植被恢復(fù)類型對露采礦山復(fù)墾土壤豐富和稀有微生物類群的影響

馬 靜 ，華子宜 ，程彥郡 ，朱燕峰 ，楊永均 ，陳 浮

（1.河海大學(xué) 公共管理學(xué)院, 江蘇 南京 211100；2.中國礦業(yè)大學(xué) 環(huán)境與測繪學(xué)院, 江蘇 徐州 221116）

0 引 言

當(dāng)前化石燃料主導(dǎo)著全球能源消費(fèi)，近20 年我國煤炭開采持續(xù)擴(kuò)大。煤炭開采引發(fā)的地表形變導(dǎo)致植被—土壤嚴(yán)重退化，損害礦區(qū)生態(tài)環(huán)境[1-2]。黨的十八以來，中央高度重視生態(tài)文明建設(shè)，礦山環(huán)境治理與生態(tài)恢復(fù)是重中之重，備受各界關(guān)注。植被修復(fù)是礦區(qū)生態(tài)環(huán)境治理的有效方式，也是礦山生態(tài)環(huán)境恢復(fù)的重要標(biāo)志。然而，植被生長嚴(yán)重受限于礦區(qū)復(fù)墾土壤的功能恢復(fù)，尤其是生態(tài)環(huán)境相對脆弱的黃土高原露天煤礦區(qū)。露天煤礦復(fù)墾土壤壓實(shí)重、結(jié)構(gòu)散、肥力差，缺少必要的碳、氮等營養(yǎng)元素，嚴(yán)重限制植被恢復(fù)的養(yǎng)分需求[3]。微生物是有機(jī)物分解和養(yǎng)分循環(huán)的重要貢獻(xiàn)者，復(fù)墾土壤微生物區(qū)系發(fā)育直接影響土壤功能和性狀，從而影響植被生長。不同的植被恢復(fù)模式又會影響土壤微生物群落組成、多樣性和代謝功能等，對土壤功能和性狀產(chǎn)生逆反饋?zhàn)饔肹4]。因此，充分厘清土壤–植物–微生物之間的交互作用，形成一個(gè)互促互進(jìn)的良性循環(huán)機(jī)制，有助于激發(fā)生態(tài)系統(tǒng)自恢復(fù)潛力，對黃土高原露天煤礦區(qū)生態(tài)恢復(fù)和管理至關(guān)重要。

土壤微生物種類豐富、功能復(fù)雜，不同豐度的分類群在生物地球化學(xué)循環(huán)中扮演著不同的角色。微生物群落中物種的豐度和分布是不均勻的，豐富種少，稀有種多[5]。不同的微生物在維持生態(tài)系統(tǒng)功能中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括營養(yǎng)循環(huán)、有機(jī)質(zhì)分解、土壤健康和作物生產(chǎn)力[6]。然而，采礦干擾直接損害微生物的正常生理代謝，進(jìn)而對微生物多樣性乃至生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響。在土壤修復(fù)過程中，豐富微生物類群因其在生物量提高和養(yǎng)分循環(huán)改善中的突出貢獻(xiàn)而被長期關(guān)注。近年來的研究開始強(qiáng)調(diào)稀有類群在維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定方面的重要性。稀有物種具有較高的多樣性和功能冗余，因此在微生物群落中具有功能保障作用。研究發(fā)現(xiàn)，豐富和稀有物種抵抗擾動時(shí)會存在種內(nèi)或種間相互作用，構(gòu)成復(fù)雜的生態(tài)網(wǎng)絡(luò)，維持微生物網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性[7]。值得注意的是，有些物種，無論其數(shù)量多少，仍在生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)關(guān)鍵位置(如樞紐和連接點(diǎn))，被認(rèn)為是群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定必需的關(guān)鍵物種[8]。然而，無論這些關(guān)鍵物種是豐富或稀有種，它們對環(huán)境擾動的響應(yīng)并不總是一致的[9]。例如，研究表明，豐富類群比稀有類群抵抗環(huán)境擾動方面具有更廣泛的環(huán)境變化適應(yīng)能力[10]。然而，由于對重金屬的抗性差異，原始土壤中幾乎所有的稀有類群都被重金屬清除，導(dǎo)致細(xì)菌多樣性嚴(yán)重下降[6]。也有研究表明，在氣候變化和其他干擾(如銅脅迫、凍融和機(jī)械干擾)的影響下，稀有類群的多樣性和群落組成更加穩(wěn)定[8]。CHANG 等[11]發(fā)現(xiàn)，植被恢復(fù)增加了礦區(qū)復(fù)墾土壤微生物群落網(wǎng)絡(luò)和復(fù)雜性，混交林網(wǎng)絡(luò)具有更為復(fù)雜結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性。微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)方法有助于更好地理解植被恢復(fù)類型或土地利用變化對微生物群落的影響，并依據(jù)拓?fù)潢P(guān)系闡明不同關(guān)聯(lián)之間的復(fù)雜性和穩(wěn)定性。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)在高度異質(zhì)環(huán)境中豐富和稀有類群表現(xiàn)出復(fù)雜的相互作用，如捕食、競爭、共生等[12]。鑒于豐富和稀有微生物類群在土壤功能和生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)中發(fā)揮不同作用，加上對稀有微生物的認(rèn)知局限性，研究者對土壤生態(tài)系統(tǒng)如何響應(yīng)外界擾動預(yù)測的準(zhǔn)確性有所下降。雖然現(xiàn)階段對豐富和稀有類群的關(guān)注與日俱增，但對礦區(qū)生態(tài)修復(fù)過程中復(fù)墾土壤豐富和稀有類群變化一直鮮有研究，尤其是不同植被恢復(fù)模式下豐富和稀有類群如何調(diào)節(jié)復(fù)墾土壤功能及植被—土壤之間互作關(guān)系。

