(shí)也展示了其對(duì)ssDNA的附帶切割活性，這些特征使Cas14效應(yīng)蛋白在生物傳感方面展現(xiàn)出更大的優(yōu)勢(shì)，在未來(lái)的研究中不僅可以用于基因組工程，還可用于病毒篩選及病原體檢測(cè)等相關(guān)平臺(tái)[31-32]。

2 CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)系統(tǒng)及其應(yīng)用

2.1 CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)系統(tǒng)

CRISPR/Cas系統(tǒng)作為一種可特異性識(shí)別靶標(biāo)序列并具有催化信號(hào)放大功能的檢測(cè)技術(shù)，可直接用于靶標(biāo)序列的檢測(cè)。但目前的研究中仍需要對(duì)靶標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增才能使檢測(cè)靈敏度達(dá)到要求[33]。在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)一般需要核酸提取、核酸擴(kuò)增、信號(hào)生成及信號(hào)輸出4 個(gè)步驟[34]。因此，需要將CRISPR/Cas系統(tǒng)與核酸擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合以提高其檢測(cè)性能。在POCT領(lǐng)域的應(yīng)用可分為CRISPR/Cas系統(tǒng)的預(yù)擴(kuò)增和擴(kuò)增前CRISPR。圖1展示了CRISPR/Cas系統(tǒng)結(jié)合滾環(huán)擴(kuò)增（rolling circle amplification，RCA）、重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）、重組酶輔助擴(kuò)增（recombinase aidedamplification，RAA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）以及鏈置換擴(kuò)增（strand displacement amplification，SDA），并以納米材料和FNAs為信號(hào)輸出方式用于食源性病原菌檢測(cè)的示意圖；表1詳細(xì)概述了不同CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增組合檢測(cè)不同病原菌時(shí)的信號(hào)輸出方式、靈敏度及線性范圍。

表1 基于不同CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)組合的病原菌檢測(cè)關(guān)鍵特征Table 1 Key features of pathogen detection based on different CRISPR/Cas-isothermal amplification combinations

圖1 CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)用于食源性病原菌檢測(cè)的示意圖Fig.1 Schematic diagram of CRISPR/Cas-isothermal amplification technology for foodborne pathogen detection

2.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的預(yù)擴(kuò)增

為進(jìn)一步提升檢測(cè)的靈敏度，檢測(cè)之前需要對(duì)核酸進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增富集靶標(biāo)分子，之后由向?qū)NA引導(dǎo)的特定序列特異性地產(chǎn)生擴(kuò)增檢測(cè)信號(hào)。在近年來(lái)的研究中，CRISPR/Cas系統(tǒng)的預(yù)擴(kuò)增已廣泛應(yīng)用于食品安全檢測(cè)平臺(tái)。表2描述了常見(jiàn)等溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)的主要特征。

表2 常見(jiàn)等溫?cái)U(kuò)增系統(tǒng)的主要特征Table 2 Major characteristics of common isothermal amplification platforms

2.2.1 CRISPR/Cas-RCA技術(shù)檢測(cè)系統(tǒng)

RCA是一種高效的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其原理為核苷酸鏈退火到環(huán)狀DNA模板上，隨后引物在DNA聚合酶的作用下沿著5′至3′的方向通過(guò)環(huán)狀模板的循環(huán)擴(kuò)展而延長(zhǎng)。RCA與其他技術(shù)相比具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，通過(guò)設(shè)計(jì)圓形模板序列，在適配體、DNA酶等的作用下定制所需要的RCA產(chǎn)物，極大拓寬了其應(yīng)用范圍[55]。同時(shí)RCA技術(shù)憑借自身出色的效率、高效的選擇性及其多功能性在生物檢測(cè)和分析中得到了廣泛的應(yīng)用，尤其是快速診斷和快速檢測(cè)領(lǐng)域。目前已有研究整合了CRISPR/Cas系統(tǒng)和RCA的優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)了高特異性的核酸檢測(cè)平臺(tái)。

