綿羊支原體肺炎病原巢式PCR檢測方法的建立與應(yīng)用

楊華 周華倩 黃新 齊宇 余乾 張文喆 楊永林 侯扶琴

摘要? ［目的］建立一種診斷綿羊支原體肺炎病原的巢式PCR方法，確定肺炎支原體感染的靶器官。［方法］根據(jù)GenBank網(wǎng)站上登錄的綿羊支原體16S rRNA基因序列，設(shè)計(jì)并合成2對引物，以肺炎支原體菌株基因組DNA為模板，經(jīng)過PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，通過測序驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的正確性，建立了綿羊支原體肺炎病原的巢式PCR檢測方法，進(jìn)而應(yīng)用建立的方法完成臨床陽性病料肺臟、肺淋巴、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、皮膚、小腸和外周血檢測以及疑似樣本肺臟組織的檢測。［結(jié)果］建立的巢式PCR方法可擴(kuò)增出864 bp的特異性目的片段，肺臟和肺淋巴為綿羊肺炎支原體感染的靶器官，臨床樣本巢式PCR檢出率與支原體培養(yǎng)鑒定結(jié)果的符合率為100%。 ［結(jié)論］建立的綿羊支原體肺炎病原巢式PCR檢測方法可用于臨床樣本的實(shí)驗(yàn)室診斷。

關(guān)鍵詞? 綿羊肺炎支原體；巢式PCR；檢測方法

中圖分類號(hào)? S852.62? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A? 文章編號(hào)? 0517-6611（2024）04-0074-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.04.015

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Establishment and Application of Nested PCR Detection Method of Pathogens of Mycoplasma ovipneumonia

YANG Hua1，2，ZHOU Hua.qian1，2，HUANG Xin1 et al

（1.State Key Laboratory of Sheep Genetic Improvement and Healthy Production， Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Science， Shihezi， Xinjiang 832000;2.College of Animal Science and Technology， Shihezi University， Shihezi，Xinjiang 832000）

Abstract? ［Objective］In order to establish a nested polymerase chain reaction （PCR） for detecting the pathogens of Mycoplasma ovipneumonia， and determine the target organs of mycoplasma infection. ［Method］According to the 16S rRNA sequence of sheep mycoplasma in GenBank website， two pairs of specific primers were designed and synthesized. PCR reaction conditions were optimized by using the genome DNA of M. ovipneumonia as templates. The nested PCR products were verified by sequencing. A nested PCR method for detecting the pathogens of M. ovipneumonia was established. The established method was used to detect the? lung， lung lymph， heart， kidney， liver， spleen， skin， small intestine and peripheral blood of clinical positive samples， and the lung tissue from clinical suspected samples. ［Result］864 bp specific gene fragment was amplified by using nested PCR method. The lung and lung lymph of sheep were the target organs of mycoplasma infection. The coincidence rate between the detection rate of clinical samples by the nested PCR and pathogen culture and identification results was 100%. ［Conclusion］The nested PCR method for detection of M. ovipneumonia could be applied for the laboratory diagnosis of clinical samples.

Key words? Mycoplasma ovipneumonia；Nested PCR；Detection method

基金項(xiàng)目? 新疆維吾爾自治區(qū)肉毛兼用絨毛用羊品種選育提升計(jì)劃項(xiàng)目（2022XJRMY-03）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程專項(xiàng)（NCG202211）；新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)重大科技項(xiàng)目（2017AA006）；國家肉羊產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（CARS-38）。

作者簡介? 楊華（1977—），男，湖南長沙人，研究員，博士，從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。

收稿日期? 2023-03-05

羊支原體肺炎又稱羊傳染性胸膜肺炎，是危害世界養(yǎng)羊業(yè)的主要傳染病之一。綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是引起綿羊增生性、間質(zhì)性支原體肺炎的主要病原［1］，可通過空氣、飛沫、飲水等途徑傳播，具有高度接觸傳染性，主要臨床癥狀有喘氣、咳嗽、高熱、精神萎靡、漸進(jìn)性消瘦和慢性增生性間質(zhì)性肺炎等［2］。綿羊在每個(gè)季節(jié)均可感染肺炎支原體，但春季和冬季的感染率最高，1—3月齡羔羊最易感染發(fā)病，感染率髙達(dá)95.3%，病死率達(dá)到27.5%［1］。綿羊肺炎支原體的感染范圍十分廣泛，呈全世界范圍分布和流行，尤其在養(yǎng)羊業(yè)比重較大的不發(fā)達(dá)國家發(fā)病率較高，造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重影響?zhàn)B羊業(yè)的發(fā)展。