植被-土壤-微生物之間交互作用和機(jī)制十分復(fù)雜，厘清三者之間關(guān)系對基于自然的礦山生態(tài)修復(fù)解決方案至關(guān)重要。為此，研究采用高通量測序技術(shù)和分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)方法，分析內(nèi)蒙古準(zhǔn)格爾旗黑岱溝露天礦復(fù)墾示范基地的東排土場5 種植被恢復(fù)類型和1 個(gè)對照共48 個(gè)土樣中豐富和稀有微生物群落組成、多樣性及共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)差異，探究土壤豐富和稀有微生物群落、植被和環(huán)境因素之間的互作關(guān)系及機(jī)理，揭示驅(qū)動豐富和稀有微生物群落特征差異的關(guān)鍵環(huán)境因子，為科學(xué)評估植被恢復(fù)如何影響礦區(qū)土壤質(zhì)量動態(tài)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

黑岱溝露天礦東排土場（39°43′N～39°49′N，111°13′E～111°20′E）位于內(nèi)蒙古自治區(qū)準(zhǔn)格爾旗，該地區(qū)屬于溫帶半干旱大陸性氣候，年均氣溫7.2 ℃，年均降水量396.0 mm，集中于7—9 月份，占全年降水的70%，年蒸發(fā)量為1 824.7～2 896.1 mm。該排土場面積為210.0 hm2，為典型黃土丘陵溝壑區(qū)，主要植被為暖溫型草原帶，覆蓋度一般小于30.0%。土壤類型為黃綿土，顏色淺、肥力低、偏堿性、比熱容小。1992 年該排土場開始排棄，1997 年實(shí)施人工復(fù)綠，采用臺–坡階梯式布置，分3 層，底層海拔1 215 m，每層高差為30 m，分21 個(gè)復(fù)植區(qū)域，主要種植苜蓿、沙打旺、沙棘、錦雞兒、紫穗槐、油松、刺槐、楊樹等植被[13]。

1.2 樣品采集與處理

2022 年8 月20 至25 日開展野外調(diào)查，采集對照（裸地，CK）草地（苜蓿，GL）、灌叢（沙棘，BL）、針葉林（油松，CF）、闊葉林（楊樹，BF）、混交林（油松+楊樹，MF），如圖1 所示。通過“5 點(diǎn)取樣法”在每塊樣地上采集土壤樣品，即首先確定對角線的中點(diǎn)作為取樣點(diǎn)，然后在對角線上選擇與中心點(diǎn)等距的點(diǎn)進(jìn)行取樣。在取樣前，詳細(xì)記錄當(dāng)天基本天氣狀況、土壤含水量和溫度等相關(guān)指標(biāo)，同時(shí)清理樣方表面腐殖質(zhì)層和雜質(zhì)，采集0～20 cm 表層土壤約300 g，每個(gè)植被類型采集8 個(gè)土壤樣品，共計(jì)48 個(gè)。除去土壤中植物根系和凋落物殘?bào)w，將土壤樣品充分混合均勻，密封在聚氯乙烯袋中，寫好樣本編號，帶回實(shí)驗(yàn)室，風(fēng)干樣品后再次剔除砂石，動植物殘?bào)w等雜質(zhì)，直接放入4 ℃冰箱運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。土樣充分混勻后，分為兩份，一份用于微生物多樣性和部分土壤酶活性測定。另一份在室內(nèi)風(fēng)干后過2 mm 篩，用于土壤理化性質(zhì)和土壤酶活性的測定。土壤pH 值（水、土質(zhì)量比 2.5∶1）采用電位法（PH3–C，上海雷磁），土壤有機(jī)質(zhì)（SOM）采用重鉻酸鉀稀釋熱法測定，易氧化有機(jī)碳（EOOC）采用333 mmol/L-1高錳酸鉀溶液氧化法測定，銨態(tài)氮（AN， NH+4-N）和硝態(tài)氮（NN，NO-3-N）采用氯化鉀、氯化鈣浸提–紫外分光光度法測定，有效磷（AP）釆用0.5 mol/L-1NaHCO3浸提再用鉬銻抗試劑比色測定，測定步驟詳見文獻(xiàn)[14]。研究測定的土壤酶活性指標(biāo)主要包括β–葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、脲酶、亮氨酸氨基肽酶。其中，堿性磷酸酶（ALP）通過磷酸苯二鈉比色法測定，脲酶（URE）通過苯酚鈉–次氯酸鈉比色法測定，β–葡萄糖苷酶（BG）通過硝基苯酚比色法測定[15]，亮氨酸氨基肽酶（LAP）采用索萊寶試劑盒測定。

