TPI缺乏癥斑馬魚模型的構(gòu)建及分析

孫飄，李穎，劉帆，王璐,2

研究報告

TPI缺乏癥斑馬魚模型的構(gòu)建及分析

孫飄1，李穎1，劉帆1，王璐1,2

1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所)，實驗血液學(xué)國家重點實驗室，國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，細胞生態(tài)海河實驗室，天津 300020 2. 天津醫(yī)學(xué)健康研究院，天津 301600

磷酸丙糖異構(gòu)酶缺乏癥(triosephosphate isomerase deficiency，TPI DF)是一種嚴重的多系統(tǒng)退行性疾病，通常表現(xiàn)為溶血性貧血、神經(jīng)肌肉功能障礙和易感染，患者多于起病5年內(nèi)死亡。目前尚不清楚TPI DF的具體發(fā)病機制，缺乏有效的臨床治療方法。本研究選取TPI DF患者中最常見的突變位點E105D，構(gòu)建了表達人源性E105D(hE105D)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚()模型[Tg(:E105D-eGFP)]。功能分析表明，過表達E105D影響紅系及髓系細胞發(fā)育、導(dǎo)致神經(jīng)以及肌肉發(fā)育異常。綜上所述，本研究構(gòu)建了磷酸丙糖異構(gòu)酶缺乏癥的斑馬魚疾病模型，并能夠復(fù)現(xiàn)TPI DF患者的大部分臨床表型，該模型為后續(xù)研究TPI DF的發(fā)病機制及藥物篩選提供了新的實驗動物模型。

磷酸丙糖異構(gòu)酶缺乏癥；E105D；斑馬魚；疾病模型

磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase，TPI)是由位于染色體12p13的基因編碼的糖酵解酶[1]，在所有組織細胞中均有表達。兩個TPI單亞基形成同型二聚體，發(fā)揮催化酶活性，負責(zé)磷酸二羥丙酮(DHAP)和3-磷酸-甘油醛(G3P)之間的相互轉(zhuǎn)化[2]。糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑、糖異生和脂代謝等過程可以通過DHAP或G3P相互連接[3]。因此，TPI可以通過調(diào)節(jié)DHAP和G3P之間的相互轉(zhuǎn)化從而調(diào)節(jié)代謝走向[2,3]。

磷酸丙糖異構(gòu)酶缺乏癥(TPI deficiency，TPI DF)是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，于1965年首次發(fā)現(xiàn)[4]。TPI DF屬于最嚴重的糖酵解酶病，常發(fā)病于幼兒期[5]。該病的典型臨床特征為溶血性貧血、免疫功能下降，伴隨神經(jīng)系統(tǒng)損傷、進行性肌肉功能障礙等癥狀，大部分患者會在幼兒期死亡[6]。遺傳學(xué)證據(jù)表明基因突變會導(dǎo)致TPI DF[7]，目前約有19種突變位點被鑒定報道，主要包括錯義突變、無義突變和移碼突變等。其中，E105D是發(fā)病率最高的一種變異[8]，研究表明E105D會抑制TPI二聚體形成，降低蛋白的穩(wěn)定性，從而致病[9,10]。由于TPI DF的具體發(fā)病機制尚不清楚，目前臨床上缺乏有效的治療方法。

斑馬魚()是一種小型脊椎動物，具有獨特的生物學(xué)優(yōu)勢：繁殖發(fā)育快、體型小、實驗周期短，適合大規(guī)模藥物篩選；體外受精且胚胎透明，操作、觀察方便，適用于活體成像等。此外，斑馬魚的發(fā)育過程與哺乳動物相似，基因組和信號通路與人類高度保守。因此，斑馬魚已成為研究神經(jīng)、心血管、血液、骨骼肌肉和代謝等相關(guān)疾病的重要模式動物。

