熱水浴提取結合UPLC-MS/MS同時測定枸杞中氯酸鹽和高氯酸鹽

楊春霞，劉 霞，王芳煥，牛 艷

（1.寧夏農產品質量標準與檢測技術研究所，寧夏 銀川 750002；2.銀川海關技術中心，寧夏 銀川 750000）

氯酸鹽和高氯酸鹽具有高穩(wěn)定、高溶解和快速遷移等特性[1]，可通過自然水系的遷移，給地表水、土壤、植物帶來污染，再通過食物鏈逐級富集于食品中。植物種植過程中使用的農藥、化肥、灌溉用水，食品加工過程中含氯消毒劑的使用以及包裝材料的遷移都可能成為植物氯酸鹽和高氯酸鹽的污染來源。經毒性測試表明，氯酸鹽和高氯酸鹽會對碘缺乏的年輕群體及碘缺乏癥母乳喂養(yǎng)的嬰兒甲狀腺功能有嚴重影響[2-3]。目前，我國對氯酸鹽、高氯酸鹽的監(jiān)測主要針對各類水體[4-7]、茶葉[8-11]、蔬菜水果[12-13]、肉類[13]、糧食作物[14-16]、牛奶及乳制品[17]、海產品[13]等，其質量濃度水平為0.3～115 μg/kg。歐盟食品科學委員會（European scientific committee on food，SCF）建議食品中的限量為0.05 mg/kg[18]。歐盟（European union，EU）委員會發(fā)布2020/685號條例規(guī)定了茶葉中高氯酸鹽的最大殘留量為0.75 mg/kg[19]，我國頒布的GB 5749—2022《生活飲用水衛(wèi)生標準》規(guī)定了氯酸鹽和高氯酸鹽的的限量分別為0.7 mg/L和0.07 mg/L[20]。我國尚未制定食品中氯酸鹽與高氯酸鹽的限值標準，因此對食品中該物質殘留量的監(jiān)測非常必要。

氯酸鹽、高氯酸鹽的檢測受基質影響大，要求檢測方法靈敏度更高，選擇性強。隨著高分辨色譜質譜聯用技術的發(fā)展，對于這種痕量離子含量分析測定已成功的解決了“未檢出”、“假陽性”等問題。氯酸鹽和高氯酸鹽的主要檢測方法以離子色譜（ion chromatography，IC）法[21]、離子色譜-串聯質譜（ionchromatography-tandemmassspectrometry，IC-MS/MS）法[22-25]和液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法[26-31]居多。其中IC-MS/MS和LC-MS/MS方法靈敏度高、干擾小，能夠在較短的時間內同時測定。我國現行的標準有BJS201706《食品中氯酸鹽和高氯酸鹽的測定》補充方法[32]和SN/T 4089—2015《進出口食品中高氯酸鹽的測定》[33]。兩個標準均不涵蓋枸杞產品，前處理方法也不完全適用于枸杞產品，且方法成本較高。枸杞作為寧夏特色產品，在種植、采收運輸、生產加工、包裝流通環(huán)節(jié)中都有可能被高氯酸鹽和氯酸鹽污染，由于標準的缺失，導致枸杞中氯酸鹽和高氯酸鹽檢測技術缺乏，風險監(jiān)測缺失，給枸杞質量安全帶來了隱患。

本研究建立了熱水浴提取-分散固相萃?。╠ispersive solid phase extraction，DSPE）凈化-超高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）測定枸杞干果、鮮果中氯酸鹽和高氯酸鹽含量的方法，以期解決無枸杞中氯酸鹽和高氯酸鹽檢測方法的問題，為枸杞質量安全控制提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞鮮果和枸杞干果：2021年銀川枸杞基地。

氯酸鈉標準溶液（1 000 mg/L）、高氯酸鈉標準溶液（1 000 mg/L）（純度均＞99%）：上海安譜璀世標準技術服務有限公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：德國Merck公司；甲酸、甲酸銨（均為色譜純）：美國Fisher Scientic公司；CNWBOND石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）、C18凈化材料（40～63μm）：ANPLELaboratoryTechnologies（Shanghai）Inc.。

1.2 儀器與設備

AB SCIEX QTRAP 5500超高效液相色譜-三重四級桿質譜聯用儀：美國應用生物系統(tǒng)公司；ZWF-110X50恒溫水浴振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LD5-2A型高速冷凍離心機：北京醫(yī)用離心機廠；KQ5200DE數控超聲波清洗器：昆山市超生儀器有限工司；VG3 S025渦旋混合器：德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

混合標準中間液：分別準確量取1 000 mg/L的氯酸鈉和高氯酸鈉標準溶液0.25 mL，于25 mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻，制成10.0 mg/L氯酸鹽、高氯酸鹽混合標準中間液，4 ℃保存。

