瘢痕疙瘩患者瘢痕組織Klotho、MYH9表達(dá)變化與術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性

杜全全，劉鵬超，韓福生，繆國東，馬志紅

1 承德醫(yī)學(xué)院研究生院，河北承德 067000；2 承德市中心醫(yī)院醫(yī)療美容科

瘢痕疙瘩是一種特殊類型的病理性瘢痕，主要病理表現(xiàn)為真皮組織成纖維細(xì)胞異常增殖、代謝過度活躍以及細(xì)胞外基質(zhì)異常堆積等［1］。瘢痕疙瘩臨床表現(xiàn)為瘙癢、疼痛，影響患者容貌，導(dǎo)致患者心理壓力增大。瘢痕疙瘩的治療方法有放射治療、化學(xué)治療、激素治療、手術(shù)治療等，單純手術(shù)治療后復(fù)發(fā)率較高，因此《中國瘢痕疙瘩臨床治療推薦指南》推薦以手術(shù)治療為主的綜合治療［2］。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路激活導(dǎo)致瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞過度增殖，是形成瘢痕疙瘩的主要原因之一［3］。Klotho是一種長壽相關(guān)蛋白，能夠拮抗Wnt信號通路，抑制腫瘤和纖維化疾病的進(jìn)展［4-5］。肌球蛋白重鏈9（MYH9）是機(jī)械傳導(dǎo)的重要信號分子，具有激活Wnt信號通路的作用，能夠促進(jìn)骨肉瘤、乳腺癌、胃癌等惡性腫瘤進(jìn)展［6-8］?；隈：鄹泶竦念惸[瘤特性［9］，本研究通過檢測Klotho 和MYH9 在瘢痕組織中的表達(dá)情況，探討其對瘢痕疙瘩術(shù)后復(fù)發(fā)的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020 年4 月—2022 年4 月在我院接受手術(shù)切除治療的耳部瘢痕疙瘩患者71 例（觀察組），其中男32 例、女39 例，年齡19～49（33.23 ± 3.82）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～60 歲；根據(jù)《中國整形外科學(xué)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診為瘢痕疙瘩；病灶處無感染；精神正常，無意識障礙；能夠配合治療并完成隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：有瘢痕疙瘩手術(shù)、放射或激素治療史；合并高血壓、糖尿病等可能影響瘢痕愈合的疾病；合并免疫系統(tǒng)功能障礙；妊娠或哺乳期女性。選擇同期在我院接受重瞼術(shù)切除正常上瞼皮膚者39例（對照組），其中男17例、女22例，年齡18～51（33.37 ± 3.93）歲。兩組性別、年齡具有可比性。本研究經(jīng)承德市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)（批號：CDCHLL2022-408），患者均知情同意并簽署同意書。

1.2 組織Klotho、MYH9 檢測方法 采用免疫組化染色法。取手術(shù)切除組織，制備石蠟切片，脫蠟后經(jīng)自來水洗滌，加入枸櫞酸緩沖液，微波加熱修復(fù)抗原，室溫冷卻后加入H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶。山羊血清室溫封閉30 min，分別加入Klotho、MYH9一抗（稀釋比例分別為1∶400、1∶200）4 ℃孵育過夜。PBS 清洗，加入二抗，室溫孵育30 min。DBA 染色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下拍照觀察。由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)生采用雙盲法進(jìn)行結(jié)果判斷。Klotho 染色呈棕黃色細(xì)顆粒狀，主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜及細(xì)胞間質(zhì)；MYH9染色呈棕黃色細(xì)顆粒狀，主要定位于細(xì)胞質(zhì)。染色強(qiáng)度評分：無色為0分，淡黃色為為1分，黃色為2 分，棕黃色或黃褐色為3 分。陽性細(xì)胞百分率評分：陽性細(xì)胞＜5%為0 分，5%～＜25%為1 分，25%～＜50%為2 分，≥50%為3 分。將兩項(xiàng)評分相乘計(jì)算免疫染色指數(shù)（SI），SI＜3分為陰性，SI≥3分為陽性。