構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的疾病模型，不僅可以研究相關(guān)基因的功能，而且有助于探索相關(guān)疾病的發(fā)病機制，以及用于篩選新的藥物治療靶點。本研究利用轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將人源性E105D基因序列整合到斑馬魚基因組中，構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達人源性E105D的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系[Tg(:E105D-eGFP)]，該轉(zhuǎn)基因品系具有貧血、免疫功能低下、神經(jīng)肌肉發(fā)育異常等類似于人類TPI DF的表型，這為后續(xù)的分子機制研究和藥物篩選提供了動物模型。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEM-h質(zhì)粒(HG16150-G)購自北京義翹神州公司。promotereGFP質(zhì)粒為中國科學(xué)院動物研究所劉峰研究員團隊惠贈。實驗所使用的斑馬魚為Tübingen品系，成年斑馬魚用新鮮豐年蝦喂養(yǎng)，飼養(yǎng)在上海海圣斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)中，水溫28℃，pH值為7～7.5，電導(dǎo)率約為550 μS/cm。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

利用NEB官網(wǎng)中的NEBuilder Assembly Tool，設(shè)計h片段和promotereGFP載體的引物，分別記為F insert和R insert、F vector和R vector。以pGEM-h質(zhì)粒為模板，用F insert+R insert引物進行PCR，擴增得到含有同源臂的h片段。設(shè)計兩條包含hE105D點突變的反向互補配對引物，記為G315C F和G315C R。以pGEM-h質(zhì)粒為模板，分別用F insert+G315C R和G315C F+R insert這兩對引物進行第一輪PCR，將擴增得到的產(chǎn)物按照1∶1混合作為模板，利用F insert+R insert進行第二輪PCR，擴增得到含有同源臂的hE105D片段。同時以帶有promotereGFP序列的載體為模板，用F vector+R vector引物進行PCR擴增得到帶有同源臂的promotereGFP載體片段。最后利用DNA重組試劑盒(E2621L，美國New England Biolabs公司)將含有同源臂的h和hE105D片段分別與載體片段進行同源重組，得到:heGFP和:hE105DeGFP質(zhì)粒。引物序列見附表1。

1.3 整胚原位雜交

整胚原位雜交步驟按照參考文獻[11]進行。不同時期的斑馬魚胚胎，經(jīng)4%多聚甲醛固定過夜，于–20℃甲醇脫水至少2 h后梯度復(fù)水。根據(jù)不同的發(fā)育時期，用蛋白酶K(39450-01-6，美國Sigma-Aldrich公司)進行適度通透。清洗與預(yù)雜交后加入探針，于分子雜交爐65℃雜交過夜，用SSCT(3 mol/L NaCl、0.34 mol/L C6H5Na3O7·2H2O、0.1% Tween-20)，MABT (0.1 mol/L馬來酸、0.15 mol/L NaCl、0.1% Tween-20)依次漂洗，后加入封閉液孵育1 h，加入抗地高辛抗體(11093274910，美國Roche公司)，4℃過夜孵育。次日用MABT和BCL (0.1 mol/L Tris-HCl(pH 9.5)、0.1 mol/L NaCl、0.05 mol/L MgCl2、0.1% Tween-20)漂洗，最后加入BM Purple (11442074001，美國Roche公司)染色。特異性信號顯示后終止染色，固定后加入甘油于4℃保存。原位雜交實驗結(jié)果使用ImageJ軟件分析[12]。本研究檢測基因所需探針的引物序列見附表2。

1.4 蛋白免疫印跡

取約50枚受精后24小時(hours post fertilization，hpf)的斑馬魚胚胎，吸干水分后加入蛋白裂解液，研磨器研磨提取蛋白，離心后取上清，BCA法對蛋白進行定量。取40 μg變性后的蛋白在濃度為12% SDS-PAGE凝膠中電泳分離蛋白，然后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5% BSA孵育1 h后，加入TPI1抗體(AF8214，1∶1000，上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，4℃孵育過夜。次日TBST清洗3次后，加入兔源二抗(111-035-003，1∶10000，美國Jackson公司)孵育2 h，TBST清洗3次后加入顯影液，放入化學(xué)發(fā)光成像儀中進行顯影。

