糜子GRF轉(zhuǎn)錄因子全基因組鑒定及在莖分生組織中的表達(dá)特征

韋恒，劉天鵬，何繼紅，董孔軍，任瑞玉，張磊，李亞偉，郝子義，楊天育,

研究報告

糜子GRF轉(zhuǎn)錄因子全基因組鑒定及在莖分生組織中的表達(dá)特征

韋恒1，劉天鵬2，何繼紅2，董孔軍2，任瑞玉2，張磊2，李亞偉2，郝子義1，楊天育1,2

1. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070 2. 甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，蘭州 730070

為了解糜子(L.) GRF (growth-regulating factor)基因家族成員全基因組信息及其在營養(yǎng)生長階段分生組織中的表達(dá)特征，本研究通過生物信息學(xué)和轉(zhuǎn)錄組測序相結(jié)合的方法，分析了糜子GRF基因家族成員的染色體分布、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、順式作用元件及其在營養(yǎng)器官莖分生組織中的表達(dá)特征。結(jié)果表明：糜子GRF基因家族包含21個成員，家族成員含有1～4個內(nèi)含子和2～5個外顯子，編碼蛋白長度為224～618個氨基酸，等電點為4.93～9.69；基因不均等分布于12條染色體上，除定位于細(xì)胞核和葉綠體外，其余均定位于細(xì)胞核。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，糜子21個基因分為4個亞族(A、B、C和D)。順式作用元件分析表明，在糜子基因上游2000 bp序列中，普遍存在數(shù)目不等、種類不同的參與光響應(yīng)、激素響應(yīng)、干旱誘導(dǎo)、低溫和其他環(huán)境脅迫響應(yīng)的順式作用元件。對糜子高稈品種隴糜12號和矮稈品種張778拔節(jié)期節(jié)間和節(jié)部分生組織分別取樣進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及qRT-PCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：、在矮稈品種張778中表達(dá)量顯著高于高稈品種隴糜12號，而、和的表達(dá)特征與之相反；和在張778節(jié)間分生組織中的表達(dá)量顯著高于隴糜12號，其余基因不表達(dá)或差異表達(dá)不顯著，表明、、、、、和等7個基因與糜子株高的形成相關(guān)。

糜子；基因；轉(zhuǎn)錄組；株高

植物轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors，TFs)是一種能識別并結(jié)合轉(zhuǎn)錄起始位點的上游啟動子序列，可以特異地與相應(yīng)DNA順式作用元件結(jié)合并調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子家族基因結(jié)構(gòu)復(fù)雜，既有單個家族基因，也有多個家族基因的參與[1,2]，對靶基因的調(diào)節(jié)作用可發(fā)生在植物生長發(fā)育的各個階段。

生長調(diào)節(jié)因子(growth-regulating factors，GRFs)廣泛存在于植物基因組中，是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控植物生長和發(fā)育過程，對植物形態(tài)建成和適應(yīng)環(huán)境具有重要調(diào)控作用。GRF的N-末端含有QLQ(Gln、Leu、Gln)和WRC(Trp、Arg、Cys)兩個保守結(jié)構(gòu)域，構(gòu)成GRF蛋白家族[3]，GRF蛋白的C端區(qū)域在長度和氨基酸序列上存在差異，但仍具有與轉(zhuǎn)錄因子相似的共同特征[4]。QLQ在所有真核生物中均有發(fā)現(xiàn)，具有介導(dǎo)蛋白-蛋白互作的功能，與GIF(GRF interacting factors)蛋白中的SNH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，促使GRF與GIF相互作用形成轉(zhuǎn)錄激活因子[5]，miR396可調(diào)節(jié)及基因的表達(dá)。WRC是植物特有的一個功能域，包含一個功能性的核定位信號和用于DNA結(jié)合的C3H型鋅指結(jié)構(gòu)，可與下游基因的啟動子區(qū)域相互作用從而調(diào)節(jié)其表達(dá)[6]。

