煤礦區(qū)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及其對不同復(fù)墾模式的響應(yīng)

張世文 ，蔡慧珍 ，張燕海 ，董祥林 ，劉 俊 ，俞 靜

（1.安徽理工大學(xué) 地球與環(huán)境學(xué)院, 安徽 淮南 232001；2.淮北礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司, 安徽 淮北 235000；3.平安煤炭開采工程技術(shù)研究院有限責(zé)任公司, 安徽 淮南 232001）

0 引 言

煤炭產(chǎn)業(yè)是我國最大的能源產(chǎn)業(yè)[1]，伴隨著煤炭工業(yè)的發(fā)展以及開采程度的加大，采礦所造成的地表沉陷、裂縫等問題頻繁產(chǎn)生，同時(shí)，植被衰減、土地功能退化與生物多樣性銳減使得糧煤矛盾日益尖銳[2-5]。針對高潛水位糧煤復(fù)合區(qū)域，國內(nèi)外提出并實(shí)踐了多種沉陷區(qū)復(fù)墾模式，如挖深墊淺、粉煤灰和煤矸石充填等。不同復(fù)墾模式效果不同，土地復(fù)墾的關(guān)鍵在于合理重構(gòu)一個(gè)新土體，使復(fù)墾土壤的物理、化學(xué)和生物（微生物）條件達(dá)到穩(wěn)定、合理的水平[6-7]，模式的優(yōu)選和后期合理人為干預(yù)對于實(shí)現(xiàn)礦區(qū)復(fù)墾土地的可持續(xù)高效利用意義重大。

作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組分，微生物對環(huán)境變化的反應(yīng)極其靈敏，是土壤重構(gòu)的核心[8]。近年來，基于高通量測序技術(shù)，針對正常土壤、擾動(dòng)土壤和新構(gòu)土壤，圍繞著微生物群落結(jié)構(gòu)、功能以及多樣性等方面開展了廣泛研究。如樊文華等[9]對不同種植年限的復(fù)墾土壤進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著年限的增長微生物總量增加，復(fù)墾13 a 土壤微生物總數(shù)高達(dá)1 448.19×105CFU/g，和正常土壤相當(dāng)。ZHANG 等[10]認(rèn)為復(fù)墾對土壤細(xì)菌群落的豐富度具有提高作用，隨著時(shí)間的推移，細(xì)菌群落發(fā)育的愈加成熟，多樣性和均勻度增加。侯湖平等[11]對比不同復(fù)墾年限煤矸石充填土壤發(fā)現(xiàn)，隨著年限的增加，土壤優(yōu)勢菌群的類型不變，但是數(shù)量結(jié)構(gòu)在變。微生物種群間的相互作用通常形成復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)，從而影響整個(gè)群落的結(jié)構(gòu)與功能。分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)為闡明微生物群落的物種共發(fā)生模式提供了強(qiáng)大工具。CHEN 等[12]研究了土壤真菌與細(xì)菌群落對露天煤礦開采擾動(dòng)的差異發(fā)現(xiàn)，真菌的物種多樣性較低，但真菌群落比細(xì)菌群落更穩(wěn)定。馬靜等[13]研究東部平原礦區(qū)土壤環(huán)境因子、固碳基因和固碳菌門的互作網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)，長時(shí)間復(fù)墾活動(dòng)增強(qiáng)了三者間互作關(guān)系，且隨著復(fù)墾時(shí)長的增加，網(wǎng)絡(luò)趨于復(fù)雜、緊密，干擾耐受性更高。GUO 等[14]對比了采煤沉陷區(qū)不同生態(tài)修復(fù)類型下土壤微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)發(fā)現(xiàn)自然恢復(fù)區(qū)的網(wǎng)絡(luò)規(guī)模最小，但模塊化高，微生物群落穩(wěn)定性較好。楊賢房等[15]研究稀土礦區(qū)不同生境下土壤細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)耕地種植使得分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)規(guī)模增大、路徑長度減小。由此可見，從不同復(fù)墾年限到不同土地利用類型的復(fù)墾土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)以及生態(tài)網(wǎng)絡(luò)廣受關(guān)注，但對于采煤沉陷區(qū)不同復(fù)墾模式土壤微生物互作機(jī)制的差異研究相對偏少。