Chen Zhibao等[37]基于免疫RCA與CRISPR/Cas12a相結(jié)合設(shè)計(jì)一種超靈敏、特異性的大腸桿菌O157:H7電化學(xué)生物傳感器。在靶標(biāo)大腸桿菌O157:H7引入生物傳感器之后，電化學(xué)信號(hào)發(fā)生變化。在優(yōu)化條件下該生物傳感器線性范圍可達(dá)10～107CFU/mL，檢出限（limit of detection，LOD）低至10 CFU/mL，靈敏度和檢測(cè)范圍都明顯優(yōu)于之前報(bào)道的方法。因此，通過(guò)將Cas12a和免疫RCA相結(jié)合可以開(kāi)發(fā)出檢測(cè)病原體的新型超靈敏和特異性生物傳感器平臺(tái)，該生物傳感器對(duì)實(shí)際樣品中許多病原菌的檢測(cè)展示出了優(yōu)異的性能。

2.2.2 CRISPR/Cas-RPA技術(shù)檢測(cè)系統(tǒng)

RPA技術(shù)于2006年被推出，是等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的重大突破[56]，擴(kuò)增過(guò)程主要依賴于重組酶和ssDNA結(jié)合蛋白（ssDNA binding ptotein，SSB），其原理為重組酶與寡核苷酸引物結(jié)合形成復(fù)合體，并使引物與dsDNA中的同源序列相互配對(duì)，SSB與DNA鏈相結(jié)合形成穩(wěn)定的D環(huán)，從引物啟動(dòng)，在DNA聚合酶的作用下介導(dǎo)DNA擴(kuò)增，最后通過(guò)重復(fù)此RPA循環(huán)實(shí)現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增[57]。與其他的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相比，RPA擴(kuò)增速率快，通常30 min內(nèi)即可完成采集樣本的全過(guò)程。因其制備要求低、操作溫度可控以及所需試劑的商業(yè)可用性等優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室及相關(guān)臨床環(huán)境中。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，用于RPA后的檢測(cè)平臺(tái)通常需要昂貴的探針設(shè)計(jì)，靈敏度低、缺乏特異性，需要建立可以與RPA相結(jié)合的更為靈敏、特異的檢測(cè)手段。將CRISPR/Cas生物傳感系統(tǒng)與RPA相結(jié)合可以提高反應(yīng)的特異性以及實(shí)現(xiàn)信號(hào)的新一輪擴(kuò)增。基于此原理，將RPA作為CRISPR/Cas生物傳感系統(tǒng)的前預(yù)擴(kuò)增技術(shù)，開(kāi)發(fā)了DETECTR（DNA核酸內(nèi)切酶靶向CRISPR反式報(bào)告基因）系統(tǒng)，該系統(tǒng)可用于檢測(cè)涉及癌癥和傳染病診斷的重要生物標(biāo)志物[58]。目前CRISPR/Cas-RPA技術(shù)檢測(cè)系統(tǒng)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食源性病原菌的檢測(cè)中。Wang Pei等[59]提出將RPA與CRISPR/Cas12a和熒光分子（ssDNA-FQ）預(yù)混合在一個(gè)試管中，避免了開(kāi)蓋污染，利用RPA強(qiáng)大的擴(kuò)增能力和CRISPR/Cas12a精確的切割活化特性開(kāi)發(fā)一種快速視覺(jué)檢測(cè)方法。該平臺(tái)在30 min內(nèi)即可完成檢測(cè)，靈敏度達(dá)到101copies，為不同類型的核酸檢測(cè)提供了參考。除Cas12a外，基于VI型的Cas13a也被用于食源性病原菌的檢測(cè)。An Bailin等[50]將Cas13a與RPA相結(jié)合建立沙門氏菌屬檢測(cè)單管兩步反應(yīng)體系。結(jié)果表明，單管RPA-Cas13a的檢測(cè)靈敏度與實(shí)時(shí)熒光定量PCR相同，達(dá)到102copies/μL；而兩步法RPA-Cas13a對(duì)沙門氏菌的LOD可達(dá)100copies/μL，更適用于低豐度樣品。該檢測(cè)平臺(tái)可在簡(jiǎn)單的恒溫設(shè)備上進(jìn)行，降低了對(duì)設(shè)備和操作人員的要求，整個(gè)過(guò)程控制在13 min內(nèi)，可作為乳及乳制品中沙門氏菌的快速檢測(cè)方法，為未來(lái)的POCT應(yīng)用提供思路。