GRFs作為植物中特有的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控植物生長發(fā)育過程。GRFs對植物葉、根、莖、花、種子初級生長的影響，主要通過對細(xì)胞的增生或膨脹來實現(xiàn)[7,8]；此外，GRFs在碳-氮代謝以及激素和非生物逆境應(yīng)答中也起關(guān)鍵作用[9]?；蜃畛踉谒?)中被鑒定，該基因?qū)λ厩o節(jié)伸長起作用，經(jīng)由赤霉素(gibberellin，GA)調(diào)控作用而增強表達(dá)[10]。迄今為止，對植物GRF全基因組的鑒定分析已有很多報道，其中在水稻中鑒定出12個成員[11]；擬南芥()中發(fā)現(xiàn)9個成員[12]，大多數(shù)基因參與擬南芥的生長發(fā)育，例如和的過表達(dá)會導(dǎo)致葉片和子葉增大，表明AtGRF蛋白參與調(diào)控葉片及子葉的細(xì)胞擴(kuò)增[13]。在玉米(L.)中發(fā)現(xiàn)21個成員[14]，基因?qū)λ氲纳L和發(fā)育起關(guān)鍵作用[15]，其中和的過表達(dá)推遲莖稈發(fā)育，但加速花序的生長。大豆()中有22個成員，多數(shù)基因在其生長發(fā)育過程中表達(dá)豐度較高，遮光處理后大豆葉片大多表達(dá)下調(diào)，其中在莖尖分生組織中表達(dá)量最高[16]。煙草(L.)中有25個成員，其中大部分主要在萌發(fā)種子中轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而在莖組織中的表達(dá)量最高[17]。另外，在柳枝稷(L.)[18]、甜瓜(L.)[19]、桃[(L.) Batsch.][20]、野草莓(L.)[21]和地菍(Lour.)[22]等植物生長發(fā)育過程中，基因均普遍表達(dá)，并且在多個生物過程中起著重要作用。

糜子(L)是禾本科黍?qū)僖荒晟荼咀魑?，起源于我國黃河流域，是種植歷史悠久的谷類作物之一[23]。與其他大多數(shù)谷物比較，糜子耐鹽、耐高溫、抗旱、水分利用效率高，是一種擁有廣譜抗性及抵抗非生物脅迫較強的作物[24]；而且糜子生育期短，種植成本低，因此在我國北方旱作農(nóng)業(yè)中占有重要地位[25]。倒伏是糜子生產(chǎn)中普遍存在的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量形成和籽粒品質(zhì)，因此挖掘其矮稈基因、創(chuàng)制矮化種質(zhì)、培育矮稈品種十分必要。植物莖桿的生長發(fā)育與基因的表達(dá)密切相關(guān)，但目前在糜子中尚未見報道，僅有SAMS[26]、MYB[27]、YABBY[28]、bZIP[29]和NAC[30]等基因家族被鑒定與分析。本文采用生物信息學(xué)方法并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序分析，對糜子GRF基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)鑒定和莖分生組織表達(dá)特征分析，旨在為深入研究GRF基因家族在糜子株高形態(tài)建成中的功能和分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

以擬南芥及水稻基因為參考，擬南芥蛋白數(shù)據(jù)來自tair網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org/)，水稻蛋白數(shù)據(jù)來自RGAP網(wǎng)站(http://rice.plantbio-logy. msu.edu/)，糜子全基因組基因注釋數(shù)據(jù)來自國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心(BIG搜索-cncb.ac.cn)。

1.2 糜子GRF基因家族鑒定

首先通過糜子、水稻、擬南芥全基因組序列構(gòu)建蛋白序列文庫，然后以擬南芥9個GRF蛋白(AT2G45480、AT4G24150、AT5G53660、AT2G22840、AT4G37740、AT3G52910、AT2G36400、AT2G06200和AT3G13960)和水稻12個GRF蛋白(OSGRF1、OSGRF2、OSGRF3、OSGRF4、OSGRF5、OSGRF6、OSGRF7、OSGRF8、OSGRF9、OSGRF10、OSGRF11和OSGRF12)為基礎(chǔ)序列，在構(gòu)建的蛋白序列文庫中進(jìn)行本地Blast搜索(-value<1e–10)，得到糜子GRF基因家族候選基因的初篩結(jié)果；再利用HMM模型對糜子GRF基因家族進(jìn)行鑒定，利用PFam網(wǎng)站(http://pfam.sanger.ac.uk/)查詢并下載GRF蛋白WRC(PF08879)與QLQ(PF08880)兩個特征結(jié)構(gòu)域的隱馬爾可夫模型，基于HMMER軟件在糜子全基因組范圍內(nèi)鑒定GRF基因家族成員[31]；最后將兩種方法的鑒定結(jié)果進(jìn)行比較并剔除重復(fù)項，利用CD-Search工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)對蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行驗證并保留有效值，從而得到糜子GRF基因家族。最后，利用在線軟件ExpasyProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)對糜子GRF蛋白的疏水性、氨基酸數(shù)、分子量等理化性質(zhì)進(jìn)行分析，同時通過PlantmPLoc網(wǎng)站(http://www.csbio.sjtu. edu.cn/cgi-bin/PlantmPLoc.cgi)查詢糜子GRF基因家族成員的亞細(xì)胞定位。