不同復(fù)墾模式下土壤生境差異明顯。重構(gòu)土壤的物理結(jié)構(gòu)與化學(xué)屬性不同，使得微生物的組成、多樣性和功能不同，因此，有必要科學(xué)全面地揭示微生物種群特征。分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)方法可進(jìn)一步揭示微生物種群間的潛在互作關(guān)系、發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵功能類群。當(dāng)前，針對同一模式不同復(fù)墾時(shí)間、不同復(fù)墾方向以及不同管理?xiàng)l件下的微生物多樣性開展了大量研究，但針對不同復(fù)墾模式土壤微生物群落多樣性以及種群互作機(jī)制差異知之甚少。針對當(dāng)前的研究現(xiàn)狀與不足，以不同復(fù)墾模式下的復(fù)墾土壤為研究對象，基于高通量測序技術(shù)，結(jié)合分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)等分析方法，探索不同復(fù)墾模式對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)與種群互作關(guān)系的影響，尋找對群落生態(tài)穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用的微生物種群，以期為高潛水位采煤沉陷區(qū)復(fù)墾模式的優(yōu)選提供一定科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

兩淮采煤沉陷區(qū)是我國東部高潛水位采煤沉陷區(qū)的典型代表之一。該區(qū)地形以平原為主，屬暖溫帶半濕潤季風(fēng)氣候，四季分明，雨水適中，農(nóng)作物種類以小麥、玉米為主，是我國重要的糧食產(chǎn)區(qū)。因長期的井工開采導(dǎo)致了農(nóng)田大面積沉陷，土地?fù)p傷嚴(yán)重的同時(shí)，對當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)業(yè)生產(chǎn)也造成了不利影響。選擇區(qū)域內(nèi)挖深墊淺（DP）、煤矸石充填（GS）和粉煤灰充填（FH）三種典型采煤沉陷區(qū)復(fù)墾模式作為研究對象。選定3 個(gè)復(fù)墾地塊，復(fù)墾方向均為耕地，種植模式均為小麥—玉米輪作，覆土厚度為60 cm 左右，復(fù)墾年限為10 年，DP、GS 和FH 三個(gè)復(fù)墾地分別位于兩淮礦區(qū)的海孜煤礦、新莊孜煤礦以及平圩電廠粉煤灰堆放場（圖1）。

圖1 研究區(qū)位置和采樣點(diǎn)分布Fig.1 Study area location and sampling point distribution map

1.2 樣品采集

采樣工作完成于2019 年6 月，從每塊復(fù)墾樣地內(nèi)各采集6 份去除表面凋落物的耕層（0～20 cm）土壤樣品，每份樣品為3 個(gè)點(diǎn)的混合。將所采回土樣中的石塊與動(dòng)植物殘?bào)w等雜物去除并混勻后分成2 份：一份平鋪在盤中于陰涼通風(fēng)的房間內(nèi)自然風(fēng)干，待半干時(shí)將大土塊碾碎，全部風(fēng)干后保留300 g 左右用于各理化指標(biāo)的測定；另一份于-80 ℃冰箱中保存用于后續(xù)高通量測序。

1.3 理化指標(biāo)測定

土壤pH、土壤有機(jī)質(zhì)、有效磷、速效鉀和全氮含量的試驗(yàn)方法如下[16]：pH 用pH 計(jì)（BPH-252）測定 （1∶2.5 土/水質(zhì)量比）；有機(jī)質(zhì)（Soil Organic Matter, SOM）的測定采用重鉻酸鉀容量法-外加熱法；有效磷（Available Phosphorus, AP）的測定采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法；速效鉀（Available Kalium, AK）的測定采用1 mol/L NH4OAc浸提-火焰光度法；全氮（Total Nitrogen, TN）采用Vario MAXRO Cube 元素分析儀測定，結(jié)果見表1。

表1 不同復(fù)墾模式土壤理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of soils with different reclamation models

1.4 土壤細(xì)菌 16S rRNA 基因測序

1.4.1 DNA 提取、純化及PCR 擴(kuò)增

使用1%瓊脂糖凝膠電泳對DNA 的完整性與純度進(jìn)行檢測，同時(shí)利用Nano Drop One 對DNA 的濃度和純度進(jìn)行檢測[17]。將DNA 組作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和產(chǎn)物電泳檢測，使用Gene Tools Analysis Software（版本4.03.05.0，Syn Gene）比較PCR 產(chǎn)物濃度后，按等質(zhì)量原理計(jì)算出各樣品所需的體積，并將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行混合。采用的引物序列為5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’和5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’，擴(kuò)增樣品中原核生物V4 可變區(qū)構(gòu)建高通量測序文庫，用E.Z.N.A.Gel Extraction Kit 回收試劑盒對PCR 混合產(chǎn)物進(jìn)行回收，并用TE緩沖液洗脫、回收目標(biāo)DNA 片段。