2.2.3 CRISPR/Cas-RAA技術(shù)檢測(cè)系統(tǒng)

RAA的原理與RPA相似，依賴于從細(xì)菌或真菌中所獲得的重組酶、SSB和DNA聚合酶。在常溫下，該重組酶可與引物DNA緊密結(jié)合，形成酶和引物的聚合體，當(dāng)引物在模板DNA上搜索到與之完全匹配的互補(bǔ)序列時(shí)，通過(guò)SSB的幫助打開(kāi)模板DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，并在DNA聚合酶的作用下形成新的DNA互補(bǔ)鏈，擴(kuò)增產(chǎn)物以指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)。這一擴(kuò)增過(guò)程可在30～42 ℃、30 min以內(nèi)的條件下高特異性地完成[60]。唯一不同的是RPA與RAA酶的來(lái)源不同，RPA重組酶來(lái)源于T4噬菌體，而RAA重組酶來(lái)源于細(xì)菌或真菌。RAA采用的來(lái)源于細(xì)菌和真菌的DNA聚合酶和重組酶相較于RPA具有更高的活性。

CRISPR/Cas生物傳感系統(tǒng)已與RAA技術(shù)相結(jié)合，以檢測(cè)各種食源性病原體，包括單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、沙門氏菌和腐敗細(xì)菌等[61]?；贑RISPR/Cas-RAA技術(shù)的檢測(cè)系統(tǒng)，如SHERLOCK（specific highsensitivity enzymatic reporter unlocking）和DETECTR（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter），已成功用于核酸檢測(cè)中，實(shí)現(xiàn)了多種模式下食品中病原菌的高靈敏度檢測(cè)。Zhou Chi等[38]開(kāi)發(fā)了基于CRISPR/Cas12a-RAA系統(tǒng)的沙門氏菌定量檢測(cè)方法，原理如圖2A所示。當(dāng)存在目標(biāo)物質(zhì)時(shí)，通過(guò)CRISPR/Cas12a的活化和切割、酶反應(yīng)、葡萄糖信號(hào)讀取，實(shí)現(xiàn)了從靶基因到葡萄糖信號(hào)的間接轉(zhuǎn)化，該方法檢測(cè)限低至5 CFU/mL，此外在1～103CFU的范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了沙門氏菌的定量檢測(cè)。但該方法需要轉(zhuǎn)移擴(kuò)增產(chǎn)物，增加了操作的復(fù)雜性及樣品交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)[58]。因此Lü Xinrui等[39]設(shè)計(jì)了一種基于CRISPR/Cas12a-RAA的單管新型檢測(cè)系統(tǒng)用于檢測(cè)蝦樣品中的副溶血性弧菌，原理如圖2B所示。該方法在純培養(yǎng)物中的LOD為67 CFU/mL，在蝦樣品中的檢測(cè)限為73 CFU/mL，與之前的方法相比具有更高的靈敏度和特異性。此外，RAA所需的37 ℃的擴(kuò)增條件也減少了傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增時(shí)極其微量的污染就可造成假陽(yáng)性的結(jié)果，不到1 h即可完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程，不僅極大縮短了檢測(cè)時(shí)間，還可避免復(fù)雜熱循環(huán)儀的使用，滿足了副溶血性弧菌檢測(cè)的需求，為食源性病原菌的檢測(cè)提供了新思路，對(duì)食品安全監(jiān)管具有重要意義。

圖2 基于CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的檢測(cè)系統(tǒng)Fig.2 Detection system of CRISPR/Cas-isothermal amplification technology

2.2.4 CRISPR/Cas-LAMP技術(shù)檢測(cè)系統(tǒng)

LAMP是2000年提出的一種核酸擴(kuò)增方式，用于多種病原菌的檢測(cè)，為細(xì)菌和病毒的POCT提供了新的方向[62]。其擴(kuò)增過(guò)程需要4 條特異引物，首先，內(nèi)部引物結(jié)合靶標(biāo)物質(zhì)，在BstDNA聚合酶的作用下延伸成雙鏈，聚合酶延伸外引物以置換新合成的鏈，由于F1c和F1區(qū)域的雜交，使得位移鏈在5′端形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在3′端以類似的方式擴(kuò)增，形成兩端具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的DNA，靶DNA的重復(fù)序列通過(guò)連續(xù)的延伸和置換進(jìn)行擴(kuò)增[63]。由于LAMP技術(shù)使用4～6 個(gè)特異性引物來(lái)識(shí)別6～8 個(gè)特定區(qū)域，更具有特異性和靈敏度。反應(yīng)時(shí)間基本在30 min以內(nèi)，極大縮短了擴(kuò)增時(shí)間。