1.3 糜子GRF基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用MAFFT網(wǎng)站(https://www.ebi.ac.uk/Tools/ msa/mafft/)將糜子、擬南芥、水稻蛋白序列進(jìn)行多序列比對，將得到的數(shù)據(jù)采用MEGA7.0軟件中的NJ法繪制進(jìn)化樹，設(shè)Bootstrap值為1000，處理缺失數(shù)據(jù)，選用Partialdeletion、SiteCoverageCutoff(%)為50，其余參數(shù)使用默認(rèn)值[32]，得到GRF基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 糜子GRF基因家族染色體分布

根據(jù)鑒定出的基因蛋白名稱在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene)中確定其各家族成員所在的染色體位置及染色體長度。根據(jù)糜子基因組gff3注釋文件提取基因的染色體位置；通過上述數(shù)據(jù)在MG2C網(wǎng)站(http://mg2c.iask.in/mg2c_ v2.1/)上對糜子GRF基因家族成員的染色體分布進(jìn)行分析。

1.5 糜子GRF基因家族保守基序及基因結(jié)構(gòu)分析

通過MEME在線服務(wù)器(https://meme-suite.org/ meme/tools/meme)對糜子GRF基因家族成員進(jìn)行基序分析，預(yù)測基序數(shù)目設(shè)置為15，將生成的文件通過TBtools軟件進(jìn)行可視化處理。另外依據(jù)鑒定出的糜子基因序列在其GFF3文件中進(jìn)行處理篩選，將結(jié)果通過在線軟件GSDS(http://gsds.gao-lab.org/)完成基因結(jié)構(gòu)分析，并利用TBtools軟件進(jìn)行可視化處理。

1.6 糜子GRF基因家族順式作用元件分析

通過軟件Tbtools獲取糜子基因CDS序列上游2000 bp的啟動子區(qū)域序列，將結(jié)果導(dǎo)入PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)，鑒定糜子GRF基因家族順式作用元件，通過TBtools進(jìn)行可視化處理。

1.7 糜子GRF基因家族在其株高形態(tài)建成中的轉(zhuǎn)錄組及qRT-PCR分析

以甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供的隴糜12號[33]和張778[34]為材料，于2022年4月在甘肅省白銀市會寧縣試驗地種植，小區(qū)面積8 m2，行長5 m，行寬40 cm，株距8 cm，5葉期定苗；2022年7月取拔節(jié)期隴糜12號和張778植株，分別取節(jié)間和節(jié)部分生組織3個生物學(xué)重復(fù)樣，依托北京諾禾致源科技股份有限公司Illumina技術(shù)測序平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，采用FPKM (Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)作為衡量轉(zhuǎn)錄本或基因表達(dá)水平的指標(biāo)，利用TBtools軟件分析GRF基因家族在莖分生組織的表達(dá)特征，并利用SPSS軟件中成對樣本檢驗方法對fpkm值進(jìn)行顯著性分析。

糜子成熟期，取隴糜12號和張778各10株對株高、節(jié)間長度、穗長進(jìn)行室內(nèi)考種，計算平均值，利用GraphPad Prism繪圖，并利用SPSS軟件的成對樣本檢驗方法進(jìn)行顯著性分析。