綿羊肺炎支原體主要引起肺臟的病變，還可以造成心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腦、淋巴結(jié)的損害。一般認(rèn)為綿羊肺炎支原體的靶器官是肺臟，臨床上主要表現(xiàn)為呼吸道癥狀，通過病原分離培養(yǎng)和PCR檢測，在包括肺臟在內(nèi)的多個(gè)器官中檢測到支原體。因此，研究人員認(rèn)為肺臟不是肺炎支原體感染的唯一靶器官［3］。目前，用于綿羊肺炎支原體常規(guī)診斷的方法包括病原分離培養(yǎng)鑒定、血清學(xué)檢測、免疫組織化學(xué)檢測、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測，近些年也出現(xiàn)了核酸探針和PCR等較為先進(jìn)的檢測方法［4］。但是，核酸探針需要放射性同位素標(biāo)記，不易普及。巢式PCR是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，以第1輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第2輪PCR擴(kuò)增，經(jīng)2輪PCR得到目的基因片段。與常規(guī)PCR相比，巢式PCR的特異性和靈敏度更高［5］。巢式PCR已被用于牛肺炎支原體［6］、豬肺炎支原體［7］、細(xì)胞支原體［8］和惡性瘧原蟲培養(yǎng)中支原體［9］的檢測，但未見到用于綿羊肺炎支原體的檢測報(bào)道。筆者針對綿羊支原體16S rRNA序列設(shè)計(jì)引物，建立肺炎支原體巢式PCR診斷方法，進(jìn)而檢測分析臨床病料肺臟和肺淋巴等9種組織中的肺炎支原體，明確肺炎支原體感染的靶器官，旨在為綿羊支原體感染的診斷、預(yù)防和流行病學(xué)調(diào)查提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 主要試劑。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DL2000 DNA Marker（天根生化科技（北京）有限公司）、Ex Taq酶（寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司）、瓊脂糖（Biowest公司）。

1.1.2? 主要儀器。高速離心機(jī)（生工生物工程（上海）股份有限公司，中國）；PCR儀（杭州朗基科學(xué)儀器有限公司，中國）；電泳儀（北京六一生物科技有限公司，中國）；凝膠成像儀（UVP公司，美國）。

1.1.3? 菌株。綿羊肺炎支原體菌株由省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定，-80 ℃下保存。

1.2? 方法

1.2.1? 臨床病料與病原分離。在試驗(yàn)區(qū)周邊4個(gè)羊場采集53只疑似肺炎支原體病死綿羊的肺臟組織，3只健康綿羊屠宰后取肺臟組織。另外，采集經(jīng)病原分離培養(yǎng)，確診感染肺炎支原體病死綿羊的肺臟、肺淋巴、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、皮膚、小腸和外周血，制備EDTA-Na2抗凝血。支原體分離培養(yǎng)參考文獻(xiàn)［10］的方法，以確定臨床病例感染的病原。

1.2.2? 引物設(shè)計(jì)。根據(jù) GenBank 網(wǎng)站發(fā)表的綿羊支原體16S rRNA基因序列（GenBank登錄號(hào)為EU265780.1），應(yīng)用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列見表1，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2.3? DNA提取。????? 應(yīng)用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取綿羊肺炎支原體菌株的基因組DNA，血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒提取外周血、肺淋巴、肺臟、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、皮膚、小腸組織的基因組DNA，以上均按照試劑盒說明書操作，提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4? PCR反應(yīng)體系和程序的建立。分別以提取的肺炎支原體菌株和陰性健康綿羊肺臟組織的基因組DNA為模板，進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件的優(yōu)化。優(yōu)化的第1輪擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系（25 μL）如下：10×Ex Taq buffer（含Mg2+）2.50 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）2.00 μL，ovi1F（10 μmol/L）0.50 μL，ovi1R（10 μmol/L）0.50 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL，去離子水18.25 μL，基因組DNA（50 ng/μL）1.00 μL。將上述溶液混合，按以下程序進(jìn)行PCR反應(yīng)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。第2輪擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系（25 μL）如下：取1 μL第1次擴(kuò)增產(chǎn)物，引物使用ovi2F和ovi2R，其余成分和使用量同第1次PCR。PCR反應(yīng)程序同第1次PCR。PCR反應(yīng)結(jié)束后，使用1.5%瓊脂糖凝膠對5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測。

