通心絡(luò)膠囊對自發(fā)性高血壓大鼠心肌纖維化的干預(yù)作用*

羅瑋敏，龔彥

1 山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，山東省千佛山醫(yī)院 山東濟(jì)南 250014

2 山東省公共衛(wèi)生臨床中心影像中心 山東濟(jì)南 250102

高血壓病是最常見的慢性非傳染性疾病[1]。而繼發(fā)于高血壓病的心、腦、血管、腎臟等靶器官損傷，是高血壓病患者死亡的主要原因[2]。心肌纖維化是高血壓性心臟病最早出現(xiàn)的病理變化，是導(dǎo)致心室重塑與心臟舒縮功能異常的重要環(huán)節(jié)[3]。但是，臨床缺乏有效安全的抗心肌纖維化治療方法。中醫(yī)按癥狀表現(xiàn)可將心肌纖維化歸為“胸痹”“心痛”范疇[4]。因心肌纖維化在高血壓病緩慢進(jìn)展的病程中出現(xiàn)，與中醫(yī)學(xué)“久病入絡(luò)”與“久瘀入絡(luò)”認(rèn)識疾病證候演變規(guī)律有極大的相似性[5]。通心絡(luò)膠囊是通絡(luò)干預(yù)的代表方；在本研究中，我們觀察了通心絡(luò)膠囊對自發(fā)性高血壓大鼠模型心肌纖維化及促纖維化信號通路的影響。

資料與方法

1 材料

1.1 實驗動物 40只7周齡體質(zhì)量180～200 g的雄性SHR大鼠，購自北京維通利華公司（許可證號：SYXK（京）2022-0052）；10只7周齡體質(zhì)量180～200 g的雄性Wistar大鼠，購濟(jì)南朋悅實驗動物繁育有限公司（許可證號：SCXK（魯）2019-0003）。實驗藥物 通心絡(luò)膠囊（國藥準(zhǔn)字Z19980015）由河北石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供，由人參、水蛭、土鱉蟲、全蝎、蜈蚣、蟬蛻、赤芍、沉香、檀香、乳香、冰片等藥物組成。

1.2 實驗試劑 Masson三色染色試劑盒購自索萊寶科技有限公司。PCR引物由博尚生物技術(shù)有限公司合成。兔抗Smad3、p-Smad3、小鼠抗β-actin購自美國CST公司。兔抗CTGF購自英國Abcam公司。

2 方法

2.1 實驗分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將8周齡雄性SHR大鼠（約180～200 g） 共40只隨機(jī)分為通心絡(luò)不同劑量治療組即高劑量治療組（TXL-H組，10只）、中劑量治療組（TXL-M組，10只）和低劑量治療組（TXL-L組，10只）以及陽性對照組（SHR組，10只）。10只8周齡Wistar Kyoto大鼠作為正常對照組（WKY組）。

2.2 給藥方法 通心絡(luò)膠囊內(nèi)容物溶于生理鹽水配成溶液，按通心絡(luò)高、中、低劑量治療組，每天分別按每千克體質(zhì)量給予SHR1.5g、0.75g、0.38g通心絡(luò)超微粉溶液灌胃。正常對照組（WKY組）和陽性對照組（SHR組）每天給予等量生理鹽水灌胃。

2.3 動物取材方法 大鼠20周齡時結(jié)束實驗。所用大鼠給予腹腔注射0.1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉并處死，過程中盡量減少動物痛苦。用酒精棉球清潔胸部，然后用手術(shù)刀在左側(cè)胸部進(jìn)行側(cè)切，暴露出心臟，使用眼科鑷固定和穩(wěn)定大鼠的心臟。使用注射器在心尖處取血后，在左室心腔中注入生理鹽水沖洗，注意以保持心臟的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。沿著心臟的大動脈和靜脈進(jìn)行切割以便取材。取材后，將心臟放在適當(dāng)?shù)娜萜髦?，用液氮冷凍或?%多聚甲醛固定其組織結(jié)構(gòu)，為后續(xù)實驗做準(zhǔn)備。

2.4 組織病理學(xué)分析 將大鼠心臟標(biāo)本制備為石蠟切片，進(jìn)行心肌膠原的Masson染色，觀察比較各組大鼠心肌纖維化情況。

2.5 實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR 收集各組大鼠的心臟組織并提取總RNA，利用引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實時定量PCR檢測組織中α-SMA和TGFβ1 mRNA的表達(dá)水平。

2.6 蛋白印跡 定量稱取各組大鼠心臟組織勻漿并提取總蛋白，使用BCA法檢測蛋白濃度。通過電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色等過程，分別檢測Smad3、p-Smad3、CTGF等蛋白的表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用IBM SPSS Statistics 26.0軟件分析處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩組比較采用t檢驗；組間比較使用單因素方差分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組大鼠心肌纖維化病理改變

結(jié)果顯示，在WKY組中，心肌肌束間有少量的膠原纖維。與WKY組比較，SHR組藍(lán)色區(qū)域明顯擴(kuò)大，且心肌肌束間隙變大，在心肌絲田胞間質(zhì)中可見明顯的纖維化改變，且伴有嚴(yán)重的膠原沉積。與SHR組比較，通心絡(luò)高、中、低劑量組心肌纖維化程度明顯減輕，膠原含量減少。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果

2 各組大鼠心肌組織α-SMA和TGFβ1 mRNA表達(dá)的比較

與WKY組比較，SHR組的α-SMA和TGFβ1 mRNA表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與SHR組比較，通心絡(luò)高、中、低劑量組α-SMAmRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；而TGFβ1 mRNA表達(dá)雖有所降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