糜子拔節(jié)期，對隴糜12號和張778主莖節(jié)間和節(jié)部分生組織再取3個生物學(xué)重復(fù)樣，參照TRizol RNA試劑盒方法提取RNA，根據(jù)PrimerScript RT Reagent Kit (寶生物工程(大連)有限公司)試劑盒提供的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。其中，用Primer3.0設(shè)計家族基因qRT-PCR引物，以基因作為內(nèi)參基因，引物序列見表1。qRT-PCR擴(kuò)增體系：2×UltraSYBR Mixture 10.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 7.0 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性1 min，94℃變性15 s，56℃退火15 s，65℃延伸10 s，40次循環(huán)，重復(fù)3次，最后采用2-??CT法進(jìn)行定量數(shù)據(jù)分析[35]，并用SPSS軟件中成對樣本檢驗方法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 糜子GRF基因家族成員、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及染色體分布

采用blastp、hummer和CDD方法進(jìn)行GRF基因家族成員鑒定，結(jié)果表明糜子GRF基因家族共有21個成員，依據(jù)基因ID號命名為(表2)。對糜子GRF基因家族成員的氨基酸數(shù)量、分子量(MW)和等電點(pI)等理化特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該家族蛋白含224()～ 618()個氨基酸，分子量為23,148.19 Da()～64,962.13 Da()，等電點為4.93()～9.69()，17個PmGRF蛋白等電點超過7.0，表明糜子大多數(shù)GRF蛋白為堿性蛋白，不穩(wěn)定指數(shù)在43.53～66.46之間，脂肪族氨基酸指數(shù)閾為47.23～70.34，親水性平均系數(shù)–0.866 ～ –0.228之間(表2)。糜子GRF基因家族成員幾乎都定位于細(xì)胞核，但的亞細(xì)胞定位出現(xiàn)在葉綠體上；～分布于染色體1、2、4、6、7、11、12、13、14、15、16和17，表現(xiàn)出較復(fù)雜的理化性質(zhì)和多樣分布特征。

表1 qRT-PCR的引物序列

表2 糜子GRF基因家族理化性質(zhì)及亞細(xì)胞定位信息

利用MEGA7.0軟件對鑒定出的21個糜子GRF蛋白序列與通過tair網(wǎng)站得到的9個擬南芥GRF蛋白序列以及通過RGAP網(wǎng)站得到的12個水稻GRF蛋白序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建(圖1)，并根據(jù)擬南芥GRF基因家族和水稻GRF基因家族的分類方法，將糜子21個GRF基因家族成員分為A、B、C和D共4個亞族，其中每個亞族分別有4、1、6和10個成員，A亞族包括、、和；B亞族中僅有；C亞族包括、、、、和；D亞族包括、、、、、、、、和。

染色體定位結(jié)果顯示(圖2)，糜子21個GRF基因家族成員在12條染色體上不均勻分布，每條染色體上分布1～3個基因，第4、第6和第12染色體上均有3個基因，第1、第7和第16都均有2個基因，其余的6條染色體上只有1個基因。此外，糜子基因在染色體上的分布位置比較固定，大多數(shù)基因都分布在染色體的端部。

2.2 糜子GRF基因家族蛋白基序、基因結(jié)構(gòu)及順式作用元件

基因蛋白基序分析結(jié)果顯示，糜子GRF基因家族檢測出15個保守結(jié)構(gòu)域，其中motif1和motif2分別以WRC和QLQ結(jié)構(gòu)域為特征，存在于所有PmGRF蛋白中(圖3)。在4個亞族中，A亞族的4個成員含有3種共有的蛋白基序類型，為motif1、motif2和motif11；B亞族的1個成員含有3種蛋白基序類型，為motif1、motif2和motif10；C亞族的6個成員共含有11種蛋白基序類型，分別為motif1、motif2、motif4、motif6、motif7、motif8、motif9、motif10、motif11、motif12和motif13，每個成員包含5～9種蛋白基序，其中PmGRF4和PmGRF1蛋白基序組成相似，PmGRF5和PmGRF2、PmGRF16和PmGRF21蛋白基序組成相同；D亞族的10個成員共含有10種蛋白基序類型，分別為motif1、motif2、motif3、motif4、motif5、motif8、motif9、motif10、motif14和motif15，每個成員包含5～8種蛋白基序，其中PmGRF15和PmGRF7、PmGRF10和PmGRF19、PmGRF11和PmGRF20以及PmGRF8、PmGRF14、PmGRF17和PmGRF18蛋白基序組成相同。