1.5 鬼筆環(huán)肽染色

收集所需斑馬魚胚胎后，4%多聚甲醛固定過夜，次日用乙醇脫水2 h后進行梯度復(fù)水，蛋白酶K通透后固定，PBST清洗4遍后加入鬼筆環(huán)肽染液(A12379，1∶400，美國Thermo Fisher Scientific公司)，室溫孵育1 h后終止染色，使用共聚焦顯微鏡拍照。

1.6 鄰聯(lián)茴香胺染色

收取斑馬魚胚胎，加入由2.7 mmol/L鄰聯(lián)茴香胺溶液(BNN2362，美國Sigma-Aldrich公司)、0.01 mol/L醋酸鈉溶液(pH4.5)和0.7%過氧化氫溶液混合而成的染液，室溫避光染色20 min。染色充分后，將染液吸出，雙蒸水清洗胚胎，用4%多聚甲醛固定后拍照。

1.7 吉姆薩染色

取20枚受精后2天(days post fertilization，dpf)斑馬魚胚胎，剪尾后收集外周血至PBS溶液中，并轉(zhuǎn)移適量混合液至載玻片上，離心后使用甲醇固定2 min，隨后加入吉姆薩染液(G1010，北京索萊寶生物科技有限公司)，室溫染色20 min。待染色結(jié)束，沖洗晾干后拍照。

1.8 流式分析

取Tg (:dsRed)斑馬魚胚胎放入培養(yǎng)皿中，加入0.5%胰酶消化至單細胞狀態(tài)，終止反應(yīng)后離心并使用PBS重懸，經(jīng)300目細胞濾網(wǎng)過濾得到單細胞懸液，用流式細胞儀(FACS canto II，美國BD Biosciences公司)進行分析。記錄紅細胞數(shù)目，根據(jù)使用的胚胎總數(shù)獲得每個胚胎的紅細胞數(shù)量。

1.9 TPI酶活性測定

TPI酶活性采用磷酸丙糖異構(gòu)酶試劑盒(G0824W，蘇州格銳思生物科技有限公司)進行測定。取斑馬魚胚胎，加入TPI提取液進行冰浴勻漿，離心后取上清液10 μL加入96孔板中，依據(jù)說明書加入相應(yīng)試劑，隨后使用酶標儀檢測450 nm處光吸收增加量，即可得到TPI酶活性大小。

1.10 統(tǒng)計方法

應(yīng)用GraphPad Prism8 軟件進行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計顯著性分析根據(jù)數(shù)據(jù)類型選擇檢驗方法：計數(shù)資料以百分率(%)表示，兩組之間比較采用卡方檢驗；計量資料數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準差表示，比較采用檢驗。<0.05時認為差異顯著。星號用來表示差異的顯著性，具體為：*<0.05，**<0.01，***<0.001，****<0.0001，n.s.表示無顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建過表達人源TPI1和TPI1E105D轉(zhuǎn)基因品系

2.1.1TPI1是致病性突變中最常見的變異

目前，已經(jīng)報道了約19種導(dǎo)致TPI DF的基因突變類型(圖1A)，其中一些突變會導(dǎo)致TPI功能域受損進而影響其功能(表1)。TPI DF存在基因型-表型相關(guān)性，特別是作用于TPI蛋白二聚化位點的突變會導(dǎo)致更加嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[13]。其中，E105D突變位置靠近二聚化位點(圖1B)，是最常見的致病突變，占比約為80%[14]。目前研究報道了21例患者存在E105D突變，包括12例純合突變和9例復(fù)合雜合突變。本研究總結(jié)了E105D突變患者的臨床癥狀(附表3)，發(fā)現(xiàn)E105D純合突變的患者均存在嚴重的TPI DF癥狀，包括溶血性貧血、進行性的神經(jīng)肌肉功能障礙、反復(fù)感染以及呼吸衰竭等；而E105D復(fù)合雜合突變的患者則會因另一突變類型的不同而存在表型差異：例如E105D/L29del2nt復(fù)合雜合突變患者存在嚴重溶血性貧血、反復(fù)肺部感染，而E105D/Q181P復(fù)合雜合突變患者則未發(fā)現(xiàn)溶血性貧血，主要存在神經(jīng)肌肉相關(guān)的癥狀等?；贓105D是臨床上最常見的突變位點，以及E105D純和突變的患者均具有嚴重的TPI DF癥狀，所以本研究選擇E105D構(gòu)建疾病模型。