1.4.2 文庫構(gòu)建及高通量測序

按照NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit DNA Library Prep Kit for Illumina 標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行建庫操作，完成后在高通量測序平臺Miseq 上進(jìn)行上機(jī)測序[18]。測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識別（Base Calling）后分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列（Raw Reads），將結(jié)果以FASTQ 文件格式存儲，其中包含測序序列（Reads）信息及其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

1.5.1 生物信息學(xué)分析

對采集的所有樣品拼接過濾后的clean tags 進(jìn)行聚類，生成OTU（Operational Taxonomic Unit），同時(shí)將嵌合體清除[19]。選擇具有代表性的序列（OUT），以0.8 為其置信度閾值，與SILVA 數(shù)據(jù)庫對比獲得物種注釋信息，分別統(tǒng)計(jì)界、門、綱、屬、種水平的群落組成[20]，將所得數(shù)據(jù)統(tǒng)一記錄在excel 表中。Alpha 多樣性指數(shù)（Chao1、ACE、Shannon、Simpson 和Richness）、群落物種組成與影響因子的Mantel Test相關(guān)性檢驗(yàn)及菌群與影響因子間Spearman 相關(guān)性分析在R studio 軟件中利用R vegan 包計(jì)算完成，所得結(jié)果用R ggplot2 包制圖。用SPSS 20.0 對Alpha 指數(shù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA，analysis of variance），在Origin9.0 中繪制Alpha 指數(shù)柱狀圖。

1.5.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

首先對高通量測序獲得的OTU 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，對序列總數(shù)加和位于前（80%）的OTU 按l g 轉(zhuǎn)換后，以隨機(jī)矩陣?yán)碚摚≧andom Matrix Theory，RMT）算法為基礎(chǔ)，計(jì)算出不同相似閾值條件下的相關(guān)矩陣所對應(yīng)的鄰接矩陣，對閾值進(jìn)行調(diào)整，直至該鄰接矩陣的特征值近似于Poisson 分布，相關(guān)系數(shù)超過此閾值則認(rèn)為其種間相關(guān)性顯著，然后得出節(jié)點(diǎn)的連接強(qiáng)度，以此構(gòu)成鄰矩陣確定分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)與邊。基于此，計(jì)算（節(jié)點(diǎn)數(shù)、連接數(shù)、平均路徑長度、平均聚類系數(shù)）等網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)，采用Fast greedy 算法進(jìn)行模塊優(yōu)化，對模塊聚類計(jì)算，一個(gè)網(wǎng)絡(luò)包括若干模塊，每個(gè)模塊都是一個(gè)功能單位[21]。節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)（模塊內(nèi)連通度Zi、模塊間連通度Pi），模塊特征向量的計(jì)算、網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析在Molecular Ecological Network Analysis Pipeline 平臺進(jìn)行，輸出結(jié)果的可視化在Gephi0.9.2 中完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同復(fù)墾模式土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 不同復(fù)墾模式土壤細(xì)菌群落組成分析（門水平、科水平）

采集土壤樣品共檢出49 個(gè)門，763 個(gè)科，將相對豐度<1%的門類合并為其他，微生物群落相對豐度（門水平）如圖2 所示。不同復(fù)墾模式土壤中的優(yōu)勢細(xì)菌門大致相同，但相對豐度有明顯差異。共有的優(yōu)勢菌門包括：變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），四者的相對豐度總和在各模式土壤中均占70%以上，是復(fù)墾土壤中常見的優(yōu)勢菌群。其中變形菌門最為豐富，在DP、FH 和GS 土壤中占比范圍分別為（25.1%～40.9%）、（40.8%～53.5%）和（30.0%～38.6%），酸桿菌門其次，在DP、FH 和GS土壤中所占比例范圍分別為（9.6%～23.0%）、（13.1%～22.2%）和（9.3%～17.6%）。從結(jié)果來看，DP 土壤中浮霉菌門 （Planctomycetes）與擬桿菌門占比較高。酸桿菌門與變形菌門在FH 土壤中的占比較高；GS 土壤中的芽單胞菌門 （Gemmatimonadetes）占比較高。