1.3 觀察組術(shù)后隨訪方法 以瘢痕疙瘩患者手術(shù)日期為起點(diǎn)，術(shù)后12 個(gè)月進(jìn)行隨訪觀察，記錄復(fù)發(fā)情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料正態(tài)性檢驗(yàn)采用K-S 檢驗(yàn)（樣本量＞50）或S-W檢驗(yàn)（樣本量＜50），呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例（百分?jǐn)?shù)）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Kendall's tau-b 等級相關(guān)系數(shù)法，預(yù)后分析采用Kaplan-Meier 生存分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組組織Klotho、MYH9 表達(dá)比較 觀察組瘢痕組織Klotho 陽性27 例（38.03%）、陰性44 例（61.97%），MYH9 陽性48 例（67.61%）、陰性23 例（32.39%）；對照組正常上瞼皮膚組織Klotho 陽性25 例（64.11%）、陰性14 例（35.89%），MYH9 陽性16 例（41.03%）、陰性23 例（58.97%）。觀察組Klotho陽性表達(dá)率低于對照組，MYH9 陽性率高于對照組（P均＜0.01）。

2.2 瘢痕組織Klotho 與MYH9 表達(dá)的相關(guān)性 瘢痕組織Klotho 表達(dá)水平與MYH9 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.225，P=0.013）。

2.3 瘢痕組織Klotho、MYH9 不同表達(dá)水平患者的預(yù)后比較 71例瘢痕疙瘩患者中，術(shù)后12個(gè)月復(fù)發(fā)24 例、未復(fù)發(fā)47 例。Klotho 陽性患者復(fù)發(fā)3 例（12.50%）、復(fù)發(fā)時(shí)間（14.42 ± 0.33）個(gè)月，Klotho 陰性患者復(fù)發(fā)21 例（87.50%）、復(fù)發(fā)時(shí)間（10.53 ±0.51）個(gè)月，Klotho 陽性患者復(fù)發(fā)率較陰性患者降低，復(fù)發(fā)時(shí)間較陰性患者延長（P均＜0.01）。MYH9陽性患者復(fù)發(fā)23 例（95.83%）、復(fù)發(fā)時(shí)間（10.66 ±0.48）個(gè)月，MYH9陰性患者復(fù)發(fā)1例（4.17%）、復(fù)發(fā)時(shí)間（14.76 ± 0.23）個(gè)月，MYH9陽性患者復(fù)發(fā)率較陰性患者升高，復(fù)發(fā)時(shí)間較陰性患者縮短（P均＜0.01）。

3 討論

瘢痕疙瘩是一種成纖維細(xì)胞過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)異常堆積引起的疾病，其確切發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與Wnt/β-catenin 信號通路密切相關(guān)［3］。Wnt/β-catenin 信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的關(guān)鍵信號通路之一，在Wnt/β-catenin 信號通路中，信號傳導(dǎo)的核心是β-catenin 蛋白［12］。當(dāng)Wnt/β-catenin 信號通路關(guān)閉時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中形成β-catenin降解復(fù)合體，該復(fù)合體由軸蛋白、腺瘤性結(jié)腸息肉蛋白以及糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）和酪蛋白激酶1 組成，該復(fù)合體能特異性識別β-catenin，并將其磷酸化和泛素化，最終將其降解［13］。當(dāng)Wnt 信號作用于細(xì)胞表面特異性受體時(shí)，胞內(nèi)蓬亂蛋白被激活，活化的蓬亂蛋白將軸蛋白、GSK-3β 等募集到細(xì)胞膜中，從而減少細(xì)胞質(zhì)中的β-catenin 降解復(fù)合體，穩(wěn)定細(xì)胞質(zhì)中游離狀態(tài)的β-catenin 蛋白，并經(jīng)APC 轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活下游基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)細(xì)胞增殖、存活、分化和遷移基因表達(dá)，導(dǎo)致瘢痕疙瘩發(fā)生［14］。