然而，單獨(dú)使用LAMP進(jìn)行擴(kuò)增容易造成交叉污染，由非特異性擴(kuò)增而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果，因此用CRISPR/Cas12a介導(dǎo)LAMP可消除上述缺點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)食源性病原菌的穩(wěn)定、靈敏檢測(cè)[64]。Mukama等[65]利用CRISPR/Cas12a-LAMP測(cè)得牛奶中銅綠假單胞菌的靈敏度為100CFU/mL；Kim等[66]也用該聯(lián)用手段靈敏地檢測(cè)長(zhǎng)葉萵苣中的大腸桿菌O157:H7，靈敏度為100CFU/g?；诖嗽恚琇ee等[40]研發(fā)了一種快速、靈敏的基于LAMP-CRISPR/Cas12a的LFB平臺(tái)，用于檢測(cè)沙門氏菌視覺(jué)化檢測(cè)。如圖2C所示，該平臺(tái)在不使用預(yù)富集培養(yǎng)物的情況下，對(duì)純培養(yǎng)物樣品的LOD為1.22×100CFU/mL。這表明該檢測(cè)平臺(tái)比常規(guī)的檢測(cè)方法具有更高的特異性和準(zhǔn)確性，通過(guò)設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)哪繕?biāo)病原體crRNA可以使該方法應(yīng)用于多種類別病原菌的檢測(cè)中，使其成為一種有價(jià)值且靈敏的POCT生物傳感檢測(cè)技術(shù)。為進(jìn)一步減少操作過(guò)程中的污染，Shi Yaoqiang等[41]開(kāi)發(fā)了一種單管CRISPR/Cas12a增強(qiáng)型LAMP（CRISPR/Cas12a-E-LAMP）方法用于檢測(cè)肺炎鏈球菌。該結(jié)果可在LED藍(lán)光下實(shí)現(xiàn)肉眼可視化，整個(gè)過(guò)程在40 min內(nèi)完成，檢測(cè)限為4×100copies/μL，在開(kāi)發(fā)用于核酸檢測(cè)的下一代生物傳感器方面具有巨大潛力。

2.3 擴(kuò)增前CRISPR

擴(kuò)增前CRISPR 是指當(dāng)靶標(biāo)物質(zhì)存在時(shí)，激活CRISPR/Cas效應(yīng)蛋白的切割活性，再采用等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)對(duì)其切割后的短ssDNA進(jìn)行擴(kuò)增以實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。由CRISPR/Cas系統(tǒng)觸發(fā)的指數(shù)擴(kuò)增反應(yīng)目前不僅有效克服了在長(zhǎng)DNA或RNA檢測(cè)中的局限性，而且賦予了傳感平臺(tái)高靈敏度和特異性。與預(yù)擴(kuò)增方法相比，擴(kuò)增前CRISPR在核酸研究中可減少非特異性擴(kuò)增，表現(xiàn)出更顯著的效率，實(shí)現(xiàn)在不同的病原菌中良好的選擇性，可作為檢測(cè)復(fù)雜生物樣品的高效、便捷的工具[67]。

Zhang Kaixiang等[35]開(kāi)發(fā)出一種新型CRISPR/Cas9切割檢測(cè)平臺(tái)，由Cas9裂解dsDNA的切口觸發(fā)EXPAR反應(yīng)來(lái)進(jìn)行Cas9切割效率的評(píng)估與sgRNA的預(yù)篩選，原理如圖3A所示。使用這種新開(kāi)發(fā)的擴(kuò)增方法，LOD低至10 pmol/L，線性范圍為100 pmol/L～20 nmol/L，該方法可在40 min內(nèi)定量Cas9的切割活性，實(shí)現(xiàn)高效、特異性強(qiáng)的CRISPR/Cas9基因組編輯。該新型生物傳感器的開(kāi)發(fā)為后續(xù)食源性病原菌相關(guān)檢測(cè)方法提供了新的思路。SDA是近幾年發(fā)展起來(lái)的基于酶促反應(yīng)的DNA體外擴(kuò)增技術(shù)，由SDA產(chǎn)生豐富的ssDNA激發(fā)Cas效應(yīng)蛋白的反式切割活性，避免用于靶標(biāo)擴(kuò)增的復(fù)雜引物設(shè)計(jì)。為進(jìn)一步提高檢測(cè)效率和實(shí)際樣品分析中的性能，已有研究將SDA作為CRISPR之后的擴(kuò)增手段。Sun Xuan等[36]開(kāi)發(fā)出一種基于UiO9平臺(tái)的CRISPR/Cas9觸發(fā)SDA-RCA兩步等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)大腸桿菌O157:H7。如圖3B所示，靶毒力基因序列被CRISPR-Cas9系統(tǒng)識(shí)別和切割，并觸發(fā)SDA和RCA循環(huán)擴(kuò)增。反應(yīng)后，大量產(chǎn)物可以與探針雜交，并通過(guò)熒光強(qiáng)度定量檢測(cè)靶DNA。該方法實(shí)現(xiàn)了在溫和條件下特異性檢測(cè)食品基質(zhì)中大腸桿菌O157:H7，最低LOD為40 CFU/mL，線性范圍為1.3×102～6.5×104CFU/mL，與傳統(tǒng)的RCA和SDA方法相比反應(yīng)效率更高，檢測(cè)限較低，在其他病原菌檢測(cè)、食品安全檢測(cè)等方面也展現(xiàn)了較好的實(shí)際應(yīng)用能力。