表1 TPI DF突變位點信息

2.1.2:h-eGFP和:hE105D- eGFP質(zhì)粒構(gòu)建

基于pGEM-h質(zhì)粒，本研究首先通過PCR擴增獲得h片段，同時應(yīng)用定點突變方法得到hE105D片段，利用同源重組將兩個片段分別連接到promotereGFP質(zhì)粒中，獲得: h-eGFP質(zhì)粒以及:hE105D-eGFP質(zhì)粒(圖1C)。Sanger測序結(jié)果顯示，與: h-eGFP質(zhì)粒相比，:hE105D-eGFP質(zhì)粒中目標位置堿基位點被成功突變(c.315G>C) (圖 1D)。

2.1.3 Tg(:h-eGFP)和Tg(:hE105D- eGFP)品系的建立及驗證

將上述構(gòu)建的:h-eGFP質(zhì)粒和:hE105D-eGFP質(zhì)粒分別與體外合成的mRNA混合后注射至1-細胞期的斑馬魚胚胎中。在熒光顯微鏡下挑選帶有綠色熒光的F0斑馬魚胚胎培養(yǎng)至性成熟。將F0嵌合體斑馬魚與野生型斑馬魚雜交，所得胚胎中選取有綠色熒光的F1代斑馬魚進行培養(yǎng)，得到穩(wěn)定遺傳的Tg(:h-eGFP)和Tg(:hE105D-eGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚后代(圖2，A和B)。

為了進一步確定人源性基因h和hE105D的表達，本研究提取轉(zhuǎn)基因斑馬魚子代胚胎蛋白進行免疫印跡實驗。結(jié)果表明，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因胚胎中TPI1蛋白表達量明顯增加(圖2C)，說明Tg(:h-eGFP)和Tg(:hE105D-eGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎可以實現(xiàn)TPI1蛋白過表達。TPI酶活性測定結(jié)果表明，Tg(:h-eGFP) 轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎中TPI酶活性顯著增強，而Tg(:hE105D-eGFP)轉(zhuǎn)基因胚胎中TPI酶活性則顯著降低，說明E105D過表達可能降低斑馬魚體內(nèi)TPI酶活性(圖2D)。

圖1 Tol2-Ubi:hTPI1-eGFP和Tol2-Ubi:hTPI1E105D-eGFP質(zhì)粒構(gòu)建

A：基因示意圖（圖中標出了已報道的突變位點）；B：TPI1 E105在TPI1二聚體中所處位置；C：:hE105D-eGFP質(zhì)粒構(gòu)建流程；D：:h-eGFP和:hE105D-eGFP質(zhì)粒的測序鑒定結(jié)果。其中上圖為對照組野生型基因序列，下圖為帶有E105D突變位點的序列，紅色箭頭代表突變位點。

圖2 Tg(Ubi:hTPI1-eGFP)和Tg(Ubi:hTPI1E105D-eGFP)轉(zhuǎn)基因品系的構(gòu)建

A：Tg(:h-eGFP)和Tg(:hE105D-eGFP)轉(zhuǎn)基因品系的構(gòu)建流程。F0代表注射質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子mRNA后有綠色熒光的嵌合體，F(xiàn)1代表能夠穩(wěn)定遺傳的帶有綠色熒光的子代；B：24hpf轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎熒光圖片。比例尺為100 μm；C：野生型、Tg(:h-eGFP)和Tg(:hE105D-eGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎中TPI1蛋白表達情況；D：野生型組和轉(zhuǎn)基因組TPI酶活。數(shù)據(jù)展示為平均值±標準差，*表示差異的顯著性(***<0.001，****<0.0001)。值由雙尾檢驗計算得出。WT為Tg(:h-eGFP)簡寫，E105D為Tg(:hE105D-eGFP)簡寫。