圖1 研究區(qū)位置和采樣點(diǎn)示意Fig.1 Location of the study area and sampling sites

1.3 DNA 提取，高通量測序和微生物類群劃分

土壤微生物群落多樣性測定采用高通量測序法：首先，使用E.Z.N.A.? soil 試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross, GA, U.S.)提取每個(gè)土壤樣品總DNA，后采用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop2000)經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 濃度和純度。采用16S rDNA的V3－V4 區(qū)標(biāo)準(zhǔn)引物對338F/806R (5'－ACTCCTA CGGGAGGCAGCAG－3'，5'－GGACTACHVGGGTW TCTAAT－3') 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，27 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。通過AxyPrep DNA Gel Extraction Kit進(jìn)行純化，Tris－HCl 洗脫， 2%瓊脂糖電泳檢測后回收PCR 產(chǎn)物，再通過QuantiFluor TM－ST 定量檢測。采用Illumina MiSeq (Illumina，美國) 標(biāo)準(zhǔn)方法利用純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建測序文庫，再采用美吉Miseq PE300 平臺測序，該測序流程工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

研究中，門水平下，相對豐度≥1%的菌門被定義為豐富菌門，相對豐度≤0.01%的菌門被定義為稀有菌門。ASVs（Amplicon Sequence Variants）水平下，當(dāng)在所有樣本中ASVs 的平均相對豐度≥0.1% 時(shí)，將其定義為豐富類群；當(dāng)ASVs 在整個(gè)數(shù)據(jù)集中的平均相對豐度≤0.05%時(shí)，將其定義稀有類群。相對豐度在0.05% ～ 0.1%之間的ASVs 屬于中間群落[16-18]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 26.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析，對不同處理土壤理化、酶活性和α 多樣性指數(shù)采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，土壤微生物群落豐度圖使用OriginPro2020 軟件（Origin Lab，USA）繪制，在不同處理之間的微生物群落ASVs，進(jìn)行基于Bray–Curtis 距離非度量多維尺度(NMDS)分析其微生物群落β 多樣性。微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)鋮?shù)的計(jì)算是基于細(xì)菌和真菌高通量測序結(jié)果，采用Mena 平臺進(jìn)行，網(wǎng)絡(luò)分析中，節(jié)點(diǎn)代表ASVs，連接節(jié)點(diǎn)的邊代表ASVs 之間的關(guān)聯(lián)性，并使用R 實(shí)現(xiàn)可視化。Mantel tests 利用R 中的ggcor 包進(jìn)行了單因素方差分析，以確定P< 0.05處理之間的顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植被類型土壤理化性質(zhì)和酶活性變化

排土場復(fù)墾區(qū)不同植被恢復(fù)類型對土壤產(chǎn)生不同影響，土壤理化性質(zhì)和酶活性影響存在顯著差異，如圖2 所示：土壤pH 值均高于7.0，呈堿性，其中MF 最高，BL 最低且與其他處理組存在顯著性差異（圖2a,P< 0.05）。BL 土壤有機(jī)質(zhì)含量顯著高于CK、GL、BF 和MF（P< 0.05），CK 顯著低于所有植被恢復(fù)組（圖2b,P< 0.05）。CF 土壤易氧化有機(jī)碳含量最高，MF 最低，且二者與其他處理呈顯著性差異（圖2c,P< 0.05）。BL 土壤中硝態(tài)氮積累顯著高于其他處理（圖2d,P< 0.05）。不同植被恢復(fù)組土壤銨態(tài)氮顯著高于CK，與GL、BL、CF、BF 和MF 相比，分別下降了56.5%、53.4%、54%、57.2% 和53.7%（圖2e,P< 0.05）。BL 土壤中有效磷含量顯著高于CK、CF、BF 和MF（P< 0.05），GL 與其他處理組差異不顯著（圖2f）。在土壤酶活性方面，CK 組土壤β–葡萄糖苷酶活性顯著高于其他植被處理組（P<0.05），且大約提高了2.7% ～ 5.3%（圖2g）。土壤脲酶、亮氨酸氨基肽酶和堿性磷酸酶活性變化趨勢較為接近，其中BL 土壤中這3 種酶活性最高，顯著高于其他處理組，而CK 顯著低于其他處理（圖2h、2i和2j,P< 0.05）。

圖2 不同處理組土壤理化性質(zhì)以及土壤酶活性變化Fig.2 Changes of soil physicochemical properties and soil enzyme activities in different treatment groups

2.2 不同植被類型土壤豐富和稀有細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)特征

2.2.1 不同植被類型土壤豐富和稀有細(xì)菌、真菌群落組成

植被恢復(fù)類型的變化對土壤豐富和稀有細(xì)菌、真菌群落組成產(chǎn)生影響，有一定的差異性，但在所有處理中，土壤豐富和稀有細(xì)菌、真菌群落主要菌門保持一致。豐富細(xì)菌的優(yōu)勢門為放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria），其中放線菌門最為豐富，其相對豐度占比在28% ～ 49%（圖3a），且在CK 中占比最高，顯著高于其他植被恢復(fù)組（P<0.05）。在稀有細(xì)菌類群中，裝甲菌門（Armatimonadota）和藍(lán)藻門（Cyanobacteria）為優(yōu)勢稀有細(xì)菌門（圖3b），盡管所有處理組稀有細(xì)菌主要菌門相似，但各組相對豐度變化存在明顯差異。植被恢復(fù)組藍(lán)藻門（Cyanobacteria）的相對豐度顯著低于CK（P<0.05）。GL 組的脫硫桿菌門（Desulfobacterota）豐度顯著高于其他植被復(fù)墾及CK 組，而裝甲菌門和藍(lán)藻門則呈現(xiàn)與之相反的趨勢。在豐富真菌類群中，子囊菌門（Ascomycota）和擔(dān)子菌門（Basidiomycota）為群落主導(dǎo)菌門（圖3c）。CF、BF 和MF 擔(dān)子菌門顯著高于其余處理組（P< 0.05）。所有處理組的稀有真菌相對豐度結(jié)果顯示（圖3d），BL、CF、BF 和MF 處理組的羅茲菌門（Rozellomycota）相對豐度占比最高，分別為56.1%、86.3%、88.5% 和91.63%，顯著高于CK 和GL 組（P< 0.05）。CK 處理的油壺菌門（Olpidiomycota）顯著高于植物恢復(fù)組，而GL 組的捕蟲霉門（Zoopagomycota）和蛙糞霉門（Basidiobolomycota）則顯著高于其他處理組（P< 0.05）。總體來看，隨著植被恢復(fù)類型的改變，豐富和稀有細(xì)菌種類多于真菌，但真菌豐度變化更為顯著，尤其是稀有真菌門。放線菌門和子囊菌門（Actinobacteria）分別為不同處理組的優(yōu)勢菌門（圖3e，圖3f）。