圖3 基于擴(kuò)增前CRISPR的生物傳感平臺(tái)Fig.3 Biosensing platform based on pre-amplification CRISPR

3 CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)系統(tǒng)信號(hào)輸出

3.1 納米材料

納米材料在開(kāi)發(fā)基于CRISPR生物傳感系統(tǒng)方面受到廣泛的關(guān)注，如上轉(zhuǎn)換納米顆粒[68-69]、MBs、QDs[70-71]、GO[72-73]和AuNPs[74-75]等，在生物材料中具有較好的熒光性能，可用于提高目標(biāo)檢測(cè)的分析性能，并實(shí)現(xiàn)便捷的信號(hào)讀數(shù)。

3.1.1 基于MBs調(diào)節(jié)信號(hào)輸出的CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)

近年來(lái)MBs在分離和檢測(cè)方法中已得到了廣泛的應(yīng)用，分離速率快，無(wú)需昂貴的儀器設(shè)備，在生物分子分離和純化方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能，將MBs與生物傳感器相結(jié)合可以極大提高靈敏度。Li Chao等[42]開(kāi)發(fā)了一種采用免疫捕獲MBs增強(qiáng)CRISPR/Cas12a-LAMP靈敏度的方法，用于空腸彎曲桿菌的快速視覺(jué)檢測(cè)，原理如圖4A所示。該方法在8 min內(nèi)即可完成檢測(cè)，LOD低至70 CFU/mL。結(jié)果表明，免疫捕獲MBs、LAMP和CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的結(jié)合可以顯著提高空腸彎曲桿菌的檢測(cè)靈敏度和特異性，這種生物傳感器也可用于檢測(cè)生物樣品中的其他病原菌，在今后的工作中具有廣泛的應(yīng)用潛力。

圖4 基于納米材料調(diào)節(jié)信號(hào)輸出的CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)Fig.4 CRISPR/Cas-isothermal amplification technology based on nanomaterial-modulated signal output

3.1.2 基于QDs調(diào)節(jié)信號(hào)輸出的CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)

與傳統(tǒng)的猝滅劑相比，QDs 是一種吸收光譜寬、量子產(chǎn)率高、光穩(wěn)定性好、熒光壽命長(zhǎng)的半導(dǎo)體納米晶體，具有高熒光猝滅效率，已經(jīng)基本取代了傳統(tǒng)的熒光團(tuán)[76]。Zhou Baoqing等[43]合成了鏈霉親和素（streptavidin，SA）修飾的QDs作為增強(qiáng)熒光信號(hào)，設(shè)計(jì)了一種特殊的靶標(biāo)捕獲探針，以建立基于LFB的CRISPR/Cas12a-RAA重組酶輔助擴(kuò)增（CRISPR/Cas-recombinase-assisted amplification based LFB，CRA-LFB）系統(tǒng)。選擇穩(wěn)定性較好的QDs標(biāo)記LFB表現(xiàn)出更高的靈敏度和更低的背景干擾，提高裸眼分辨率和檢測(cè)靈敏度。目標(biāo)細(xì)菌的LOD低至5.4×102CFU/mL，基于CRISPR/Cas12a的LFB平臺(tái)與QDs和ssDNA探針相結(jié)合可用于大多數(shù)病原體的檢測(cè)。基于QDs調(diào)節(jié)信號(hào)輸出方式的CRISPR/Cas系統(tǒng)還可以與其他的信號(hào)放大策略相結(jié)合，Liu Yaqi等[44]開(kāi)發(fā)了SDA輔助的CRISPR/Cas12a電化學(xué)發(fā)光（electochemiluminescence，ECL）生物傳感器，用于金黃色葡萄球菌的超靈敏鑒定。該研究制備了卟啉Zr金屬有機(jī)骨架納米材料作為核心反應(yīng)促進(jìn)劑，增強(qiáng)QDs的反應(yīng)并放大ECL發(fā)射信號(hào)。該檢測(cè)平臺(tái)表現(xiàn)出理想的檢測(cè)性能，具有1 fmol/L～10 nmol/L的線性范圍，檢測(cè)限為0.437 fmol/L。這種基于QDs調(diào)節(jié)信號(hào)輸出的CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)憑借其優(yōu)異的性能可以基于不同crRNA的設(shè)計(jì)用于檢測(cè)不同的病原體和病毒，具有成本低、速度快的優(yōu)勢(shì)。