圖1 糜子GRF基因家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

不同物種的基因用不同顏色的圓點表示，其中紅色圓點表示糜子，黃色圓點表示水稻，綠色圓點表示擬南芥；A、B、C和D表示不同亞族，用不同顏色的弧線表示，其中藍(lán)色弧線表示A亞族，綠色弧線表示B亞族，紫色弧線表示C亞族，橙色弧線表示D亞族。

圖2 糜子GRF基因染色體分布

不同亞族成員用不同的顏色表示：藍(lán)色表示A亞族，綠色表示B亞族，紫色表示C亞族，橙色表示D亞族。

圖3 糜子GRF蛋白基序組成

A、B、C和D表示4個亞族。

基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，在糜子GRF基因家族中，、、和等4個基因外顯子數(shù)目最多(5)；外顯子數(shù)目最少(2)，且都屬于D亞族，同時D亞族包含的糜子GRF基因家族成員數(shù)量最多，而B亞族的基因家族成員最少。、、、、、、、和等9個基因外顯子數(shù)目為4個，、、、、、和等7個基因外顯子數(shù)目為3個(圖4)，說明GRF基因家族結(jié)構(gòu)較為保守，含有3個或4個外顯子是糜子GRF基因家族結(jié)構(gòu)的主要特征。另外，和等4個基因只含有3′-UTR(非翻譯區(qū))，和沒有非翻譯區(qū)，其余15個基因同時具有5′-UTR和3′-UTR。

糜子GRF基因家族上游2000 bp序列的啟動子作用元件預(yù)測結(jié)果表明，糜子GRF基因家族共有25種順式作用元件，按照功能可以劃分為植物生長發(fā)育、植物激素響應(yīng)和非生物或生物脅迫三大類(圖5)。在植物生長發(fā)育類中，CAT-box(19)與分生組織表達(dá)相關(guān)，Sp1(68)是光響應(yīng)順式作用元件占比較大，除在上不存在外，其他家族成員上均有；ACE(3)參與光響應(yīng)性，只在和上存在；G-box(96)是光響應(yīng)調(diào)控作用元件并且在順式作用元件中占比最大，每一個糜子GRF家族基因都含有；MRE(12)是參與光響應(yīng)性的MYB結(jié)合位點；GCN4_motif(1)胚乳表達(dá)順式作用元件僅存在于上；AACA_motif(2)胚乳特異性的陰性表達(dá)順式作用元件僅存在于和上；MSA-like(2)細(xì)胞周期調(diào)控元件只存在于和上；RY-element(3)是種子特異性調(diào)控元件，只存在于和上；motif I(1)是根特異性的順式調(diào)控元件，僅在上；circadian(6)是晝夜節(jié)律調(diào)控的元件。

在植物激素類中，TCA-element(12)為水楊酸響應(yīng)性元件；ABRE(91)為脫落酸響應(yīng)性元件，也是植物激素調(diào)節(jié)中占比最大的一類順式作用元件；P-box(14)和TATC-box(3)參與赤霉素響應(yīng)，僅存在于、和上；AuxRR-core(8)是生長素響應(yīng)調(diào)控元件。

在非生物或生物脅迫類中，ARE(29)是對厭氧誘導(dǎo)必不可少的順式調(diào)節(jié)元件，出現(xiàn)在76%的GRF基因家族成員；GC-motif(47)是參與缺氧特異性誘導(dǎo)的增強樣元件，85%的GRF基因家族成員都含有；CGTCA-motif(82)MeJA是響應(yīng)性調(diào)控元件，是該類順式作用元件中最大的；TC-rich repeats(8)為防御和應(yīng)激響應(yīng)性元件；MBS(23)是參與干旱誘導(dǎo)的MYB結(jié)合位點；LTR(7)是低溫響應(yīng)性元件；CCAAT- box(16)是MYBHv1的結(jié)合位點。