圖2 不同復(fù)墾模式土壤細(xì)菌優(yōu)勢門相對豐度Fig.2 Relative abundance of soil bacterial dominance phylum in different reclamation modes

為進(jìn)一步區(qū)分不同模式土壤細(xì)菌群落組成差異，選取相對豐度>1%的優(yōu)勢科合并后繪制堆疊圖（如圖3）。結(jié)果顯示，擬桿菌門下的鞘氨醇單胞菌科（Pyrinomonadaceae）與噬幾丁質(zhì)菌科（Chitinophagaceae）、變形菌門下的伯克氏菌科（Burkholderiaceae）是總占比排名前3 的科，在DP、FH 和GS 土壤樣品中占比之和分別為10.98%、23.53%和16.94%。鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）在FH 土壤群落中的占比高達(dá)13.01%，在DP 與GS 中的占比不超過3% ，Microscillaceae科在FH 微生物群落中的占比為0.37%，而在其他樣品中占比均在2%以上。與其他樣品相比，鞘氨醇單胞菌科在DP 微生物群落中的豐度較高（5.18%），噬幾丁質(zhì)菌科（Chitinophagaceae）與芽單胞菌科（Gemmatimonadaceae）在GS微生物群落中的豐度較高，分別為7.07%和6.44%。

圖3 不同復(fù)墾模式土壤細(xì)菌優(yōu)勢科相對豐度Fig.3 Relative abundance of soil bacterial dominance in different reclamation modes

2.1.2 不同復(fù)墾模式土壤細(xì)菌群落α 多樣性指數(shù)

多樣性指數(shù)可較好地反映微生物群落的豐富度與多樣性[22]，高通量測序結(jié)果顯示，土壤樣品的覆蓋率（good’s coverage）均大于97%，表明測序數(shù)據(jù)量合理。ANOVA 分析表明（圖4），3 種復(fù)墾模式土壤樣品的細(xì)菌多樣性指數(shù)（Richness、Shannon、Simpson、Chao1 和ACE）均存在顯著差異（P<0.05），對復(fù)墾模式有明顯響應(yīng)，且均表現(xiàn)為挖深墊淺最高，其次是煤矸石充填，粉煤灰充填最低。其中，挖深墊淺的Richness 指數(shù)比粉煤灰充填和煤矸石充填高出25%以上。

圖4 不同復(fù)墾模式土壤細(xì)菌群落α 多樣性指數(shù)Fig.4 Diversity index α soil bacteria in different reclamation modes

2.2 不同復(fù)墾模式土壤細(xì)菌群落影響因素分析

為探明細(xì)菌群落物種組成與影響因子間的相關(guān)性，將細(xì)菌群落組成與各理化指標(biāo)進(jìn)行Mantel Test 相關(guān)性檢驗(yàn)，結(jié)果見表2：DP 土壤細(xì)菌群落物種組成受SOM 影響最大，呈顯著正相關(guān)（p<0.05），且隨著物種差異的增大，pH、AP、AK、TN 和SOM的值均增大（r>0）。FH 土壤細(xì)菌群落物種組成受pH 影響最大（r=0.021，p<0.05），除AP 以外（r<0），其他四項(xiàng)因子的數(shù)值大小均隨著細(xì)菌群落物種組成差異的增大而增大。pH 是造成GS 土壤細(xì)菌群落物種組成差異的顯著影響因素，與TN 和SOM值大小呈反比，pH、與AP 和AK 值大小呈正比。由此可見，不同復(fù)墾模式下土壤細(xì)菌群落組成的顯著影響因子不同，與影響因子間的正負(fù)相關(guān)性也有所不同。

表2 Mantel 檢驗(yàn)細(xì)菌群落與影響因子的相關(guān)性Table 2 Mantel examines the correlation between bacterial community species composition and impact factors