圖3 不同處理組豐富和稀有群落的優(yōu)勢門分布Fig.3 Dominant phylum distribution of rich and rare communities in different treatment groups

2.2.2 不同植被類型土壤豐富和稀有細(xì)菌、真菌群落多樣性

土壤細(xì)菌、真菌α 多樣性（Shannon）計(jì)算結(jié)果如圖4 所示，總體來看，不同植被恢復(fù)類型顯著改變了豐富和稀有微生物群落Shannon 指數(shù)的變化。豐富、稀有細(xì)菌和稀有真菌類群所有處理中，CK 組Shannon 指數(shù)顯著低于植被恢復(fù)組（P< 0.05），而不同植被恢復(fù)類型對豐富真菌群落的Shannon 指數(shù)無顯著影響。在稀有細(xì)菌群落中GL 的Shannon 指數(shù)顯著高于CF（P< 0.05），而BL、BF、和MF 組無顯著差異（圖4b）。GL 和BL 組中稀有真菌的Shannon 指數(shù)較大（圖4d），顯著大于CF、BF 和MF 組（P< 0.05）。然后，對豐富和稀有細(xì)菌、真菌在ASVs 水平上進(jìn)行基于Bray–Curtis 距離的PCoA 分析，結(jié)果如圖5 所示，不同處理組的豐富和稀有細(xì)菌、真菌Beta 多樣性表現(xiàn)為組間分離、組內(nèi)緊密，形成明顯的聚類效應(yīng)，表明不同植被恢復(fù)處理及CK 之間群落Beta 多樣性差異顯著。豐富、稀有細(xì)菌中，CK 與其他植被恢復(fù)組沿X軸呈分離趨勢，表明CK 和其他植被處理組的群落結(jié)構(gòu)間存在顯著差異（P< 0.05，圖5a 和5b），而豐富細(xì)菌中不同植被恢復(fù)組間相互重疊，差異不明顯，說明這些處理間豐富細(xì)菌群落系統(tǒng)發(fā)育更為接近。CK、GL 和BL 組豐富和稀有真菌群落沿x軸與CF、BF 和MF 組之間存在距離（圖5c 和5d）。CF、BF 和MF 組稀有真菌群落趨勢圈相近，幾乎重疊，但CK 沿y軸與GL 和BL 組有一定距離。

圖4 不同處理組對α 多樣性的影響Fig.4 Effects of different treatment groups on α diversity

圖5 不同處理組土壤細(xì)菌、真菌β 多樣性Fig.5 β diversity of soil bacteria and fungi in different treatment groups

2.3 不同植被類型土壤豐富和稀有類群共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)

基于ASVs 之間的Spearman 相關(guān)性，構(gòu)建豐富與稀有微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)，探索不同植被恢復(fù)模式下豐富、稀有微生物群落內(nèi)部物種間的互聯(lián)關(guān)系。基于隨機(jī)矩陣?yán)碚摰姆椒?，相關(guān)系數(shù)的閾值確定為0.65，分析所構(gòu)建每個(gè)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩裕ū? 和表2）。表1 顯示，與CK 處理相比，植被恢復(fù)增加了豐富和稀有細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)（nodes）、連接數(shù)（links）和網(wǎng)絡(luò)度（degree）等拓?fù)鋵傩?。GL、BL、CF、BF 和MF豐富細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)分別由140、167、134、138、139 個(gè)ASV 節(jié)點(diǎn)和471、633、545、601、588 條連接構(gòu)成，高于CK（112 個(gè)節(jié)點(diǎn)和442 條連接）。GL、BL、CF、BF 和MF 稀有細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)分別由279、317、258、267、273 個(gè)ASV 節(jié)點(diǎn)和1 771、1878、1 471、1 783、1 973條連接構(gòu)成，遠(yuǎn)高于CK（172 個(gè)節(jié)點(diǎn)和893 條連接）。BL 豐富真菌網(wǎng)絡(luò)由92 個(gè)ASV 節(jié)點(diǎn)和183 條連接構(gòu)成，遠(yuǎn)高于CK（64 個(gè)節(jié)點(diǎn)和124 條邊），而其余恢復(fù)類型下豐富真菌網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)和連接數(shù)均略高于CK網(wǎng)絡(luò)（表2）。BL、BF 和MF 稀有真菌網(wǎng)絡(luò)分別由280、218、240 個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 490、932、1 008 條連接構(gòu)成，遠(yuǎn)高于CK 稀有真菌網(wǎng)絡(luò)（102 個(gè)節(jié)點(diǎn)和243 條邊）。總體上，不同植被恢復(fù)類型均提高了豐富和稀有細(xì)菌、真菌的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)和復(fù)雜度。