2.3 糜子GRF基因家族在莖分生組織中的表達(dá)特征

通過測量，隴糜12號、張778的平均株高分別為148.4 cm和59.2 cm，檢驗結(jié)果顯示隴糜12號株高極顯著高于張778(<0.01)(圖6，A和B)，并且兩品種株高的差異主要是各節(jié)間長度及穗長不同(圖6C)；隴糜12號莖部第1節(jié)間長至第5節(jié)間長都顯著高于張778，莖部第6和第7節(jié)間長、穗下節(jié)間長和穗長都極顯著高于張778(圖6D)。

利用轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，對糜子GRF家族基因莖分生組織表達(dá)特征進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，基因在隴糜12號和張778節(jié)間分生組織、節(jié)部分生組織中的表達(dá)量存在差異(圖7)?；蛟陔]糜12號和張778兩個品種節(jié)間和節(jié)部的分生組織中都有表達(dá)，但表達(dá)量有所不同，其中和的表達(dá)量最高，而、、和在兩個品種的節(jié)間和節(jié)部都未表達(dá)。此外，還發(fā)現(xiàn)、、、和在隴糜12號中不表達(dá)，但在張778中表達(dá)；而、、、、和在兩個品種中幾乎都不表達(dá)。在節(jié)間分生組織中，和在張778中的表達(dá)量顯著高于隴糜12號，和在張778中的表達(dá)量極顯著高于隴糜12號，、和在隴糜12號中的表達(dá)量顯著高于張778。在節(jié)部分生組織中，在張778中的表達(dá)量極顯著高于隴糜12號，在張778中的表達(dá)量顯著高于隴糜12號，在隴糜12號中的表達(dá)量極顯著高于張778，和在隴糜12號中的表達(dá)量顯著高于張778。由此推測，糜子GRF基因家族成員參與了糜子莖的生長發(fā)育。

圖4 糜子GRF基因家族結(jié)構(gòu)

A、B、C和D表示4個亞族。

圖5 糜子GRF基因家族順式作用元件

圖6 隴糜12號和張778株高特征及各節(jié)間、穗長長度比較

A：隴糜12號和張778株型；B：隴糜12號和張778的株高差異比較；C：隴糜12號和張778各節(jié)間長度、穗下節(jié)間長度和穗長表型特征。I：穗下節(jié)長；II：莖部第1節(jié)間；III：莖部第2節(jié)間；IV：莖部第3節(jié)間；V：莖部第4節(jié)間；VI：莖部第5節(jié)間；VII：莖部第6節(jié)間；VIII：莖部第7節(jié)間；D：隴糜12號和張778莖部各節(jié)間長度、穗下節(jié)間長度和穗長差異比較。*：<0.05，**：<0.01。

選取糜子GRF基因家族中轉(zhuǎn)錄組測序差異顯著的7個基因進(jìn)行qRT-PCR分析(圖8)。結(jié)果表明，這7個基因在兩個品種節(jié)間及莖節(jié)分生組織中的表達(dá)均存在顯著差異，和在張778節(jié)間和莖節(jié)的表達(dá)量都高于隴糜12號，而、和在隴糜12號節(jié)間和莖節(jié)的表達(dá)量均高于張778；和在張778節(jié)間的表達(dá)量高于隴糜12號，莖節(jié)的表達(dá)量低于隴糜12號，這與轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)結(jié)果基本相符，進(jìn)一步說明糜子GRF基因家族成員參與了糜子株高的形態(tài)建成。

圖7 隴糜12號和張778 GRF基因家族轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析

Li和Zi分別表示隴糜12號和張778節(jié)間分生組織；Ln和Zn分別表示隴糜12號和張778節(jié)部分生組織；*：<0.05，**：<0.01。

3 討論

GRF是植物特異性轉(zhuǎn)錄因子的一員，在植物生長發(fā)育中起著極其重要的作用，其功能在很多植物中得到解析。基因主要在植物分生組織中表達(dá)，在多個發(fā)育階段和脅迫下都發(fā)揮重要作用[36]。

