基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接探討續(xù)斷治療骨質(zhì)疏松性骨折作用機(jī)制

阮家堅，劉金城，蔡東嶺，郭偉俊，魏其鵬，向振，董文暄，陳曉峰

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006；2. 廣州市番禺區(qū)中醫(yī)院骨傷三科，廣東 廣州 511400

骨質(zhì)疏松性骨折（OPF）是一種發(fā)生髖部、脊椎、肱骨及手腕等部位，以骨質(zhì)減少、骨密度下降和骨代謝異常為臨床表現(xiàn)的骨科疾病，嚴(yán)重影響患者日常生活。臨床上OPF 主要治療方案包括藥物療法、外科療法、物理療法，但這些治療方法存在不良反應(yīng)多、費(fèi)用價格高昂等問題，不能從根本上改善骨代謝、恢復(fù)成骨與破骨進(jìn)程的動態(tài)平衡[1-3]。續(xù)斷是中國傳統(tǒng)中藥，其功效是補(bǔ)益肝腎、強(qiáng)筋骨。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)續(xù)斷的主要成分是龍膽堿、β-谷甾醇等環(huán)烯醚萜類成分可通過增加成骨細(xì)胞的分化和活性，促進(jìn)骨形成，抑制破骨細(xì)胞的產(chǎn)生，降低破骨細(xì)胞活性與限制骨吸收來減少OPF 的發(fā)生[4-5]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討續(xù)斷治療OPF 作用機(jī)制，并通過分子對接驗(yàn)證其結(jié)果，為后續(xù)研究續(xù)斷治療OPF 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 續(xù)斷有效成分篩選和作用靶點(diǎn)獲取采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，https：//old.tcmsp-.com/tcmsp.php）獲取續(xù)斷的潛在活性成分，根據(jù)口服藥物生物利用度（OB）≥30%和類藥性指數(shù)（DL）≥0.18 為條件篩選續(xù)斷有效活性成分[6-7]。借助Uniprot（https：//www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫對續(xù)斷的活性成分進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理（將續(xù)斷活性成分的靶點(diǎn)名稱轉(zhuǎn)換成基因名稱）。

1.2 續(xù)斷治療OPF 的作用基因靶點(diǎn)篩選以“Osteoporotic fracture”為關(guān)鍵詞，在GeneCards（https：//www.genecards.org/）和OMIM（https：//www.omim.org/）數(shù)據(jù)庫中篩查OPF 相關(guān)的疾病靶點(diǎn)。利用Metascape數(shù)據(jù)庫（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）將OPF 疾病相關(guān)靶標(biāo)和續(xù)斷藥物相關(guān)靶標(biāo)進(jìn)行交集，得到續(xù)斷治療OPF 共有的靶點(diǎn)信息。方案流程圖見圖1。

圖1 續(xù)斷治療OPF 的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方案流程圖

1.3 建立藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)利用Cytoscape軟件（https：//cytoscape.org/）對獲得的藥物靶點(diǎn)和藥物-疾病靶點(diǎn)進(jìn)行可視化處理，構(gòu)建出一個包含疾病、藥物、成分以及藥物-疾病目標(biāo)在內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）構(gòu)建利用STRING平臺（https：//cn.string-db.org/）構(gòu)建續(xù)斷治療OPF 的蛋白互作用網(wǎng)絡(luò)，其篩選標(biāo)準(zhǔn)為種屬選擇人，最小互作分?jǐn)?shù)值設(shè)定為0.4。

1.5 續(xù)斷治療OPF 作用靶點(diǎn)基因本體論（GO）以及京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析通過Metascape（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）將中藥-疾病靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路和GO功能富集分析，以P值＜0.05 為篩查條件，根據(jù)靶標(biāo)的富集度，對生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）、分子功能（MF）和通路進(jìn)行降序篩選，最后數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化處理。

1.6 分子對接在TCMSP（https：//old.tcmsp-.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫中獲得1.1 中續(xù)斷的潛在活性成分小分子的3D 結(jié)構(gòu)的PDB 格式文件；在RSCBPDB（http：//www1.rcsb.org/）數(shù)據(jù)庫獲取1.4 中前5 位核心靶點(diǎn)的相互作用的蛋白PDB 結(jié)構(gòu)。運(yùn)用AutoDock 軟件（https：//autodock.scripps.edu/）和 PyMOL（https：//pymol.org/2/）平臺進(jìn)行分子對接，計算核心靶點(diǎn)和活性成分結(jié)合需要的最低結(jié)合能，獲得復(fù)合體的蛋白互作結(jié)構(gòu)，利用PyMOL 對結(jié)果進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果

2.1 續(xù)斷活性成分和作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果見表1。從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中共得到續(xù)斷的有效成分31 個，167 個相關(guān)靶點(diǎn)；通過OB 和DL 參數(shù)條件篩選出有效成分8 個，63 個有效靶點(diǎn)，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫對63 個有效靶點(diǎn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，共得到48 個作用靶點(diǎn)。