表1 不同植被恢復(fù)模式土壤細(xì)菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩訲able 1 Topological properties of soil bacteria co-occurrence networks in different vegetation restoration modes

表2 不同植被恢復(fù)模式土壤真菌共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩訲able 2 Topological properties of soil fungi co-occurrence networks in different vegetation restoration modes

圖6 的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明：不同植被恢復(fù)類型的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)比CK 更加復(fù)雜，尤其是GL、BL、CF、BF 和MF 稀有細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)，和BL、BF 和MF 稀有真菌網(wǎng)絡(luò)。豐富細(xì)菌中Actinobacteria、Proteobacteria、Acidobacteria和Chloroflexi4 個(gè)菌門占共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)ASV 節(jié)點(diǎn)>90%，其中：Actinobacteria（44.27%～46.44%）和Proteobacteria（24.54%～28.36%）占據(jù)絕對主導(dǎo)地位。除了BF，其他植被恢復(fù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)之間正向關(guān)系占比大于70%，且高于CK，菌群之間更趨向于合作。圖6b 中，稀有細(xì)菌中Armatimonadota、Cyanobacteria和甲基米拉氏菌門（Methylomirabilota）3 個(gè)菌門占共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)ASV 節(jié)點(diǎn)>76%，處于主導(dǎo)地位。雖然所有植被恢復(fù)網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)之間正向關(guān)系占比大于50%，菌群之間趨向于合作關(guān)系，但正向關(guān)系占比均小于CK。豐富真菌網(wǎng)絡(luò)中，Ascomycota和Basidiomycota在共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)ASV 節(jié)點(diǎn)中占據(jù)主導(dǎo)地位，占比>77%，且所有網(wǎng)絡(luò)連接以正向關(guān)系為主，其占比大于85%，菌群之間趨向于合作關(guān)系。稀有真菌網(wǎng)絡(luò)中，Rozellomycota和梳霉門（Kickxellomycota）在所有網(wǎng)絡(luò)ASV 節(jié)點(diǎn)中占比>69%，除了MF 的占比為52%。所有稀有真菌網(wǎng)絡(luò)連接以正向?yàn)橹?，均大?8%。

圖6 不同植被類型細(xì)菌與真菌微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.6 Co-occurrence network of bacteria and fungi in different vegetation types

為進(jìn)一步確認(rèn)微生物網(wǎng)絡(luò)對干擾的抵抗力（穩(wěn)健性）強(qiáng)弱，通過移除節(jié)點(diǎn)改變自然連通性的幅度進(jìn)行測試，結(jié)果如圖7 所示，去除相同比例的節(jié)點(diǎn)后，所有植被恢復(fù)模式下的豐富和稀有細(xì)菌、真菌網(wǎng)絡(luò)的自然連通性比原始狀態(tài)均有所下降，而綜合來看，CK 斜率最大，下降速率最大，說明其微生物網(wǎng)絡(luò)受環(huán)境干擾抵抗力較弱。對于豐富細(xì)菌和豐富真菌網(wǎng)絡(luò)（圖7a 和圖7c），BL 變化幅度較小，GL 波動次之，表明BL 和GL 增加了土壤豐富細(xì)菌和真菌網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性。稀有細(xì)菌和稀有真菌網(wǎng)絡(luò)（圖7b 和圖7d）中，GL 和BL 的變化幅度最小，說明GL 和BL 分別提高了土壤稀有細(xì)菌和稀有真菌網(wǎng)絡(luò)對外界干擾的抵抗能力。

圖7 不同植被類型微生物自然連通性與移除節(jié)點(diǎn)比例之間的關(guān)系Fig.7 Relationship between natural connectivity of microorganisms and the proportion of removed nodes in different vegetation types

2.4 不同植被類型環(huán)境因子對土壤豐富和稀有微生物群落相關(guān)性分析

將土壤微生物中豐富細(xì)菌、稀有細(xì)菌、豐富真菌和稀有真菌群落結(jié)構(gòu)指標(biāo)分別作為一個(gè)矩陣，依次與土壤理化性質(zhì)與酶活性指標(biāo)做Mantel 測試，結(jié)果表明不同植被恢復(fù)類型下豐富和稀有類群均不同程度受到土壤理化和酶活性的顯著影響（P< 0.05），而CK 組僅有豐富細(xì)菌和稀有細(xì)菌受到ALP 和BG 酶活性影響（圖8）。圖8b 顯示，GL 恢復(fù)組中URE 酶極顯著影響豐富細(xì)菌群落組成（P< 0.01）。BL 處理組中pH、SOM、AP、BG 和ALP 均與稀有細(xì)菌群落呈顯著性差異（P< 0.05），pH 和AP 與豐富細(xì)菌群落有顯著關(guān)系（P< 0.05），而NN 極顯著作用于豐富細(xì)菌群落（P< 0.01），而URE 則與豐富和稀有真菌群落均具有顯著相關(guān)性（P< 0.05）（圖8c）。圖8d 中，CF恢復(fù)組的稀有真菌群落與LAP 酶活性呈極顯著相關(guān)，而BF 恢復(fù)組的URE 酶活性則與土壤細(xì)菌、真菌豐富和稀有菌群落組成均具有極顯著相關(guān)性（P< 0.01），SOM 顯著作用于豐富細(xì)菌群落（圖8e）。圖8f 顯示，URE 和ALP 酶活性極顯著作用于MF 恢復(fù)組的土壤豐富和稀有細(xì)菌群落（P< 0.01）。