混合標準工作溶液：分別準確量取混合標準中間液2.50 mL，用超純水稀釋至刻度，搖勻，制成1.0 mg/L的氯酸鹽、高氯酸鹽混合標準工作液，4 ℃保存。

1.3.2 樣品及樣品供試液的制備

枸杞鮮果、干果樣品于-18 ℃冰箱中冷凍保存，試驗時鮮樣用高速組織搗碎機打漿，干樣用高速萬能粉碎機（可加少量的液氮）粉碎，分別置于樣品瓶中，-18 ℃冷凍備用。

鮮果樣品供試液的制備：準確稱取5.00 g（精確至0.01 g）枸杞鮮果置于50 mL具塞離心管中，準確加入7 mL超純水，在60 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩30 min，冷卻后再準確加入13 mL甲醇，渦旋5 min，4 000 r/min常溫離心5 min，取1 mL上清液于15 mL離心管中（提前稱50 mg C18和20 mg GCB）渦旋凈化后離心5 min，過濾，上清液過0.20 μm微孔濾膜，用超高效液相色譜-質譜/質譜測定。

干果樣品供試液的制備：準確稱取2.50 g（精確至0.01 g）枸杞干果置于50 mL具塞離心管中，準確加入7 mL超純水，在60 ℃恒溫水浴振蕩器中振蕩30 min，冷卻后再準確加入13 mL甲醇，渦旋5 min，4 000 r/min常溫離心5 min，取1 mL上清液于15mL離心管中（提前稱150 mg C18和40 mg GCB）渦旋凈化后離心5 min，過濾，上清液過0.20 μm微孔濾膜，用液相色譜-質譜/質譜測定。

1.3.3 基質混合標準溶液

分別準確量取0、25 μL、50 μL、125 μL、200 μL、500 μL、700 μL、1 000 μL質量濃度為1.0 mg/L混合標準工作液，使用方法1.3.2處理的空白基質枸杞樣品溶液稀釋并定容至10.0 mL。氯酸鹽、高氯酸鹽系列基質標準溶液質量濃度依次為：0、2.50 ng/mL、5.00 ng/mL、12.5 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL、70.0 ng/mL、100 ng/mL。

1.3.4 超高效液相色譜-串聯質譜條件

液相色譜條件：AcclaimTRINITY P1復合離子交換柱（100 mm×2.1mm，3 μm）；流動相A為乙腈，B為20 mmol/L甲酸銨溶液。梯度洗脫：0.2～3.0 min，30%B線性降到10%B；3.0～7.0 min，10%B；7.0～8.0 min，10%B升至30%B；8.0～10.0 min，30%B；流速：0.4 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：2 μL。

三重四級桿質譜條件：電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源；確定氯酸鹽和高氯酸鹽母離子均為[M-H]-。再以各化合物的分子離子峰為母離子，進行子離子全掃描，得到碎片離子信息，選擇離子對83.0/67.0與85.0/69.0作為氯酸鹽的定性離子對，離子對83.0/67.0為定量離子對；99.0/83.0與101.0/85.0作為高氯酸鹽的定性離子對，99.0/83.0作為高氯酸鹽的定量離子對；離子源溫度：500 ℃；離子化電壓：-4 500 V；霧化氣壓力：20 psi；氣簾氣壓力：40 psi；去簇電壓DP均為-120 V，氯酸鹽、高氯酸鹽碰撞能量分別為-22 eV、-25 eV、-25 eV、-30 eV；多反應監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式采集數據。

定性、定量方法：采用保留時間和離子對定性；基質外標法定量。

1.3.5 提取條件優(yōu)化

分別考察不同提取溶劑（水-甲醇、水-乙腈）、提取劑水-甲醇體積（mL）（5+15、7+13、8+12、10+10）、提取溫度（20 ℃（室溫）、40℃、50℃、60℃）、提取時間（20min、30min、40min）、提取方式（超聲、渦旋、振蕩）、稱樣量（枸杞干果：1.0 g、1.5 g、2.0 g、2.5 g、3.0 g；枸杞鮮果：2.0 g、5.0 g、10.0 g）、凈化材料（枸杞干果：C18（50 mg、100 mg、150 mg、200 mg），GCB（20 mg、40 mg、60 mg、100 mg），C18 150 mg與GCB 40 mg組合；枸杞鮮果：C18（50 mg、70 mg、100 mg、200 mg），GCB（10 mg、20 mg、40 mg），C18 50 mg與GCB 20 mg組合）。