3.1.3 基于GO調(diào)節(jié)信號(hào)輸出的CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)

GO納米材料在生物分子檢測(cè)領(lǐng)域越來(lái)越受到關(guān)注，具有大且易于修飾的表面，可以改性與環(huán)氧化物羥基、羧基等官能團(tuán)連接，這些官能團(tuán)都有助于改變GO的表面特征，并為多種分子提供附著位點(diǎn)，包括蛋白質(zhì)、DNA、RNA等。這使GO在納米材料中的多種應(yīng)用都處于有利地位，具有更好的潛在應(yīng)用前景，憑借高效的熒光猝滅能力，GO已被應(yīng)用在基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）的生物傳感器中[77-78]。Cheng Xiaoxue等[79]通過(guò)集成CRISPR/Cas12系統(tǒng)和GO的熒光猝滅能力，開(kāi)發(fā)了一種高靈敏度的熒光檢測(cè)平臺(tái)。該研究利用Cas12a高效的切割活性與GO優(yōu)異的猝滅效率調(diào)節(jié)FRET，實(shí)現(xiàn)任何靶標(biāo)DNA的檢測(cè)，LOD低至1.34×10-4nmol/L，線性范圍為5×10-4～100 nmol/L，所提出的策略也可以與其他等溫?cái)U(kuò)增方法相結(jié)合，構(gòu)建靈敏度更高的生物傳感器。Wang Liu等[45]基于此原理開(kāi)發(fā)了一種CRISPR/Cas12a-RPA和GO相結(jié)合的沙門氏菌視覺(jué)檢測(cè)方法。原理如圖4B所示，通過(guò)用GO調(diào)節(jié)FAM-ssDNA的熒光恢復(fù)率代替熒光團(tuán)和猝滅雙標(biāo)記報(bào)告基因?qū)崿F(xiàn)熒光視覺(jué)檢測(cè)，LOD低至8×101CFU/mL，與傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增技術(shù)相比，檢測(cè)時(shí)間極大縮短。該方法不需要復(fù)雜的儀器，除了病原體還可應(yīng)用于其他目標(biāo)物質(zhì)，有效提高檢測(cè)的分析性能，實(shí)現(xiàn)便捷的信號(hào)讀數(shù)，為未來(lái)研究CRISPR與納米材料相結(jié)合的高效生物傳感平臺(tái)提供了參考。

3.1.4 基于AuNPs調(diào)節(jié)信號(hào)輸出的CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)

AuNPs由于其獨(dú)特的光電特性而在生物傳感領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。CRISPR/Cas效應(yīng)蛋白與金納米顆粒之間相互作用，為CRISPR的POCT提供了更為高效的診斷平臺(tái)，在其應(yīng)用方面發(fā)揮較大的潛力[79]。涂有高密度生物條形碼DNA的AuNPs探針與不同的擴(kuò)增技術(shù)耦合可實(shí)現(xiàn)第2輪信號(hào)放大，實(shí)現(xiàn)了比傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）低1 000 倍的LOD[80]。Cai Qiqi等[46]基于此原理，將生物條形碼免疫測(cè)定（bio-barcode immunoassay，BCA）、RPA和CRISPR/Cas12a切割集成單個(gè)反應(yīng)系統(tǒng)（稱為BCARPA-Cas12a）。如圖4C所示，在該系統(tǒng)中，目標(biāo)細(xì)菌被大量條形碼AuNPs標(biāo)記放大信號(hào)。使檢測(cè)系統(tǒng)的熒光在目標(biāo)細(xì)菌存在下顯著增加，可以在藍(lán)光下用肉眼選擇性地檢測(cè)個(gè)位數(shù)水平的鼠傷寒沙門氏菌，LOD為1 CFU/mL?；贑RISPR/Cas12a的生物傳感器的應(yīng)用范圍可以從核酸靶標(biāo)擴(kuò)展到非DNA靶標(biāo)。因此，該方法在其他細(xì)菌檢測(cè)、食品安全監(jiān)測(cè)或臨床診斷中具有巨大的進(jìn)一步應(yīng)用潛力。