圖8 不同植被類型土壤理化性質(zhì)、酶活性與豐富、稀有細(xì)菌與真菌分類群群落結(jié)構(gòu)相關(guān)性Fig.8 Soil physical and chemical properties, enzyme activities and community diversity of abundant, rare bacteria and fungi were correlated with different vegetation types

3 討 論

3.1 礦區(qū)不同植被恢復(fù)類型對土壤理化性質(zhì)和酶活性的影響

研究表明，不同植被恢復(fù)類型對土壤和酶活性的影響差異較大（圖2）。不同植被的根系分泌物和生理代謝存在明顯差異，因此植被類型的變化通常被認(rèn)為是改變土壤理化性質(zhì)和酶活性的重要因素[19]。BL 恢復(fù)組中有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮和有效磷含量高于其他處理組，而pH 顯著低于其他處理組（圖2），這可能歸結(jié)于土壤有機(jī)質(zhì)主要來源于地表植被殘?bào)w、凋落物、地下壞死的根系及其分泌物和微生物殘?bào)w等，沙棘屬于落葉性灌木，根系較為發(fā)達(dá)，有利于增加土壤中有機(jī)質(zhì)含量。此外，沙棘是干旱地區(qū)少數(shù)具有固氮能力的木本植物，雖然不是豆科植物，但它可與某些固氮菌共生，這些固氮菌在沙棘的根系上生長，形成根瘤，來固定大氣中的氮[20]，這可能是BL恢復(fù)組土壤中硝態(tài)氮含量較高的原因。有研究報(bào)道[21]，沙棘根系分泌物中酸類物質(zhì)含量最高，導(dǎo)致土壤pH 值較其他處理組偏低，而土壤pH 能夠影響土壤磷元素的化學(xué)形態(tài)，在低pH 值的土壤中，無機(jī)磷組分變化較大，使得有效磷含量增加。胞外酶是由微生物分泌到土壤中，可將復(fù)雜有機(jī)化合物降解為可被吸收的小分子，并從土壤中吸收生存所需的營養(yǎng)和能量，對微生物分解有機(jī)質(zhì)及植物對土壤碳、氮、磷等營養(yǎng)元素的吸收利用發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，在土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量交換中起著重要作用[22]。研究發(fā)現(xiàn)不同植被恢復(fù)類型對土壤胞外酶活性影響存在顯著性差異，所有植被處理組的β-葡萄糖苷酶活性均顯著低于CK，說明植被恢復(fù)組的可用碳源已滿足微生物生長需要，因?yàn)槲⑸镏挥性诳捎脿I養(yǎng)物質(zhì)稀缺時(shí)才會以生長和代謝為代價(jià)生產(chǎn)酶。BL 的脲酶和堿性磷酸酶活性顯著高于其他植被恢復(fù)組，脲酶（URE）等與土壤氮礦化和循環(huán)密切相關(guān)，能夠表征土壤中氮素營養(yǎng)狀況，磷酸酶（ALP）主要參與磷的代謝和轉(zhuǎn)化，BL 土壤中硝態(tài)氮和有效磷含量高于其他處理組，促使參與氮磷循環(huán)相關(guān)微生物活動增強(qiáng)，這使得URE 和ALP 酶活性增加，應(yīng)對氮磷營養(yǎng)的消耗，在土壤環(huán)境變化時(shí)維持養(yǎng)分平衡。寧岳偉等[23]在山西大同矸石山不同植被復(fù)墾區(qū)土壤酶活性研究中發(fā)現(xiàn)，云杉林土壤具有最高的脲酶和堿性磷酸酶活性、以及較好的氮素營養(yǎng)和有效磷含量，這與研究結(jié)果高度一致。