2.2 過表達人源TPI1E105D導(dǎo)致神經(jīng)以及肌肉發(fā)育異常

TPI DF是一種進行性多系統(tǒng)退行性疾病，最終導(dǎo)致溶血性貧血、神經(jīng)肌肉功能障礙、感染易感性增加和死亡。為了研究過表達人源E105D的表型，本研究首先觀察了胚胎發(fā)育狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)和野生型相比，h或hE105D過表達并沒有導(dǎo)致明顯的發(fā)育異常(圖3A)。然后，通過整胚原位雜交實驗檢測神經(jīng)、肌肉特異性標記物，觀察hE105D對神經(jīng)、肌肉發(fā)育的影響。結(jié)果表明，與野生型和過表達h的胚胎相比，hE105D過表達胚胎中神經(jīng)特異性標記基因的表達明顯減少，表現(xiàn)為抑制性神經(jīng)元標記基因、興奮性神經(jīng)元標記基因以及泛神經(jīng)元標記基因的表達明顯降低(圖3B)，說明hE105D影響神經(jīng)發(fā)生。同時，本研究發(fā)現(xiàn)過表達hE105D導(dǎo)致肌肉特異性標記基因、以及的表達明顯降低(圖3C)。鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示，hE105D過表達后導(dǎo)致胚胎肌絲寬度明顯減小(圖3D)，進一步說明hE105D導(dǎo)致肌肉發(fā)育異常。

2.3 過表達人源TPI1E105D影響紅系及髓系細胞發(fā)育

貧血是TPI DF的早期癥狀之一。為了檢測本研究所構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因品系是否影響紅系發(fā)育，通過整胚原位雜交檢測了紅細胞相關(guān)標記基因的表達。結(jié)果顯示，相比于野生型組和hWT過表達組，過表達hE105D導(dǎo)致24 hpf胚胎中原始紅細胞生成關(guān)鍵因子、和的表達顯著性減弱(圖4A)；而在2 dpf時，以及胚胎期珠蛋白基因的表達水平則明顯增強(圖4B)。臨床研究報道，紅細胞減少會使氧張力下降、紅細胞生成素增加，進而促使紅系造血代償增加，并誘導(dǎo)未成熟的紅細胞提前從骨髓釋放[15]。因此，本研究推測2 dpf時紅系相關(guān)基因的表達升高可能是由于早期紅細胞減少后導(dǎo)致的紅系代償性增生。為了驗證這一推測，通過吉姆薩染色(Giemsa staining)檢測紅系的發(fā)育狀態(tài)，結(jié)果顯示過表達hE105D導(dǎo)致紅細胞的核質(zhì)比明顯增加(圖4C)，提示未成熟的紅細胞增多。這些結(jié)果說明過表達hE105D初期會導(dǎo)致原始紅細胞減少，隨后引起紅系代償性增生。