3.2 FNAs

FNAs功能多、應(yīng)用廣，是生物傳感器中發(fā)展最迅速的一個(gè)領(lǐng)域。FNAs由能夠結(jié)合特定靶標(biāo)（稱為適配體）或具有促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)能力的DNA和RNA分子（稱為DNA酶和核酶）組成[81-82]。除核酸材料的基本優(yōu)點(diǎn)外，F(xiàn)NAs還有許多優(yōu)越的特性，包括核酸適配體對(duì)靶標(biāo)的高結(jié)合親和力，可用作靶向配體；DNA酶特異性的基因編輯能力，可精準(zhǔn)識(shí)別靶標(biāo)。這些特點(diǎn)使FNAs成為近幾年的熱點(diǎn)材料，在分子生物學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域取得了重大進(jìn)展[83]。

3.2.1 基于適配體調(diào)節(jié)信號(hào)輸出的CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)

使用ssDNA調(diào)節(jié)納米材料作為信號(hào)探針雖然取得了較大的成功，但具有靈敏度不足這一缺陷，需要探索一種簡(jiǎn)單且靈敏度高的替代方案。Wei Luyu等[47]在目前的研究中開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR/Cas12a和RPA結(jié)合的適配體比色生物傳感器，如圖5A所示，可用于超靈敏視覺(jué)檢測(cè)。當(dāng)存在含有大量胞嘧啶殘基的Ag適配體時(shí)，溶液中原始游離Ag由于適配體結(jié)合而減少，導(dǎo)致與3,3′,5,5′-四甲基聯(lián)苯胺（3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine，TMB）的相互作用相應(yīng)減少。利用這一原理，Ag-TMB的發(fā)色反應(yīng)可以用適配體進(jìn)行調(diào)節(jié)。這種生物傳感器具有令人滿意的準(zhǔn)確性和適用性，LOD可達(dá)8 CFU/mL，更適合于細(xì)菌的鑒定與分型，實(shí)現(xiàn)超靈敏的快速視覺(jué)檢測(cè)。

圖5 基于FNAs調(diào)節(jié)信號(hào)輸出的CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)Fig.5 CRISPR/Cas-isothermal amplification technology based on FNAs-regulated signal output

3.2.2 基于G-四鏈體調(diào)節(jié)信號(hào)輸出的CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)

G-四鏈體是在陽(yáng)離子誘導(dǎo)下由富含串聯(lián)重復(fù)鳥(niǎo)嘌呤的DNA或RNA折疊形成的高級(jí)結(jié)構(gòu)，與氯化血紅素結(jié)合后具有類過(guò)氧化物酶活性，可催化TMB和2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）顯色，常作為比色信號(hào)的輸出方式?；诖嗽恚芯咳藛T已經(jīng)開(kāi)發(fā)了相應(yīng)的CRISPR/Cas-等溫?cái)U(kuò)增比色傳感平臺(tái)。Yin Lijuan等[48]巧妙設(shè)計(jì)出一種基于智能手機(jī)讀取G-四鏈體的CRISPR/Cas12-RPA生物測(cè)定法，用于細(xì)菌的超靈敏檢測(cè)。如圖5B所示，當(dāng)靶標(biāo)物質(zhì)存在時(shí)，擴(kuò)增子觸發(fā)了Cas12效應(yīng)蛋白對(duì)ssDNA的降解，無(wú)法催化TMB顯色；當(dāng)靶標(biāo)物質(zhì)不存在時(shí)，富含鳥(niǎo)嘌呤的ssDNA通過(guò)添加K+形成穩(wěn)定的G-四鏈體DNA酶，在血紅素存在的情況下催化TMB-H2O2反應(yīng)發(fā)生顏色變化，可通過(guò)肉眼或帶有顏色選擇器的智能手機(jī)直接觀察。應(yīng)用該策略，沙門氏菌的LOD為1 CFU/mL。該技術(shù)擴(kuò)大了CRISPR/Cas生物傳感系統(tǒng)的應(yīng)用范圍，為食品中的病原菌提供了高靈敏度、高特異性的新型檢測(cè)平臺(tái)，可作為食源性病原菌有效的食品安全評(píng)估工具?；谕N原理，Chen Xueyun等[49]開(kāi)發(fā)出一種CRISPR/Cas12a結(jié)合G-四鏈體DNA酶的視覺(jué)檢測(cè)平臺(tái)檢測(cè)食品中的副溶血性弧菌。該原理如圖5C所示，CRISPR/Cas12a-LAMP誘導(dǎo)G-四鏈體DNA酶催化底物ABTS顯色，裸眼檢測(cè)靈敏度為6.1×102CFU/g。這種級(jí)聯(lián)方法可以作為現(xiàn)場(chǎng)病原菌檢測(cè)的通用生物傳感策略。