本研究通過系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，糜子GRF基因家族中的21個成員被劃分為4個亞族。與的相似性高于，說明水稻和糜子在基因進(jìn)化中親緣關(guān)系更近；但在B亞族上只有擬南芥和糜子家族，表明糜子可能在進(jìn)化中發(fā)生了某種基因復(fù)制和變異，這與棉花(spp.)基因家族的研究結(jié)果相似[37]。在D亞族中，擬南芥與糜子GRF基因家族成員進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，其中的進(jìn)化距離最遠(yuǎn)，而且另一個擬南芥成員的自展值僅為29，說明該基因與糜子以及水稻的基因相似度較低，也體現(xiàn)出單子葉植物與雙子葉植物在進(jìn)化方式和行為模式上存在不同[18]。

從基因家族保守基序來看，糜子GRF基因家族21個成員都具有motif1和motif2這兩個基序，說明motif1和motif2兩個基序在PmGRF中高度保守，且在DNA結(jié)合中起關(guān)鍵作用，這與WRC結(jié)構(gòu)域上的基序組成密切相關(guān)[38]。糜子GRF基因家族成員中擁有最多外顯子數(shù)目(5)和最少外顯子數(shù)目(2)的基因都屬于D亞族，表明D亞族中的功能復(fù)雜且多樣。分析也發(fā)現(xiàn)，糜子GRF基因家族在同一個亞族上的基因長度以及內(nèi)含子、外顯子結(jié)構(gòu)相似，說明糜子GRF基因家族亞族間的功能差異較大。

圖8 GRF基因家族在隴糜12號和張778莖節(jié)間和節(jié)部分生組織中相對表達(dá)量

A～G：分別表示、、、、、和在隴糜12號和張778莖節(jié)間和節(jié)部分生組織中相對表達(dá)量。LiZi表示在莖節(jié)間分生組織中，隴糜12號較張778的相對表達(dá)量，LnZn表示在莖節(jié)分生組織中，隴糜12號較張778的相對表達(dá)量；*：<0.05，**：<0.01。

分析發(fā)現(xiàn)，糜子GRF基因家族共有25種順式作用元件，與分生組織表達(dá)、光響應(yīng)、胚乳表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控、植物激素響應(yīng)調(diào)節(jié)、厭氧誘導(dǎo)、防御應(yīng)激、干旱誘導(dǎo)和低溫響應(yīng)等相關(guān)。在眾多順式作用元件中，占比最大的是對光響應(yīng)起調(diào)控作用的G-box，其次是對脫落酸響應(yīng)起作用的ABRE，而后是誘導(dǎo)茉莉酸甲酯響應(yīng)植物化學(xué)防御的CGTCA- motif，最后是對光響應(yīng)起作用的Sp1，這表明糜子GRF家族大多數(shù)成員參與光響應(yīng)過程以及植物激素調(diào)節(jié)。對大白菜(L. ssp.)的研究也發(fā)現(xiàn)，基因在植物激素調(diào)節(jié)中起作用，例如用赤霉素處理的大白菜對12個基因表達(dá)量有明顯影響，在葉芽或幼葉中有較高表達(dá)量[39]。此外，大豆基因也在植物光合作用過程中參與表達(dá)調(diào)控，遮蔭脅迫下大豆葉片大小、葉面積和干鮮重顯著下降，且?guī)缀跛谢蛟谡谑a條件下表達(dá)量都下調(diào)[16]。對蓖麻() GRF基因家族的研究發(fā)現(xiàn)，與調(diào)控蓖麻株高的基因可能存在直接或間接關(guān)聯(lián)，利用外源GA對高稈和矮稈蓖麻嫩莖的處理發(fā)現(xiàn)，響應(yīng)外源GA應(yīng)答，在矮稈蓖麻表達(dá)量增加、高稈蓖麻表達(dá)量下降[7]。研究發(fā)現(xiàn)，小麥(L.)GRF家族成員在莖尖分生組織發(fā)育中起關(guān)鍵作用[8]。本研究對糜子GRF基因家族成員在其節(jié)間和節(jié)部表達(dá)特征分析也發(fā)現(xiàn)，各成員在莖節(jié)間和莖節(jié)部表達(dá)。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，糜子GRF基因家族成員在隴糜12號的莖節(jié)部表達(dá)量比節(jié)間高，而在張778中節(jié)部的表達(dá)量大多比節(jié)間高。研究也顯示，、和在兩個部位的分生組織上表達(dá)量最為明顯，說明糜子GRF基因家族成員參與莖器官的形態(tài)建成。糜子GRF基因家族成員在莖上部位的表達(dá)量總體表現(xiàn)為張788比隴糜12號高，但不同成員在不同部位的表達(dá)量差異較大。例如，和在張778節(jié)間和節(jié)部的表達(dá)量都顯著高于隴糜12號，而和在張778節(jié)間的表達(dá)量則顯著高于隴糜12號，但在節(jié)部的表達(dá)量差異不大。和在隴糜12號節(jié)間和節(jié)部的表達(dá)量均顯著高于張778，在隴糜12號節(jié)間和節(jié)部的表達(dá)量都顯著高于張778，這可能與糜子品種遺傳特性相關(guān)。隴糜12號株高介于163.1～188.5 cm之間[34]，為高桿品種；張778株高介于58.3～72.1 cm之間[35]，是典型的矮稈品種。GRF基因家族成員的上調(diào)表達(dá)可能對高稈糜子品種莖伸長生長起到了一定的抑制作用。