為明晰在與土壤的互作關(guān)系中起作用的細(xì)菌種群，將各模式土壤優(yōu)勢細(xì)菌門與各影響因子間進(jìn)行spearman 相關(guān)性分析，并將結(jié)果繪制成熱圖。由圖5 所示具有顯著關(guān)系的有：DP 土壤中AP 與擬桿菌門（Bacteroidetes）呈顯著正相關(guān)（P<0.05），與浮霉菌門（Planctomycetes）呈極顯著正相關(guān)（P<0.01）；AK與裝甲菌門（Armatimonadetes）呈顯著（P<0.05）負(fù)相關(guān)，與放線菌門（Actinobacteria）呈極顯著（P<0.05）的負(fù)相關(guān)；SOM 與匿桿菌門（Latescibacteria）存在極顯著正相關(guān)（P<0.01）。FH 土壤中pH 與放線菌門、匿桿菌門呈顯著正相關(guān)；AP 與酸桿菌門（Acidobacteria）呈極顯著負(fù)相關(guān)，與藍(lán)細(xì)菌門呈顯著負(fù)相關(guān)；AK 與綠彎菌門（Chloroflexi）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）存在顯著負(fù)相關(guān)，與厚壁菌門（Firmicutes）呈顯著正相關(guān)；TN 與綠彎菌門、疣微菌門和放線菌門間存在顯著負(fù)相關(guān)，與擬桿菌門呈顯著正相關(guān)。GS 土壤中AP 與厚壁菌門（Firmicutes）呈顯著正相關(guān)，pH 與浮霉菌門呈顯著正相關(guān)，與變形菌門呈極顯著正相關(guān)。

圖5 菌門與土壤影響因子的spearman 相關(guān)性分析Fig.5 Heat of spearman correlation between phylum and soil environmental factors

2.3 不同復(fù)墾模式土壤細(xì)菌分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)分析

分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)具有可視化表達(dá)種群間互作關(guān)系、發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵功能類群的作用，對于探索微生物種群共發(fā)生模式與群落的生態(tài)穩(wěn)定性具有重大意義[23]。取平行樣本中OTU 豐度數(shù)加和大于等于80%的為輸入項(xiàng)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，并計(jì)算主要特征參數(shù)來描述網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)（圖6）。由表3 可知，3 個(gè)網(wǎng)絡(luò)的閾值相似，分別為0.98、0.98 和0.96，網(wǎng)絡(luò)的模塊性值分別為0.83、0.90、0.90，均大于隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)的模塊性值，說明網(wǎng)絡(luò)具有模塊化特征[24]。

表3 不同復(fù)墾模式土壤微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)Table 3 Characteristic parameters of soil microbial molecular ecological network in different reclamation modes

圖6 不同復(fù)墾模式土壤細(xì)菌群落的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)Fig.6 Interaction networks between reclaimed soil microflora molecular ecological network reclamation

菌群間相互作用對維持網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定具有重要作用，與FH 和GS 相比，DP 細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的總節(jié)點(diǎn)數(shù)、總連接數(shù)、模塊數(shù)和平均連通度明顯較高。DP 細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的規(guī)模更大，節(jié)點(diǎn)間連接強(qiáng)度更高，物種豐富度與相互作用關(guān)系更為復(fù)雜。相較GS（10.42），DP（6.14）與FH（6.85）的網(wǎng)絡(luò)具有較短的路徑距離，路徑距離代表物種之間傳遞物質(zhì)、能量與信息的速率[25]，說明GS 土壤細(xì)菌間信息、能量等傳遞速度較慢，但外界環(huán)境發(fā)生變化的情況下，細(xì)菌群落可以保持相對穩(wěn)定，DP 和FH 土壤的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)對環(huán)境變化的響應(yīng)速度較快。網(wǎng)絡(luò)平均聚類系數(shù)代表節(jié)點(diǎn)的聚合緊密程度，DP 土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的聚類系數(shù)遠(yuǎn)大于FH 和GS。分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)間作用存在正相關(guān)和負(fù)相關(guān)，正相關(guān)代表兩者存在共生、協(xié)作關(guān)系，負(fù)相關(guān)代表競爭、捕食關(guān)系，構(gòu)建的3 個(gè)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)間關(guān)系均為正相關(guān)占優(yōu)，不同模式正相關(guān)占比大小為：GS>FH>DP。