Klotho 最初被認(rèn)為是一種長壽蛋白。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)Klotho 可延長小鼠壽命，而Klotho 缺陷小鼠則表現(xiàn)出早衰綜合征。隨后研究發(fā)現(xiàn)，Klotho不僅具有抗衰老作用，還有抗纖維化和抗腫瘤特性。Klotho 可以直接與Wnt 蛋白相互作用，阻斷其與Wnt 受體的結(jié)合和激活，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin 降解復(fù)合體增多，使β-catenin 通路被抑制，從而改善腎臟、腹膜等器官的纖維化［15-17］。TANG 等［18］報(bào)道，在人肝細(xì)胞癌中，Klotho可直接與Wnt結(jié)合，抑制Wnt/β-catenin 信號通路；Klotho 作為腫瘤抑制因子抑制肝癌細(xì)胞生長并促進(jìn)其凋亡，從而延長患者總體生存期。瘢痕疙瘩是一種纖維化疾病，同時(shí)具有類腫瘤特性，目前尚未發(fā)現(xiàn)Klotho 在瘢痕組織中表達(dá)情況的相關(guān)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，瘢痕組織中的Klotho 表達(dá)水平低于正常組織；瘢痕組織Klotho 陽性患者的術(shù)后復(fù)發(fā)率低于陰性患者，復(fù)發(fā)時(shí)間晚于陰性患者。這表明Klotho表達(dá)水平降低與瘢痕疙瘩術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

MYH9 是一種廣泛表達(dá)的細(xì)胞質(zhì)肌球蛋白，參與細(xì)胞黏附、遷移、分裂和形態(tài)維持。MYH9作為腫瘤促進(jìn)因子，通過與GSK3β 相互作用，使細(xì)胞質(zhì)β-catenin 降解復(fù)合體減少，細(xì)胞內(nèi)游離的β-catenin增多，激活β-catenin 通路，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。LIN 等［19］報(bào)道，MYH9可誘導(dǎo)GSK3β的泛素化和降解，增強(qiáng)肝細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移性、增殖性和索拉非尼耐藥性；靶向抑制MYH9 能夠提高肝細(xì)胞癌小鼠的存活率，并促進(jìn)肝癌細(xì)胞在體內(nèi)對索拉非尼的敏感性。LIU 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，MYH9 與GSK3β 相互作用，通過激活PI3K/AKT/c-Jun 通路誘導(dǎo)的泛素表達(dá)，促進(jìn)GSK3β 蛋白泛素化降解，抑制β-catenin 降解復(fù)合體的形成，從而激活β-catenin 表達(dá)及其在鼻咽癌細(xì)胞中的核易位。ZHANG等［21］報(bào)道，長鏈非編碼RNA MRPL23-AS1通過上調(diào)MYH9 激活Wnt/β-catenin 通路，促進(jìn)骨肉瘤發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，瘢痕組織中MYH9表達(dá)水平高于正常組織；瘢痕組織MYH9 陰性患者術(shù)后復(fù)發(fā)率低于陽性患者，復(fù)發(fā)時(shí)間晚于陽性患者。這表明MYH9表達(dá)水平升高與瘢痕疙瘩術(shù)后復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

Klotho 和MYH9通過影響Wnt/β-catenin 信號通路影響腫瘤的進(jìn)展，可作為多種腫瘤治療的關(guān)鍵靶點(diǎn)以及預(yù)測腫瘤復(fù)發(fā)情況的重要指標(biāo)。瘢痕疙瘩具有類腫瘤特性，Wnt/β-catenin 作為瘢痕疙瘩的主要發(fā)病機(jī)制之一，Klotho 和MYH9 很有可能通過作用于Wnt/β-catenin 通路影響瘢痕疙瘩。本研究相關(guān)性分析顯示，瘢痕組織中Klotho 和MYH9 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，Klotho 在瘢痕組織中呈陰性表達(dá)，MYH9在瘢痕疙瘩中呈陽性表達(dá)，這與Klotho 和MYH9 在腫瘤中的表達(dá)水平類似，表明Klotho 可能對人體起保護(hù)作用，抑制瘢痕疙瘩的形成；MYH9可能在人體腫瘤和瘢痕疙瘩形成方面起促進(jìn)作用，Klotho 和MYH9可能通過Wnt/β-catenin通路影響瘢痕疙瘩。

綜上所述，瘢痕疙瘩患者瘢痕組織中Klotho 表達(dá)水平升高、MYH9 表達(dá)水平降低，二者呈負(fù)相關(guān)；Klotho 能夠抑制瘢痕疙瘩形成，而MYH9 能夠促進(jìn)瘢痕疙瘩進(jìn)展，其作用機(jī)制可能與Wnt/β-catenin 信號通路有關(guān)；當(dāng)Klotho 陰性表達(dá)且MYH9 陽性表達(dá)時(shí)，提示瘢痕疙瘩術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)升高。