4 結(jié)語(yǔ)

CRISPR除強(qiáng)大的基因編輯能力外，在生物傳感平臺(tái)也發(fā)揮出重要作用，為開(kāi)發(fā)各種食源性病原菌的分析和檢測(cè)技術(shù)提供了新的策略，目前已經(jīng)成為一種有效的核酸檢測(cè)工具。迄今為止，利用Cas9、Cas12、Cas13效應(yīng)蛋白的順式切割活性以及Cas12和Cas13效應(yīng)蛋白的反式切割活性已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種CRISPR/Cas生物傳感器，基于單一效應(yīng)蛋白的快速檢測(cè)技術(shù)因其設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、響應(yīng)速度快而在POCT應(yīng)用中發(fā)揮了巨大潛力。將多種核酸擴(kuò)增技術(shù)，如LAMP、RPA、RAA、RCA等引入CRISPR/Cas傳感系統(tǒng)中，不僅能夠極大提高檢測(cè)的靈敏度和特異性，還可以將靶點(diǎn)從核酸擴(kuò)展為蛋白質(zhì)、微小核糖核酸、酶、外泌體等物質(zhì)。通過(guò)結(jié)合納米材料、適配體、G-四鏈體等調(diào)節(jié)信號(hào)輸出方式，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的放大，極大提高了對(duì)食源性病原菌檢測(cè)的靈敏度。

雖然目前CRISPR在快速檢測(cè)領(lǐng)域已經(jīng)取得了顯著的成果，但在發(fā)展過(guò)程中仍面臨許多挑戰(zhàn)，檢測(cè)系統(tǒng)存在一些局限性：1）基于CRISPR/Cas的快速檢測(cè)技術(shù)無(wú)法區(qū)分活死菌，易造成假陽(yáng)性結(jié)果；針對(duì)這一弊端，可以采用適配體篩選出活死菌，但操作更加繁瑣，在未來(lái)的研究中還需要探索出更有效的方法；2）雖然具有靶點(diǎn)觸發(fā)側(cè)支切割活性的Cas12、Cas13、Cas14具有良好的靈敏度，但對(duì)于復(fù)雜的食品基質(zhì)仍需要超高靈敏度的檢測(cè)手段，在未來(lái)的檢測(cè)中可以建立聯(lián)級(jí)CRISPR/Cas系統(tǒng)；3）CRISPR/Cas對(duì)于食源性病原菌仍停留在單一檢測(cè)階段，檢測(cè)效率低，實(shí)現(xiàn)單一體系下的多重檢測(cè)對(duì)于食品安全至關(guān)重要，在未來(lái)的研究中應(yīng)該在多重檢測(cè)方面尋找新的解決方法，實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)過(guò)程的簡(jiǎn)便化；4）目前大多數(shù)CRISPR/Cas技術(shù)在檢測(cè)前需要對(duì)核酸進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，限制了實(shí)際應(yīng)用，為避免預(yù)擴(kuò)增步驟，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了許多一步法CRISPR/Cas檢測(cè)平臺(tái)。基于等溫?cái)U(kuò)增的CRISPR/Cas系統(tǒng)展示了其優(yōu)越的性能，為食源性病原菌的檢測(cè)提供了新方法，在食品安全控制、分子診斷、環(huán)境檢測(cè)等領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更廣闊的應(yīng)用潛力。