總的來看，DP 模式的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)規(guī)模龐大，關(guān)系復(fù)雜，信息傳遞速度較快，菌群間連接緊密；FH 模式的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)規(guī)模小，菌群間聯(lián)通度低，網(wǎng)絡(luò)的平均路徑距離短，對環(huán)境變化響應(yīng)速度快，穩(wěn)定性最差；GS模式的網(wǎng)絡(luò)規(guī)模處于DP 與FH 之間，菌群間聯(lián)系不緊密，路徑距離長，物質(zhì)能量與信息等輸送較慢，網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性一般。3 種復(fù)墾模式的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)菌群間作用關(guān)系均為正相關(guān)占優(yōu)，GS 模式的正相關(guān)占比最高，DP 模式最低。

網(wǎng)絡(luò)共包含2 097 個(gè)節(jié)點(diǎn)OTU（如圖7），其中關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)6 個(gè)，DP 細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)含OTU2027（擬桿菌門）1個(gè)連接節(jié)點(diǎn)；FH 細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)含OTU381（酸桿菌門）1個(gè)模塊樞紐；GS 細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)含4 個(gè)連接節(jié)點(diǎn)，分別是：OTU159（變形菌門）、OTU34（酸桿菌門）、OTU104（酸桿菌門）、OTU581（變形菌門）。酸桿菌門所占的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)最多，其門下的OTU381 作為模塊樞紐起著維持網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定的作用，變形菌門與擬桿菌門的部分菌群作為連接節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)連接上發(fā)揮著重要作用。

圖7 微生物分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的Zi、Pi 拓?fù)浞植糉ig.7 Topological distribution of Zi and Pi of soil microbial

3 討 論

微生物在礦區(qū)土壤生態(tài)系統(tǒng)的重建中發(fā)揮著重要作用[26]。從各多樣性指數(shù)來看，不同復(fù)墾模式下土壤細(xì)菌群落的多樣性水平存在顯著差異，且均表現(xiàn)為挖深墊淺最高，煤矸石充填復(fù)墾高于粉煤灰充填復(fù)墾（圖4）。相較于充填復(fù)墾，挖深墊淺的Richness 指數(shù)更有大幅度提高，說明挖深墊淺更有利于土壤細(xì)菌群落多樣性的提升。水分含量高的土壤更有利于細(xì)菌群落多樣性發(fā)展[27]。由于淹水厭氧環(huán)境限制了有機(jī)質(zhì)的分解消耗，可利用微生物能量增加，且水體連通性使得土壤內(nèi)部物質(zhì)周轉(zhuǎn)緩和，可緩解外部環(huán)境擾動(dòng)對微生物的影響，從而呈現(xiàn)出水分參與的土壤生態(tài)細(xì)菌群落多樣性水平較高[28]。王卓理等[29]研究平頂山復(fù)墾地發(fā)現(xiàn)充填復(fù)墾土壤的含水量普遍較低，而挖深墊淺復(fù)墾土壤尤其底部含水量較高。因此，可能是挖深墊淺復(fù)墾土壤水分條件的獨(dú)特有利于細(xì)菌群落多樣性的發(fā)展，且環(huán)境復(fù)雜程度的增加使得土壤細(xì)菌群落有了更多樣的發(fā)展方向，從而呈現(xiàn)較高的多樣性水平。而煤矸石和粉煤灰與土壤本質(zhì)不同，填充后的復(fù)墾土壤剖面通常形成明顯的二（土壤-煤矸石/粉煤灰）界面特征，在一定程度上阻礙了物質(zhì)能量交換的連續(xù)性[30-31]。且蒸發(fā)時(shí)，地下水分難以通過充填層向上遷移，上覆土壤會(huì)發(fā)生較強(qiáng)的蒸騰，水分流失較快，最終導(dǎo)致水分條件不佳[32]。此外，物質(zhì)能量交換的連續(xù)性受阻也可造成細(xì)菌生長繁殖所需的養(yǎng)分供給不足，從而導(dǎo)致充填復(fù)墾土壤的細(xì)菌多樣性水平較低[33]。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同復(fù)墾模式土壤的優(yōu)勢細(xì)菌門基本一致，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門和擬桿菌門是排名前4 的菌門，在各樣本土壤中相對豐度總和均占70%以上（圖2），與朱奕豪[34]和LIU[35]等在不同類型土壤中的優(yōu)勢菌群結(jié)果相似。陳來紅等[36]發(fā)現(xiàn)準(zhǔn)格爾露天礦區(qū)復(fù)墾土壤中優(yōu)勢細(xì)菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門等，與本文有一定差異，可能是地區(qū)、氣候與農(nóng)田耕作方式等，導(dǎo)致了差異，說明細(xì)菌群落對特定土壤環(huán)境做出了適應(yīng)性改變。變形菌門的環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，可代謝多種有機(jī)物，參與土壤中氮素轉(zhuǎn)化以及能量循環(huán)，廣泛存在于各種環(huán)境，是環(huán)境中數(shù)量最多、代謝多樣性最豐富的細(xì)菌門[37-38]。酸桿菌門作為農(nóng)田土壤中的第二大細(xì)菌類群，即使在寡營養(yǎng)的環(huán)境中仍能存活，還可以改善土壤的酸性條件，更能適應(yīng)礦區(qū)復(fù)墾土壤的復(fù)雜環(huán)境[39]。放線菌門可促使土壤中動(dòng)植物殘?bào)w腐爛，對有機(jī)物的礦化有重要作用，有利于土壤養(yǎng)分提高[40]。擬桿菌門的大多數(shù)菌種具有降解土壤污染物，改善土壤環(huán)境的作用[41]。芽單胞菌門的生理結(jié)構(gòu)特殊，是典型的旱地優(yōu)勢菌門，可以適應(yīng)缺水等極端環(huán)境[42-43]，其在煤矸石充填復(fù)墾土壤中的豐度較高，也印證了煤矸石充填復(fù)墾土壤的水分條件較差，影響了微生物區(qū)系發(fā)育。鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）在粉煤灰與煤矸石充填復(fù)墾土壤中占比較高，其大多數(shù)菌種可降解結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多環(huán)芳烴環(huán)境污染物，在受污染土壤中受到青睞[44-45]，高潛水位采煤沉陷區(qū)地勢低洼，下層充填物中含有的可溶鹽與重金屬離子可能會(huì)隨季節(jié)性水份變化遷移到上層土壤，影響微生物群落組成。由此可見，微生物可通過調(diào)整自身結(jié)構(gòu)適應(yīng)特定的土壤環(huán)境，顯示出了應(yīng)對多種惡劣環(huán)境的巨大潛力。