圖2 心肌組織α-SMA和TGFβ1 mRNA表達(dá)的比較

3 各組大鼠心肌組織磷酸化Smad3和CTGF蛋白表達(dá)的比較

與WKY組比較，SHR組及通心絡(luò)高、中、低劑量組的磷酸化Smad3和CTGF蛋白表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與SHR組比較，通心絡(luò)高、中、低劑量組磷酸化Smad3和CTGF蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。各劑量組間并沒有顯著差異（P＞0.05）。見圖3。

圖3 心肌組織磷酸化Smad3和CTGF蛋白表達(dá)的比較

討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，心肌纖維化是未經(jīng)良好控制的高血壓病在緩慢進(jìn)展的病程中常見的靶器官損傷表現(xiàn)之一[6]；按其癥狀表現(xiàn)可歸為中醫(yī)“胸痹”“心痛”的范疇。絡(luò)病學(xué)認(rèn)為，高血壓病的致病因素不能及時消除，病及于心，心絡(luò)虛滯或郁滯，主持營衛(wèi)氣血交互生化功能障礙，體用俱損，與繼發(fā)性產(chǎn)生的痰濁、瘀、毒相互影響，絡(luò)息而成積[7]。通絡(luò)干預(yù)，恢復(fù)“絡(luò)以通為用”，是切合高血壓病心肌纖維化病機(jī)的治法[8]。通心絡(luò)膠囊是吳以嶺院士創(chuàng)制的通絡(luò)干預(yù)的代表方劑。方中用人參補(bǔ)益心氣；用水蛭、土鱉蟲、全蝎、蜈蚣、蟬蛻等蟲藥透絡(luò)通經(jīng)、攻毒散結(jié)、消癥散積；赤芍、沉香、檀香、乳香、冰片疏通絡(luò)氣、辛宣止痛。組方體現(xiàn)出“搜、剔、疏、通”的用藥規(guī)律，共奏益氣活血、通絡(luò)行氣、消癥化積之效[9]。

基礎(chǔ)研究顯示，心肌纖維化導(dǎo)致的細(xì)胞外基質(zhì)累積與膠原纖維增加，是心室重塑和結(jié)構(gòu)破壞的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，進(jìn)而會引起心臟舒縮功能紊亂甚至心功能失代償[10-11]。SHR是研究人類原發(fā)性高血壓時運(yùn)用最廣泛的動物模型，在Pubmed上關(guān)于SHR的研究超過24000篇文章。SHR是在Wistar-Kyoto大鼠（WKY）遺傳背景基礎(chǔ)上挑選的血壓自然升高者經(jīng)數(shù)代繁育后形成的穩(wěn)定的高血壓大鼠；因為遺傳背景一致，所以WKY大鼠通常作為SHR的正常對照組[12]。與其他高血壓動物模型（如腎素轉(zhuǎn)基因大鼠或鹽敏感高血壓大鼠）比較，SHR與人類原發(fā)性高血壓具有高度相似的發(fā)病機(jī)制和緩慢進(jìn)展的自發(fā)性高血壓、逐漸加重的靶器官損傷等表現(xiàn)。在SHR心臟可以觀察到心肌膠原纖維大量沉積，肌束間間隙明顯增加[13]。本實驗顯示，通心絡(luò)膠囊顯著改善了SHR心肌纖維化。

心肌成纖維細(xì)胞主導(dǎo)心肌纖維化的發(fā)生與進(jìn)展[14]。持續(xù)高血壓引起的神經(jīng)-體液內(nèi)環(huán)境紊亂，會刺激心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化而具有分泌與遷移功能；α-SMA是心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的主要標(biāo)志物[15]。本研究顯示，自發(fā)性高血壓大鼠心肌α-SMA表達(dá)增加；通心絡(luò)膠囊抑制了自發(fā)性高血壓大鼠心肌中的α-SMA表達(dá)，提示通心絡(luò)膠囊減少了心肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

在心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān)的信號通路中，Smad3被認(rèn)為是是與高血壓相關(guān)的心臟纖維化和心肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的關(guān)鍵分子[16]。磷酸化Smad3蛋白由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核內(nèi)，對眾多與促進(jìn)了與心肌成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化和促纖維形成相關(guān)的細(xì)胞事件相關(guān)的靶基因表達(dá)[17-18]。本研究顯示，自發(fā)性高血壓大鼠心肌Smad3蛋白的磷酸化水平增加；通心絡(luò)膠囊抑制了自發(fā)性高血壓大鼠心肌Smad3蛋白的磷酸化水平。有研究顯示，Smad3的磷酸化存在TGFβ1依賴性與非依賴性兩條不同的促纖維化信號通路[19]。本實驗顯示，自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織TGFβ1水平升高；但是，通心絡(luò)膠囊未改變自發(fā)性高血壓大鼠心肌組織TGFβ1水平，提示通心絡(luò)抗心肌纖維化作用可能與TGFβ1無關(guān)。CTGF既是Smad3調(diào)控的下游靶基因，且具有廣泛的促纖維化作用[20]。自發(fā)性高血壓大鼠心肌CTGF表達(dá)水平升高；通心絡(luò)膠囊抑制了自發(fā)性高血壓大鼠心肌中CTGF表達(dá)。

綜上所述，通心絡(luò)膠囊通過抑制非TGFβ1依賴性Smad3/CTGF促纖維化通路，減少了心肌成纖維細(xì)胞主導(dǎo)的心肌纖維化；因此，通絡(luò)干預(yù)，恢復(fù)“絡(luò)以通為用”，切合高血壓病心肌纖維化病機(jī)，可以作為治療高血壓病心肌纖維化的基礎(chǔ)治療；亦提示在臨床治療中隨證化裁合理運(yùn)用通絡(luò)干預(yù)法，將有助于提高高血壓病心肌纖維化的治療效果。