表1 續(xù)斷有效活性成分信息表

2.2 續(xù)斷治療OPF 中藥-疾病靶點(diǎn)和中藥-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建見圖2。通過Deepven網(wǎng)站的在線軟件，將3 046 個OPF 疾病相關(guān)的靶點(diǎn)與48 個續(xù)斷作用靶點(diǎn)進(jìn)行交叉比較，共得到29 個續(xù)斷治療OPF 的中藥靶點(diǎn)。中藥續(xù)斷主要通過5 種有效成分[龍膽堿、林生續(xù)斷苷Ⅲ_qt、（E，E）-3，5-二鄰咖啡酰奎寧酸、β-谷甾醇、谷甾醇]作用于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（CASP）3、β2-腎上腺素受體基因（ADRB2）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（BAX）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（BCL2）、CASP8 等29 個靶點(diǎn)。

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選結(jié)果見圖3。續(xù)斷治療OPF 的靶點(diǎn)為CASP3、ADRB2、BAX、BCL2、CASP8、雌激素受體2（ESR2）、CASP9、二肽基肽酶-4（DPP4）、糖原合成酶激酶3（GSK3β）、異常凝血酶原（F2）、有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）14、碳酸酐酶2（CA2）、5-羥色胺受體2A（HTR2A）和一氧化氮合酶2（NOS2）等。

2.4 GO 富集分析結(jié)果見圖4。經(jīng)過GO 的解析后發(fā)現(xiàn)，這批交集的目標(biāo)點(diǎn)主要包括參與細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物、激素、有機(jī)氮化物反應(yīng)等BP；細(xì)胞組分主要有膜筏、膜微域和突觸前膜的總體成分等CC；主要參與細(xì)胞凋亡執(zhí)行階段的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、內(nèi)肽酶活性、G 蛋白偶聯(lián)胺受體的活性、縮氨酸酶活性等MF。

圖4 續(xù)斷治療OPF 的GO 富集分析圖

2.5 KEGG 通路富集結(jié)果見圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，差異蛋白主要富集在癌癥通路、弓形體病、Kaposi 肉瘤相關(guān)的皰疹病毒感染、乙肝、大腸癌、小細(xì)胞肺癌脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、雌激素等有關(guān)的信號通路。

圖5 續(xù)斷治療OPF 的KEGG 通路富集分析圖

2.6 分子對接結(jié)果見圖6。選取PPI 網(wǎng)絡(luò)的前5 靶標(biāo)（CASP3、ADRB2、BAX、BCL2、CASP8）與續(xù)斷的主要活性物質(zhì)[龍膽堿、林生續(xù)斷苷Ⅲ_qt、（E，E）-3，5-二鄰咖啡?？鼘幩?、林生續(xù)斷苷Ⅲ、臭山羊堿、威巖仙皂苷A_qt、β-谷甾醇、谷甾醇]配體受體分子進(jìn)行分子對接驗(yàn)證。當(dāng)2 個實(shí)體間的結(jié)合能量越低，表明兩者之間相互作用的可能性越大。結(jié)果顯示，（E，E）-3，5-二鄰咖啡?？鼘幩?、龍膽堿、威巖仙皂苷A_qt 與ADRB2 的結(jié)合能分別是-10.7 KJ/mol、-8.5 KJ/mol、-8.5 KJ/mol；威巖仙皂苷A_qt 與CASP8結(jié)合能是-9.7 KJ/mol，β-谷甾醇與CASP3 的結(jié)合能是-9.9 KJ/mol。均小于-8.0 KJ/mol，具有較好的結(jié)合活性?？梢暬罴褬?gòu)象圖利用PyMOL 進(jìn)行構(gòu)圖。

圖6 分子對接結(jié)果圖

3 討論

中醫(yī)將OPF 屬于骨痹、骨痿、骨枯范疇，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究，認(rèn)為OPF 的發(fā)病機(jī)制是由于多虛多瘀導(dǎo)致，在治療上應(yīng)以補(bǔ)肝腎、續(xù)折傷、活血化瘀為主[8]。續(xù)斷有“續(xù)折接骨”的美譽(yù)，不僅可以補(bǔ)益肝腎，還可活血化瘀。本研究發(fā)現(xiàn)續(xù)斷的主要成分為環(huán)烯醚萜類，其中龍膽堿、β-谷甾醇等活性成分是治療OPF 的潛在核心成分。研究發(fā)現(xiàn)環(huán)烯醚萜類可以通過降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素（IL）-1、IL-6 的含量來提升骨小梁的密度和厚度，減少破骨細(xì)胞的活動性，改善骨代謝異常狀態(tài)，進(jìn)一步加快骨折的愈合[9]。陳文錦等[10]發(fā)現(xiàn)龍膽堿通過降低炎癥因子TNF-α、IL-6 的水平改善大鼠體內(nèi)炎癥，通過調(diào)控相關(guān)炎癥通路改善骨代謝異常狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇化合物能夠通過MAPK 信號通路降低TNF-α 含量，有效抑制破骨細(xì)胞的分化[11]；β-谷甾醇還可通過CASP3、ESR1、肉瘤病毒、MAPK1 和MAPK14 等關(guān)鍵靶點(diǎn)激活動脈粥樣硬化和MAPK 信號通路，減輕絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥癥狀[12]。