研究微生物與各影響因子的適應(yīng)機(jī)制有利于更好理解其與土壤之間的相互作用過程。Mantel test結(jié)果顯示（表2），對整個(gè)微生物群落組成有顯著影響的有土壤有機(jī)質(zhì)與pH，優(yōu)勢細(xì)菌門與影響因子的相關(guān)性分析顯示（圖5），土壤有效磷、速效鉀和全氮含量也出現(xiàn)顯著相關(guān)，與以往研究中土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受土壤pH、有機(jī)質(zhì)、速效鉀、速效磷與氮等因素影響的結(jié)果類似[46-48]。說明特定復(fù)墾區(qū)域土壤微生物群落結(jié)構(gòu)受到該區(qū)土壤因素的疊加影響，難以用單一因素表征。不同復(fù)墾模式土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的顯著影響因子不同，DP 模式中，土壤有機(jī)質(zhì)含量是土壤細(xì)菌群落組成的主要影響因子，有機(jī)質(zhì)為微生物提供養(yǎng)分來源，能促使團(tuán)粒結(jié)構(gòu)形成，提高土壤的吸收和緩沖性能，改善土壤的物理、化學(xué)及生物條件[49]。GS 與FH 模式中，pH 是主要的影響因子，可能因研究區(qū)地處高潛水位采煤沉陷區(qū)，煤矸石與粉煤灰中的部分重金屬離子會(huì)隨水分遷移，發(fā)生堿金屬反應(yīng)，從而影響上層土壤pH[50]。隨著土壤細(xì)菌群落組成差異的增大，3 個(gè)復(fù)墾模式土壤pH 的值均增大，說明pH 的升高可能有利于細(xì)菌群落的多樣發(fā)展。不同復(fù)墾模式影響因子與菌門豐度的變化趨勢存在差異，如GS 土壤pH 與酸桿菌門的豐度呈顯著正相關(guān)，豐度隨著pH 的增大而增大，而DP 土壤pH 與酸桿菌門的豐度呈負(fù)相關(guān)，豐度隨著pH 的增大而減小，GS 土壤全氮含量與放線菌門豐度呈正相關(guān)，但FH土壤全氮含量與放線菌門豐度呈顯著負(fù)相關(guān)等，有時(shí)，同一細(xì)菌門下的不同亞群與影響因子的響應(yīng)關(guān)系不同（如酸桿菌門[51]），也會(huì)產(chǎn)生相互抵消或協(xié)同，從而掩蓋了影響因子與細(xì)菌群落間的真實(shí)關(guān)系。特定影響因子的選擇性固然重要，但很多情況下，土壤細(xì)菌群落的構(gòu)建過程是具有隨機(jī)性的自然生態(tài)過程[52-53]。