1.2.5? PCR產(chǎn)物的測序驗(yàn)證。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化，與pMD18-T載體在25 ℃以下連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α 中，在氨芐抗性平板上篩選出陽性克隆，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定為陽性的克隆質(zhì)粒送交生工生物工程（上海）有限公司測序，序列用GenBank數(shù)據(jù)庫BLASTN在線比對分析。

1.2.6

肺炎支原體感染的靶器官鑒定。以確診感染肺炎支原體病死綿羊的肺淋巴、肺臟、心臟、腎臟、肝臟、脾臟、皮膚、小腸和外周血組織的基因組DNA為模板，應(yīng)用建立的巢式PCR方法檢測綿羊支原體，PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.7? 臨床樣本的檢測。以53份疑似肺炎支原體感染的臨床病例肺臟組織DNA為模板，應(yīng)用建立的巢式PCR方法檢測綿羊支原體肺炎病原。使用分離、鑒定的菌株作為對照，與每一個(gè)臨床樣本PCR檢測結(jié)果進(jìn)行對照，計(jì)算二者的符合率。

2? 結(jié)果與分析

2.1? PCR檢測結(jié)果? 第1輪和第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，第1輪巢式PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，陽性菌株、空白對照和陰性樣本的PCR產(chǎn)物均存在非特異性擴(kuò)增，陽性菌株存在944 bp的目的條帶。圖2為第2輪巢式PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。從圖2可以看出，陽性菌株擴(kuò)增出864 bp的特異性條帶，空白對照和陰性樣本的PCR產(chǎn)物未見特異性條帶。

2.2? PCR產(chǎn)物測序

PCR產(chǎn)物的克隆質(zhì)粒經(jīng)測序和序列分析，結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物序列與綿羊肺炎支原體16S核糖體RNA基因序列匹配（GenBank登錄號(hào)為EU265780.1），序列一致性為99%，證明擴(kuò)增產(chǎn)物為綿羊肺炎支原體的基因片段。

2.3 ?肺炎支原體感染的靶器官鑒定結(jié)果

應(yīng)用建立的巢式

PCR方法對確診感染肺炎支原體病死綿羊的肺臟等9個(gè)組織DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)，在肺臟和肺淋巴DNA中擴(kuò)增出目的基因，其他組織無目的基因擴(kuò)增（圖3），說明綿羊的肺臟和肺淋巴為肺炎支原體感染的靶器官。

2.4? 臨床樣品的檢測

應(yīng)用建立的巢式PCR方法對采集的53例疑似肺炎支原體感染的臨床病例肺臟組織DNA進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)A羊場的12個(gè)樣本沒有擴(kuò)增出目的基因，另3個(gè)羊場（B、C、D羊場）均擴(kuò)增出特異性目的基因片段，與支原體病原分離培養(yǎng)結(jié)果一致。由表2可知，二者的符合率達(dá)到100%，說明建立的巢式PCR方法可用于綿羊肺炎支原體感染的臨床樣本診斷。