本研究表明，續(xù)斷的主要有效成分可通過多個靶點(diǎn)、多個信號通路來影響OPF 的發(fā)生，其中主要的基因靶點(diǎn)有CASP3、 ADRB2、 BAX、 BCL2、CASP8、ESR2、CASP9、DPP4、GSK3B、F2、MAPK14等，這些基因靶點(diǎn)可以通過影響細(xì)胞對有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng)、對荷爾蒙的反應(yīng)、細(xì)胞對有機(jī)氮化合物的反應(yīng)等BP 來控制OPF 的發(fā)生。CASP3 是主要的凋亡分子，研究發(fā)現(xiàn)靶向CASP3 能夠通過肌醇磷脂-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）途徑抑制凋亡蛋白酶活化因子-1（Apaf-1）、細(xì)胞色素C（Cytc）和BAX蛋白的促凋亡作用，從而恢復(fù)成骨細(xì)胞的活躍度和成骨分化[13]。研究發(fā)現(xiàn)ESR2 基因的遺傳變異與健康人的骨密度變化緊密聯(lián)系，ESR2 基因能夠通過對骨肉瘤、子宮內(nèi)膜癌、子宮肌瘤等癌癥相關(guān)染色體基因的調(diào)控從而影響OPF 的發(fā)生[14]。本研究中續(xù)斷治療OPF 涉及通路包括惡性腫瘤、弓形體病、卡波西肉瘤有關(guān)的皰疹病毒感染、乙肝、大腸癌以及小細(xì)胞肺癌所涉及的脂質(zhì)和動脈粥樣硬化等信號傳播通路等。前人實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肺癌能夠通過體內(nèi)環(huán)境激活破骨細(xì)胞并引導(dǎo)dickkopf 相關(guān)蛋白1（DKK1）和TNF-α抑制成骨細(xì)胞分化，使骨質(zhì)發(fā)生溶骨性病變而發(fā)生OPF[15-17]。調(diào)控TNF-α 能夠通過MAPK 通路調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的增殖分化，對骨重建過程進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)骨愈合，達(dá)到抗骨質(zhì)疏松的作用[18]。臨床發(fā)現(xiàn)乙肝患者能通過感染相關(guān)炎癥反應(yīng)，使患者鈣代謝紊亂，導(dǎo)致OPF 發(fā)生[17]。在骨質(zhì)疏松與動脈粥樣硬化的相關(guān)危險因素的研究中指出，年齡增長、高血糖、高血脂等危險因素可促進(jìn)人體骨質(zhì)疏松和動脈粥樣硬化發(fā)生，通過動脈粥樣硬化通路能夠調(diào)控骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中的轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞外基質(zhì)等[19]。

分子對接的結(jié)果顯示，（E，E）-3，5-二鄰咖啡?？鼘幩?、龍膽堿、威巖仙皂苷A_qt 與ADRB2、威巖仙皂苷A_qt 與CASP8、β-谷甾醇與CASP3 的結(jié)合能均小于-8 KJ/mol，表明這些化合物的結(jié)合活力較高并具備較強(qiáng)的穩(wěn)定性，驗(yàn)證了續(xù)斷的有效成分對于OPF 核心靶點(diǎn)之間存在有效親和力。CASP 是近年來發(fā)現(xiàn)的一組存在于胞質(zhì)溶膠中的結(jié)構(gòu)上相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶，常見成員有CASP3、CASP6、CASP8和CASP9 等，參與了細(xì)胞凋亡、分化和炎癥反應(yīng)過程，與癌癥等多種疾病的發(fā)病機(jī)制關(guān)系密切[20]。KEGG 通路富集發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要富集在與癌癥的相關(guān)通路，與分子對接結(jié)果相吻合。研究發(fā)現(xiàn)ADRB2能夠通過激活腺苷酸環(huán)化酶與G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合形成活性態(tài)三元復(fù)合物，促進(jìn)跨膜信號傳導(dǎo)[21]。這與GO 通路富集結(jié)果相呼應(yīng)，GO 富集通路顯示主要有膜筏、膜微域和突觸前膜3 個部分的總體成分參與主要的分子功能，促進(jìn)分子跨膜運(yùn)輸傳導(dǎo)。

綜上所述，續(xù)斷龍膽堿、林生續(xù)斷苷Ⅲ_qt、（E，E）-3，5-二鄰咖啡?？鼘幩帷ⅵ?谷甾醇、谷甾醇等成分能夠作用于CASP3、 ADRB2、 BAX、 BCL2、CASP8、ESR2 等靶點(diǎn)來調(diào)控癌癥、弓形體病、雌激素信號等信號通路減緩OPF 進(jìn)程。