本研究鑒定出糜子GRF基因家族包含21個成員，分為4個亞族；GRF基因家族成員的理化性質(zhì)復(fù)雜、結(jié)構(gòu)多樣，在糜子高矮稈品種莖部分生組織中差異表達(dá)，其中、、、、、和可能參與了糜子莖器官的形態(tài)建成，研究結(jié)果為探究糜子基因在其株高形態(tài)建成中的功能和機(jī)理提供了科學(xué)依據(jù)。

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Genome-wide identification of GRF transcription factors and their expression profile in stem meristem of broomcorn millet (L.)

Heng Wei1, Tianpeng Liu2, Jihong He2, Kongjun Dong2, Ruiyu Ren2, Lei Zhang2, Yawei Li2, Ziyi Hao1, Tianyu Yang1,2

To understand the genome-wide information of the GRF family genes in broomcorn millet and their expression profile in the vegetative meristems, bioinformatic methods and transcriptome sequencing were used to analyze the characteristics, physical and chemical properties, phylogenetic relationship, chromosome distribution, gene structure,-acting elements and expression profile in stem meristem for the GRF family members. The results showed that the GRF gene family of millet contains 21 members, and thegene is unevenly distributed on 12 chromosomes. The lengths of PmGRF proteins vary from 224 to 618 amino acids, and the isoelectric points are between 4.93-9.69. Each member of the family has 1-4 introns and 2-5 exons. The proteinis localized in both the nucleus and chloroplast, and the rest PmGRF proteins are located in the nucleus. Phylogenetic analysis showed that the 21genes were divided into 4 subfamilies (A,B,C and D) in broomcorn millet. The analysis of-acting elements showed that there were many-acting elements involved in light response, hormone response, drought induction, low temperature response and other environmental stress responses in the 2000 bp sequence upstream of thegenes. Transcriptome sequencing and qRT-PCR analyses showed that the expression levels ofandin the dwarf variety Zhang778 were significantly higher than those of the tall variety Longmi12 in the internode and node meristems at the jointing stage, while the expression patterns of,andwere reverse. In addition, the expression levels ofandin the internode of Zhang778 were significantly higher than Longmi12. The othergenes were not or insignificantly expressed. These results indicated that seven genes,,,,,,and, were related to the formation of plant height in broomcorn millet.

L.;genes; transcriptome; plant height

2023-08-01;

2024-01-10;

2024-01-26

第二次青藏高原綜合科學(xué)考察研究項目(編號：2019QZKK0303)，甘肅省科技計劃項目(編號：22CX8NA028)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(編號：CARS-06-14.5-A8)資助[Supported by the Second Tibetan Plateau Scientific Expedition and Research Program (No.2019QZKK0303), the Science and Technology Planning Project of Gansu Province (No. 22CX8NA028) and the China Modern Agricultural Industrial Technology System Project (No.CARS-06-14.5-A8)]

韋恒，碩士研究生，專業(yè)方向：小雜糧遺傳育種。E-mail: 1715414764@qq.com

楊天育，碩士，研究員，研究方向：小雜糧遺傳育種與栽培。E-mail: 13519638111@163.com

10.16288/j.yczz.23-210

(責(zé)任編委: 宿振起)