圖3 過表達人源TPI1E105D導(dǎo)致神經(jīng)以及肌肉發(fā)育異常

A：轉(zhuǎn)基因組斑馬魚明場下無明顯發(fā)育異常。比例尺為100 μm；B：36 hpf時野生型組和轉(zhuǎn)基因組神經(jīng)相關(guān)標記基因的整胚原位雜交結(jié)果。其中是抑制性神經(jīng)元的標記基因，是興奮性神經(jīng)元的標記基因，是泛神經(jīng)元的標記基因，比例尺為100 μm；右側(cè)為原位雜交胚胎數(shù)目統(tǒng)計結(jié)果，星號表示差異的顯著性(****<0.0001，n.s.表示無顯著性差異)，值由卡方檢驗計算得出；C：36 hpf時野生型組和轉(zhuǎn)基因組肌肉相關(guān)標記基因的整胚原位雜交結(jié)果。其中為體節(jié)發(fā)育相關(guān)的標記基因，為快肌纖維標記基因，為慢肌纖維標記基因，比例尺為100 μm；右側(cè)為原位雜交胚胎數(shù)目的統(tǒng)計結(jié)果，星號表示差異的顯著性(****<0.0001，n.s.表示無顯著性差異)，值由卡方檢驗計算得出；D：2 dpf時野生型組和轉(zhuǎn)基因組鬼筆環(huán)肽染色。白色大方框放大自白色小方框，比例尺為20 μm；右側(cè)為肌絲寬度統(tǒng)計結(jié)果，數(shù)據(jù)展示為平均值±標準差，星號表示差異的顯著性(****<0.0001，n.s.表示無顯著性差異)，值由雙尾檢驗計算得出。

在人體中，當紅細胞減少速度超過紅系代償性增生速度時，就會發(fā)生貧血[16]。為了驗證過表達hE105D是否最終會導(dǎo)致貧血表型，通過鄰聯(lián)茴香胺染色(-)檢測野生型組及轉(zhuǎn)基因品系胚胎中的血紅蛋白水平，結(jié)果顯示過表達hE105D胚胎中血紅蛋白的含量明顯減少(圖4D)；同時，通過流式細胞分析技術(shù)檢測了紅細胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)在hE105D過表達組中，:dsRed+紅細胞數(shù)量顯著減少(圖4E)。這些結(jié)果說明在3 dpf時，過表達hE105D組中紅細胞減少的速度已超過紅系代償性增生的速度，最終導(dǎo)致貧血。綜上，過表達hE105D可導(dǎo)致血紅蛋白含量減少和紅系細胞數(shù)量減少，類似于臨床上的貧血表型。

除了貧血外，TPI DF患者還存在免疫功能低下-和易感染的臨床癥狀。白細胞具有抵御有害微生物入侵的功能，比如單核巨噬細胞可以抵抗感染、吞噬異物，以及調(diào)節(jié)身體免疫力[17]；中性粒細胞是抵御急性細菌感染的主要防線，其減少會增加感染風(fēng)險[18]。為了初步了解hE105D是否導(dǎo)致免疫功能低下，本研究檢測了髓系相關(guān)標記基因的表達，并觀察單核巨噬細胞、中性粒細胞等白細胞的數(shù)量是否發(fā)生改變。分別是髓淋前體細胞、巨噬細胞和中性粒細胞的標記基因。在hE105D過表達的斑馬魚胚胎中，髓淋前體細胞、巨噬細胞以及中性粒細胞的數(shù)量均有所下降(圖4F)，提示hE105D過表達斑馬魚品系可能存在防御功能減弱，易于感染的表型。本研究同時檢測了淋巴細胞以及造血干祖細胞。、為淋巴細胞的標記基因，為造血干祖細胞的標記基因。結(jié)果顯示，與野生型和hWT過表達組相比，hE105D異常表達并沒有影響淋系以及造血干祖細胞的發(fā)育(圖4G)。