DP 土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)規(guī)模龐大，節(jié)點(diǎn)連接強(qiáng)度與聚類程度高，說明細(xì)菌群落相互作用的關(guān)系復(fù)雜、聯(lián)系緊密，F(xiàn)H 土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)規(guī)模最小，節(jié)點(diǎn)間聯(lián)系強(qiáng)度最低，穩(wěn)定性最差，DP 與GS 網(wǎng)絡(luò)平均路徑距離較短，說明對環(huán)境變化的響應(yīng)速度較快。GS 土壤的網(wǎng)絡(luò)規(guī)模介于挖深墊淺與粉煤灰充填之間，但平均路徑距離較長，細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)相對較穩(wěn)定。網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)浞治觯▓D7）顯示，GS 擁有4 個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，DP 和FH 均有1 個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，一般擁有連接器和模塊樞紐較多的細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)抵御環(huán)境擾動(dòng)的能力更強(qiáng)[54]。結(jié)果表明，3 種復(fù)墾模式土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)間關(guān)系均為正相關(guān)占優(yōu)，復(fù)墾后的土壤菌群關(guān)系趨向于合作，與李肖肖等[55]研究結(jié)果一致，DP 網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，協(xié)作關(guān)系占比最低，可能是因?yàn)樵摰貕K土壤有機(jī)質(zhì)含量較高[56]。有研究表明環(huán)境擾動(dòng)將使微生物群落結(jié)構(gòu)變化遲緩[57]，本文中GS 網(wǎng)絡(luò)的平均路徑長度遠(yuǎn)大于DP 和FH，說明GS 細(xì)菌群落響應(yīng)環(huán)境變化的速度緩慢，可能是煤矸石粒徑較大，充填效果差，且煤矸石及其淋溶產(chǎn)物會(huì)抑制生物活性[58]，影響了土壤微生物間的物質(zhì)輸送?；诰W(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)識別出的關(guān)鍵菌群分別屬于酸桿菌門、變形菌門和擬桿菌門，酸桿菌門所占的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)數(shù)量最多，其門下的Subgroup_6 作為網(wǎng)絡(luò)樞紐，在網(wǎng)絡(luò)的連接中發(fā)揮重要作用。

4 結(jié) 論

1）不同復(fù)墾模式土壤細(xì)菌群落的多樣性和豐富度水平有顯著差異，挖深墊淺土壤細(xì)菌多樣性與豐富度水平更高。不同復(fù)墾模式土壤中的優(yōu)勢菌門大致相同，但所占比例有差異，變形菌門、酸桿菌門、放線菌門與擬桿菌門在3 種復(fù)墾模式的土壤樣品中均為優(yōu)勢菌門，在各模式土壤細(xì)菌群落中的占比之和均達(dá)70%以上。

2）不同復(fù)墾模式下影響細(xì)菌群落組成的主控影響因子不同，影響因子與菌群間的變化趨勢存在差異。有機(jī)質(zhì)含量是挖深墊淺復(fù)墾土壤細(xì)菌群落組成的主要影響因素，煤矸石與粉煤灰充填復(fù)墾土壤中pH 是主要影響因素。優(yōu)勢細(xì)菌門與影響因子的相關(guān)性分析顯示，土壤有效磷、速效鉀和全氮含量也出現(xiàn)了顯著相關(guān)。部分優(yōu)勢細(xì)菌門對土壤pH、全氮、有機(jī)質(zhì)、有效磷和速效鉀無明顯響應(yīng)。

3）挖深墊淺土壤細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜，節(jié)點(diǎn)聯(lián)系緊密，細(xì)菌群落對環(huán)境變化的反應(yīng)速度快；煤矸石充填土壤菌群間信息與物質(zhì)傳遞速率較慢，擁有的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)最多，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，且菌群協(xié)作關(guān)系的占比最高；粉煤灰充填土壤細(xì)菌聯(lián)系不緊密，網(wǎng)絡(luò)規(guī)模小，穩(wěn)定性差。