3? 討論

綿羊肺炎支原體（MO）是羊群中常見的病原菌之一，其傳播范圍廣，感染的羊只病程呈慢性，康復(fù)后可長期帶菌，很難預(yù)防和控制，MO是嚴(yán)重危害養(yǎng)羊業(yè)的一種致病性支原體。環(huán)境誘因和其他病原因素使羊體免疫力下降，MO可趁勢侵入機(jī)體。感染MO的羔羊死亡率增加，羊只出現(xiàn)慢性營養(yǎng)消耗、生長緩慢、繁殖率下降、出欄延后、飼養(yǎng)成本大幅度提高，給養(yǎng)殖場帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失［11］。然而，感染MO的臨床癥狀和病理變化特征不明顯，且容易與巴氏桿菌、肺炎鏈球菌和化膿桿菌等混合感染或繼發(fā)感染，導(dǎo)致臨床診斷較難。檢測取樣中，病料極易受到其他支原體和細(xì)菌的污染，因此病料的選擇也非常關(guān)鍵。Mackay等［12］于1963年在英格蘭首次從綿羊體內(nèi)分離到MO，隨后在世界上不同國家和地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)。Manlove等［13］對美國農(nóng)業(yè)部國家健康檢測系統(tǒng)中453只綿羊進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)MO檢出率為88%。黃秀君等［14］對攀枝花不同地區(qū)山羊MO感染進(jìn)行血清學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示陽性率為46%。韓林梅等［15］對廣西6個(gè)主要牛、羊養(yǎng)殖場24 000份羊血清進(jìn)行MO抗體檢測，發(fā)現(xiàn)MO個(gè)體陽性率為40.66%，群體陽性率為77.14%。由此可見，MO在世界范圍內(nèi)廣泛流行，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，已成為制約養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的主要疾病之一。因此，有必要建立準(zhǔn)確的MO診斷方法，開展綿羊支原體肺炎病原的檢測，提高群體健康水平。

目前用于綿羊肺炎支原體的檢測方法主要有病原學(xué)檢測、免疫學(xué)檢測及分子生物學(xué)檢測。病原分離培養(yǎng)鑒定雖然是金標(biāo)準(zhǔn)，但因?yàn)镸O基因組小，自身合成能力有限，對培養(yǎng)條件要求苛刻，實(shí)際操作耗時(shí)、煩瑣［16］。血清學(xué)檢測相較于分離培養(yǎng)方法速度快、檢測量大、檢出率高，但該方法容易發(fā)生血清學(xué)交叉反應(yīng)，在實(shí)際應(yīng)用中存在一定的局限性［17］。免疫組化檢測中，由于MO感染引起的羊支原體肺炎為慢性傳染病，菌體量的積累相對較少，且支原體附著于細(xì)胞表面或者存在胞質(zhì)中，導(dǎo)致免疫組化檢測陽性信號(hào)不明顯，檢測結(jié)果不易判定［18］。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR已成為檢測綿羊肺炎支原體的一個(gè)重要方法。屈勇剛等［19］應(yīng)用綿羊臨床鼻拭子標(biāo)本建立了肺炎支原體PCR檢測方法。李媛等［20］應(yīng)用PCR方法檢測了湖羊肺臟病料中的支原體。馮旭飛等［21］應(yīng)用綿羊肺臟組織建立肺炎支原體和溶血性曼氏桿菌雙重 PCR檢測方法。儲(chǔ)岳峰等［22］建立了絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體的雙重PCR方法。筆者以GenBank網(wǎng)站上發(fā)表的綿羊支原體16S rRNA基因部分序列為參考序列，設(shè)計(jì)用于巢式PCR檢測的2對引物，經(jīng)過PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測綿羊支原體肺炎病原的巢式PCR方法，在肺炎支原體菌株中擴(kuò)增出864 bp特異性目的條帶，測序結(jié)果表明PCR產(chǎn)物為目的基因片段。臨床陽性綿羊9個(gè)組織樣品的巢式PCR結(jié)果證明肺炎支原體感染的靶器官為肺臟和肺淋巴，說明針對肺炎支原體的檢測，病料要采集肺臟或肺淋巴才能確保檢測的準(zhǔn)確性。該試驗(yàn)進(jìn)一步應(yīng)用建立的巢式PCR方法對4個(gè)羊場53份疑似樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果在6份經(jīng)支原體病原培養(yǎng)鑒定確診的肺臟組織中擴(kuò)增出目的條帶，其余均未擴(kuò)增出特異性條帶，且巢式PCR檢測結(jié)果與支原體分離培養(yǎng)的病原學(xué)診斷結(jié)果一致，說明所建立的巢式PCR方法作為綿羊肺炎支原體PCR檢測方法的補(bǔ)充，可用于支原體感染的臨床樣品診斷，為綿羊肺炎支原體病原的快速檢測及早期預(yù)防提供技術(shù)支持。

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