A：24 hpf時野生型組和轉(zhuǎn)基因組紅系生成相關(guān)基因的整胚原位雜交結(jié)果。下方為原位雜交統(tǒng)計結(jié)果；B：2 dpf時野生型組和轉(zhuǎn)基因組紅系相關(guān)基因的整胚原位雜交結(jié)果。下方為原位雜交統(tǒng)計結(jié)果。其中A和B小圖中為紅系前體的標記基因，為造血前體的標記基因，為胚胎期珠蛋白的標記基因，比例尺為100 μm；C：2 dpf時野生型組和轉(zhuǎn)基因組吉姆薩染色結(jié)果。比例尺為25 μm；下方為紅細胞核質(zhì)比統(tǒng)計結(jié)果，每組納入統(tǒng)計的紅細胞數(shù)目均大于150個；D：3 dpf時野生型組和轉(zhuǎn)基因組鄰聯(lián)茴香胺染色結(jié)果。比例尺為100 μm；右側(cè)為染色面積的統(tǒng)計結(jié)果；E：3 dpf時野生型組和轉(zhuǎn)基因組流式分析數(shù)據(jù)及統(tǒng)計圖；F：2 dpf時野生型組和轉(zhuǎn)基因組中髓系細胞相關(guān)基因的整胚原位雜交結(jié)果。其中為髓系淋系前體細胞的標記基因，為單核巨噬細胞的標記基因，為中性粒細胞的標記基因，比例尺為100 μm；下方為髓系細胞相關(guān)基因的整胚原位雜交統(tǒng)計結(jié)果；G：野生型組與轉(zhuǎn)基因組中、和的整胚原位雜交結(jié)果。其中、為淋巴細胞的標記基因，為造血干祖細胞的標記基因，比例尺為100 μm；下方為原位雜交統(tǒng)計結(jié)果。數(shù)據(jù)展示為平均值±標準差，星號表示差異的顯著性(*<0.05，**<0.01，***<0.001，****<0.0001，n.s.表示無顯著性差異)，值由雙尾檢驗計算得出。

3 討論

TPI DF是一種發(fā)生在兒童早期的罕見疾病，目前尚無有效的治療方法。人類致病性突變可能通過影響TPI的功能域?qū)е麓呋钚韵陆祷虻鞍追€(wěn)定性降低，從而引起TPI DF。但也有研究指出，在不影響TPI蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的情況下，其催化活性下降不足以引起TPI DF癥狀[19]，因此該疾病的確切病因仍存在爭議。通過對臨床數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，影響TPI二聚體形成的突變可能會引起更嚴重的癥狀[8]，E105D可以影響TPI二聚體形成，除此之外它還是目前已報道病例中最常見的突變類型，這使得這一突變類型成為構(gòu)建TPI DF疾病模型的首選位點。

有關(guān)TPI DF的動物模型已在小鼠()和果蠅()中建立，E105D/null小鼠存在神經(jīng)肌肉功能障礙、溶血性貧血和壽命顯著縮短的嚴重表型，是第一個具有神經(jīng)肌肉表型的TPI DF小鼠模型[20]。TPI果蠅表現(xiàn)出進行性運動障礙、神經(jīng)肌肉損傷和壽命縮短，研究人員通過TPI果蠅模型篩選鑒定了25種對TPI穩(wěn)定性至關(guān)重要的蛋白質(zhì)，這對于開發(fā)穩(wěn)定TPI蛋白的藥物用于治療TPI DF具有參考意義[21]。斑馬魚作為一種脊椎模式動物，相比于無脊椎動物果蠅，在基因組和發(fā)育模式上都與人類有更高的相似性；相較于小鼠，斑馬魚具有發(fā)育繁殖能力強、飼養(yǎng)成本低、能進行高通量藥物篩選的優(yōu)勢。因此，本研究構(gòu)建的過表達hE105D轉(zhuǎn)基因斑馬魚可以成為機制研究和藥物篩選的新的模型，豐富研究者對于動物疾病模型的選擇。