3.2 礦區(qū)不同植被類型對土壤豐富和稀有微生物群落多樣性和組成的影響

土壤微生物群落與地上植被類型具有密切相關(guān)性，不同植被由于凋落物生物量和分解速率不同，以及根系分泌物和根系脫落物性質(zhì)不同，可以直接影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分布，還可通過改變土壤理化性質(zhì)間接影響土壤微生物，因此，不同植被會通過直接和間接作用，選擇性地吸引一些特定微生物，使得這類微生物在林下土壤富集，從而導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[24]。此外，一些研究表明，豐富和稀有微生物類群在多樣性與群落組成方面對環(huán)境因子變化的響應(yīng)亦不一致，故在不同的植被類型中可能會表現(xiàn)出偏向的豐度分布。研究發(fā)現(xiàn)放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）和酸桿菌門（Acidobacteria）是該礦區(qū)不同植被恢復(fù)類型土壤中優(yōu)勢豐富細(xì)菌門類（圖3a），可能是由于這些門類具有較好的環(huán)境適應(yīng)性，且具有較高生態(tài)位的緣故。放線菌門是土壤中纖維素和木質(zhì)素的主要分解者，在貧瘠的土壤中亦能較好生存[25]。變形菌門是典型的堿性環(huán)境優(yōu)勢菌，且其具有固氮作用，可適應(yīng)氮含量較為匱乏的環(huán)境，綠彎菌門和酸桿菌門亦被報(bào)道具有較強(qiáng)的生態(tài)適應(yīng)能力[26-28]。BASTIDA 等[29]報(bào)道在半干旱礦區(qū)復(fù)墾土壤中放線菌門最為豐富，且KONG 等[30]和LI 等[31]也在干旱和半干旱礦區(qū)復(fù)墾土壤中發(fā)現(xiàn)變形菌門和放線菌門是優(yōu)勢細(xì)菌類群，與研究結(jié)果一致，這說明礦區(qū)復(fù)墾土壤中豐富細(xì)菌具有較好的環(huán)境適應(yīng)能力，并未對植物類型產(chǎn)生較大的依賴性。JIAO 等[32]認(rèn)為，豐富物種通常在生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)更為廣泛的生態(tài)位寬度，可以利用更多的資源，這使它們比稀有物種更能適應(yīng)外界環(huán)境擾動。稀有細(xì)菌分類群中，裝甲菌門（Armatimonadota）和藍(lán)藻門（Cyanobacteria）為優(yōu)勢稀有細(xì)菌門（圖3b）。Armatimnadota屬于好氧型寡營養(yǎng)菌門，可以降解一些復(fù)雜的碳化合物，其新成員被報(bào)道有可能生成乙酰乙酸，參與氮和硫循環(huán)，并介導(dǎo)海洋沉積物中碳循環(huán)關(guān)鍵過程[33]。王澤銘等[34]報(bào)道Armatimonadota為干旱區(qū)草地土壤的優(yōu)勢菌屬之一，李文寶等[35]亦是發(fā)現(xiàn)Armatimonadota是寒旱區(qū)典型草地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成中的關(guān)鍵菌屬，與本文結(jié)果類似。GL 處理組的脫硫桿菌門（Desulfobacterota）豐度顯著高于其他植被復(fù)墾組，推測可能是草本植被苜蓿特殊的根系分泌物造成的根際環(huán)境使得脫硫桿菌門豐度偏高，脫硫桿菌門可將有機(jī)質(zhì)完全氧化成CO2或部分氧化為乙酸鹽，降低碳源利用能力，抑制有機(jī)氮礦化，GL 恢復(fù)組的有機(jī)質(zhì)和硝態(tài)氮含量偏低可能與此相關(guān)[36]。子囊菌門和擔(dān)子菌門是自然界真菌群落中分布最廣和豐度最高的 2 個(gè)真菌類群，多數(shù)為腐生菌，在多種生境中具有較強(qiáng)的生存能力。本研究中子囊菌門和擔(dān)子菌門為植被復(fù)墾土壤豐富真菌的主導(dǎo)菌門（圖3c），與YANG 等[37]在黃土高原半干旱區(qū)退耕草地中研究的結(jié)果相似。研究中樣地土壤pH 為7.7 左右，由于堿性土壤適宜腐生真菌生長，這可能是子囊菌門和擔(dān)子菌門為優(yōu)勢豐富菌門的一個(gè)原因[27]。研究中BL、CF、BF 和MF 恢復(fù)組的稀有真菌門羅茲菌門（Rozellomycota）相對豐度占比最高，BAI 等[28]發(fā)現(xiàn)板栗和茶樹間作模式下，土壤中Rozellomycota豐度較高與研究結(jié)果類似。此外，植被恢復(fù)對于提高豐富和稀有微生物多樣性具有重要作用。較CK 處理組，植被恢復(fù)組豐富和稀有細(xì)菌及稀有真菌類群多樣性較高，在礦區(qū)排土場復(fù)墾過程中，BL 在干旱半干旱地區(qū)為先鋒物種，植被的生長可能為土壤微生物活動提供大量營養(yǎng)物質(zhì)和良好的生存環(huán)境，這可能解釋了BL 中微生物的多樣性略優(yōu)于其他植被復(fù)墾組。且稀有細(xì)菌和真菌類群的多樣性高于豐富類群，可能是因?yàn)橄∮形⑸镱惾菏俏⑸镏匾姆N子庫，可提供巨大的遺傳多樣性和功能多樣性儲備，是土壤微生物多樣性的主要貢獻(xiàn)者，這恰與以往的研究結(jié)果相吻合[38-39]。