本研究借助轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建了穩(wěn)定表達人源性E105D的Tg(:hE105D-eGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚，該轉(zhuǎn)基因品系呈現(xiàn)出人類TPI DF相似的表型，主要表現(xiàn)為神經(jīng)肌肉發(fā)育異常，伴有貧血、白細胞減少的血液系統(tǒng)表型，但是具體的發(fā)病機制尚不清楚。檢測野生型組和轉(zhuǎn)基因組中的TPI酶活性發(fā)現(xiàn)，過表達人源性E105D會導(dǎo)致斑馬魚整體的TPI酶活性降低(圖2D)，這可能是Tg(:hE105D-eGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚存在TPI DF的原因之一。除此之外，TPI的異常二聚化被認為在TPI DF中起關(guān)鍵作用，有研究認為TPI DF可能是蛋白構(gòu)象疾病[5]。E105D突變靠近TPI二聚化結(jié)合位點，該突變會導(dǎo)致TPI活性二聚體形成障礙，而未形成二聚體的不穩(wěn)定TPI單體具有高凝聚力，過多的TPI單體錯誤折疊形成有毒蛋白聚集體，從而引發(fā)神經(jīng)功能障礙[5,6,22]，我們推測這可能是人源性E105D能在斑馬魚體內(nèi)存在磷酸丙糖異構(gòu)酶的前提下仍能引起神經(jīng)系統(tǒng)異常的可能原因。在檢測人源性E105D異常表達的血液表型時，本研究發(fā)現(xiàn)紅細胞以及髓系細胞均減少，而淋巴細胞的數(shù)量以及造血干祖細胞的產(chǎn)生并未明顯改變(圖4G)，廣泛表達的為何特異性的影響部分細胞類型？這可能是由于在不同細胞類型中，TPI的活性也存在差異[5]，如在紅細胞中，TPI突變蛋白可能與紅細胞膜有更強的相互作用，導(dǎo)致TPI的微區(qū)室化，這會進一步降低TPI缺陷細胞的TPI活性[23]。

總之，這些數(shù)據(jù)表明，本研究所構(gòu)建的Tg(:hE105D-eGFP)轉(zhuǎn)基因品系具有與人類TPI DF類似的表型--，包括神經(jīng)、-肌肉、血液系統(tǒng)在內(nèi)的多方面表型，因此該轉(zhuǎn)基因品系可以用于對TPI DF 進行多系統(tǒng)的機制研究，也為高通量藥物篩選提供了一種合適的動物模型。-

附加材料見文章電子版www.chinagene.cn。

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Generation and analysis of TPI deficiency zebrafish model

Piao Sun1, Ying Li1, Fan Liu1, Lu Wang1,2

Triosephosphate isomerase deficiency (TPI DF) is a severe multisystem degenerative disease, manifested clinically as hemolytic anemia, neuromuscular abnormalities, and susceptibility to infection, frequently leading to death within 5 years of onset. There is a lack of effective clinical treatment as the pathogenesis underlying TPI DF remains largely unknown. In this study, we generate a transgenic zebrafish line [Tg(:E105D-eGFP)] with the humanE105D(hE105D) mutation, which is the most recurrent mutation in TPI DF patients. Overexpression of hE105Daffects the development of erythroid and myeloid cells and leads to impaired neural and muscular development. In conclusion, we create a TPI DF zebrafish modelto recapitulate the majority clinical features of TPI DF patients, providing a new animal model for pathogenesis study and drug screening of TPI DF.-

triosephosphate isomerase deficiency (TPI DF);E105D; zebrafish;disease model

2023-12-22;

2024-02-05;

2024-02-22

國家自然科學(xué)基金項目(編號：32222027, 32170838)和天津市杰出青年項目(編號：21JCJQJC00120)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos.32222027, 32170838) and the Science Fund for Distinguished Young Scholars of Tianjin Municipality (No. 21JCJQJC00120)]

孫飄，碩士研究生，專業(yè)方向：干細胞與再生醫(yī)學(xué)。E-mail: sunpiao@ihcams.ac.cn

李穎，博士，研究方向：干細胞與再生醫(yī)學(xué)。E-mail: liying3@ihcams.ac.cn

孫飄和李穎同為第一作者。

王璐，博士，研究員，研究方向：發(fā)育生物學(xué)，干細胞與再生醫(yī)學(xué)。E-mail: wanglu1@ihcams.ac.cn

10.16288/j.yczz.23-316

(責(zé)任編委: 張文清)