3.3 礦區(qū)不同植被類型土壤豐富和稀有微生物群落網(wǎng)絡(luò)特性及穩(wěn)定性分析

微生物不是孤立地生活在土壤中，相互之間具有較為復(fù)雜的關(guān)系，且物種間共生或競爭模式在一定程度上可以影響土壤微生物群落的結(jié)構(gòu)和功能[29]。共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)結(jié)果中（表1 和表2，圖6），相較于對照組，植被恢復(fù)組增加了豐富和稀有細(xì)菌與真菌網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點(diǎn)數(shù)、總連接數(shù)、和整體網(wǎng)絡(luò)度等拓?fù)鋵傩?，說明植被復(fù)墾土壤中微生物網(wǎng)絡(luò)規(guī)模更為復(fù)雜，節(jié)點(diǎn)間的聯(lián)系更為緊密，使得群落間物質(zhì)、能量和信息的傳遞效率高，助力微生物群落更加有效地利用土壤養(yǎng)分。BL 在所有處理組中表現(xiàn)出較高的微生物網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性，這是因?yàn)樯臣Y能力強(qiáng)，可以固氮，加上根系分泌的有及酸類物質(zhì)可以改善根際土壤狀況，隨著根系的擴(kuò)展，微環(huán)境分散，為微生物生長提供了更多的生態(tài)位，也可能為其他微生物提供了更多生存機(jī)會，引發(fā)更為豐富和復(fù)雜的生態(tài)相互作用，而這種復(fù)雜性通常涉及更多微生物群落之間的物質(zhì)循環(huán)、能量流動和信息傳遞等方面，這一結(jié)果與YUAN 等報(bào)道土壤微生物多樣性增加改善網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性的研究相一致[40]。此外，結(jié)果顯示稀有類群比豐富類群具有更高的網(wǎng)絡(luò)度和中心緊密性（表1 和表2，圖6），這表明稀有細(xì)菌、真菌分類群間存在更為復(fù)雜的耦合關(guān)系，網(wǎng)絡(luò)復(fù)雜性的增加會提升網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性和應(yīng)對外界干擾的抵抗性，這對于維持生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定至關(guān)重要[41-42]。有理論研究認(rèn)為，網(wǎng)絡(luò)魯棒性可以通過“攻擊”邊緣或節(jié)點(diǎn)后的自然連接來衡量，攻擊下自然連接的抵抗力更大，表明網(wǎng)絡(luò)更穩(wěn)定[43]?；谧匀贿B通性的抗損傷性測試也表明（圖7），BL 提高了豐富細(xì)菌、豐富和稀有真菌網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)抵抗干擾的能力，說明沙棘恢復(fù)模式土壤微生物群落具有更高的穩(wěn)定性，而網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)結(jié)果中BL 網(wǎng)絡(luò)具有較長的平均路徑同樣說明其響應(yīng)環(huán)境變化的速度較慢，群落穩(wěn)定性較高，這可能是BL 中土壤養(yǎng)分含量較高，有利于微生物，尤其是真菌的新陳代謝和繁殖[32,41]，提高各類群在資源有限的礦區(qū)土壤環(huán)境中的種間競爭和協(xié)作關(guān)系，復(fù)雜的相互作用有助于形成更為健康的微生物區(qū)系，進(jìn)而提升微生物群落網(wǎng)絡(luò)的交互度和穩(wěn)定性，更好的保障了微生物生態(tài)功能發(fā)揮。

3.4 土壤微生物群落與環(huán)境因子的互作機(jī)制

研究結(jié)果表明，不同植被恢復(fù)類型下豐富和稀有類群受到不同土壤理化和酶活性的顯著影響（圖8，P< 0.05）。多種土壤環(huán)境因子（pH、SOM、AP、URE等）顯著影響植被恢復(fù)土壤中豐富群落分布，與Pan等[44]在草地土壤中得到的結(jié)果一致。豐富類群比稀有類群對環(huán)境因子敏感性更低，可能是因?yàn)樨S富類群在環(huán)境因子主導(dǎo)下的群落演替是定向收斂的，進(jìn)而占據(jù)土壤微生物群落的主導(dǎo)地位和更寬的生態(tài)位，使得它們在資源競爭方面更具優(yōu)勢，從而對礦區(qū)環(huán)境有較高的適應(yīng)性，在環(huán)境擾動中保證了優(yōu)勢地位，劉蕾等[5]報(bào)道豐富細(xì)菌是養(yǎng)分、能量代謝等基礎(chǔ)功能的主體參與者，這與研究結(jié)果恰好能對應(yīng)上。文中稀有群落亦是與pH、SOM、AP、BG 和ALP 等環(huán)境因子具有顯著相關(guān)性，這可能是因?yàn)橄∮腥郝渚哂休^高的多樣性，使其在面臨環(huán)境變化時(shí)做出快速響應(yīng)以適應(yīng)新環(huán)境，以拓寬其狹窄的生態(tài)位和提升其資源競爭能力。

4 結(jié) 論

1）礦區(qū)排土場植被復(fù)墾顯著地改善了土壤理化性質(zhì)和酶活性。其中BL 對土壤SOM、NN 和AP 積累有優(yōu)勢，并且顯著提高了土壤URE、LAP 和ALP酶活性。

2）不同植被恢復(fù)模式對土壤豐富和稀有細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)組成有顯著影響。豐富細(xì)菌中放線菌門最為豐富，且在CK 中占比最高，顯著高于其他植被恢復(fù)組（P< 0.05），裝甲菌門和藍(lán)藻門為共同優(yōu)勢稀有細(xì)菌門，子囊菌門和擔(dān)子菌門為真菌群落主導(dǎo)菌門，BL、CF、BF 和MF 組的羅茲菌門相對豐度占比最高。不同植被恢復(fù)類型豐富和稀有細(xì)菌、真菌群落Shannon 指數(shù)高于CK。

3）不同植被恢復(fù)類型提高了豐富和稀有細(xì)菌、真菌的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)，如節(jié)點(diǎn)數(shù)、連接數(shù)和網(wǎng)絡(luò)度等。共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析顯示，不同植被恢復(fù)類型的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)比CK 更加復(fù)雜，尤其是GL、BL、CF、BF 和MF 稀有細(xì)菌網(wǎng)絡(luò)，和BL、BF 和MF 稀有真菌網(wǎng)絡(luò)。自然連通性的幅度測試結(jié)果表明，所有植被恢復(fù)模式下的豐富和稀有細(xì)菌、真菌網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定性和受環(huán)境干擾抵抗力優(yōu)于CK，尤其BL 對土壤豐富細(xì)菌、豐富真菌和稀有真菌網(wǎng)絡(luò)的穩(wěn)定性提升度最高。

4）不同植被恢復(fù)類型下豐富和稀有類群均不同程度受到土壤理化和酶活性的顯著影響（P< 0.05）。CK 組僅有豐富細(xì)菌和稀有細(xì)菌受到ALP 和BG 酶活性影響。BL 恢復(fù)組中pH、SOM、AP、BG、URE、ALP 與富有和稀有細(xì)菌和真菌群落具有顯著相關(guān)性。