2 結果與分析

2.1 提取條件優(yōu)化

2.1.1 提取溶劑對提取效率的影響

枸杞屬于高糖、高蛋白的物質，甲醇和乙腈能較好地沉淀蛋白質去除基質干擾。氯酸鹽和高氯酸鹽在水中具有高溶解性，故試驗采用水和有機相相結合提取。結果表明，采用水-甲醇和水-乙腈作為提取劑，其回收率無顯著差別。水-乙腈提取沉淀蛋白效果好，但離心后提取液會出現分層，上下層氯酸鹽和高氯酸鹽含量有差別。采用水-甲醇提取，離心后提取液不存在分層現象，待測樣液中氯酸鹽和高氯酸鹽的峰型尖銳，基質干擾小，靈敏度高，氯酸鹽和高氯酸鹽的平均回收率分別為80.1%～91.3%、79.1%～89.3%。因此，確定水-甲醇作為最佳提取劑。

2.1.2 提取劑體積對提取效率的影響

由表1可知，提取劑為水+甲醇=7+13（mL）時氯酸鹽和高氯酸鹽回收率較高，分別為105.3%～108.1%、79.1%～89.3%。因此，確定最佳提取劑為水+甲醇體積為7+13（mL）。

表1 水+甲醇體積對氯酸根離子和高氯酸根離子回收率的影響Table 1 Effect of water and methanol volume on chlorate ion and perchlorate ion recovery rates

2.1.3 水浴溫度對提取效率的影響

由圖1可知，隨著水溶提取溫度在20～60 ℃范圍內的升高，氯酸鹽和高氯酸鹽的提取率增加，當水溶提取溫度達60 ℃時，枸杞干果、鮮果中氯酸鹽和高氯酸鹽的平均回收率達最高值，枸杞干果的平均回收率分別為106.7%和91.6%；枸杞鮮果的平均回收率分別為96.0%和102.0%，滿足分析要求。因此，確定最佳水溶提取溫度為60 ℃。

圖1 水浴溫度對枸杞干果（A）、鮮果（B）中氯酸鹽和高氯酸鹽回收率的影響Fig.1 Effect of water bath temperature on recovery rates of chlorate and perchlorate in dried (A) and fresh (B) wolfberry

2.1.4 水浴時間對提取效率的影響

由圖2可知，當水浴提取時間為20～30 min時，枸杞干果、鮮果中氯酸鹽和高氯酸鹽的提取率均增加；當水浴提取時間為30 min時，枸杞干果、鮮果中氯酸鹽和高氯酸鹽的平均回收率達最高值，枸杞干果中氯酸鹽和高氯酸鹽的平均回收率為92.6%和96.8%；枸杞鮮果中氯酸鹽和高氯酸鹽的平均回收率為93.3%和101.6%，滿足分析要求。因此，確定最佳水浴提取時間為30 min。

圖2 水浴時間對枸杞干果（A）、鮮果（B）中氯酸鹽和高氯酸鹽回收率的影響Fig.2 Effect of water bath time on recovery rates of chlorate and perchlorate in dried (A) and fresh (B) wolfberry

2.1.5 水浴提取后不同提取方式和提取時間對提取效率的影響

由圖3可知，與振蕩和超聲提取相比，渦旋提取時間較短。渦旋提取5 min時，枸杞干果中氯酸鹽和高氯酸鹽的平均回收率為86.1%和93.8%；鮮果中氯酸鹽和高氯酸鹽的平均回收率為88.8%和87.4%。超聲提取時，隨著提取時間增加，提取率先增加后下降，提取20 min時，干果和鮮果的氯酸鹽和高氯酸鹽提取率最高。振蕩提取時，隨提取時間增加，提取率先增加后降低，在提取時間為20 min時，干果和鮮果中氯酸鹽和高氯酸鹽的提取效率最大。綜合考慮，實驗選取渦旋提取5 min。

圖3 超聲（A）、渦旋（B）、振蕩（C）提取時間對枸杞干果、鮮果中氯酸鹽和高氯酸鹽回收率的影響Fig.3 Effect of ultrasound (A), vortex (B), and oscillation (C) on recovery rates of chlorate and perchlorate in dried and fresh wolfberry

2.1.6 稱樣量對提取效率的影響

當干果稱樣量在1.0～3.0 g范圍內增加時，回收率先增加后降低，當稱樣量為2.5 g時，氯酸鹽和高氯酸鹽的平均回收率最高，為96.1%和101.0%；鮮果稱樣量為2.0～10.0 g時，回收率增加，鮮果稱樣量為5.0 g時，氯酸鹽和高氯酸鹽的回收率最高，分別達到93.0%和102.0%；當鮮果稱樣量為10.0 g時，樣品量太大導致回收率下降，且樣品雜質對色譜柱有一定污染。因此，確定干果稱樣量為2.5 g、鮮果為5.0 g。

2.1.7 凈化材料對提取效率的影響

枸杞含糖量高、色素重，基質干擾嚴重。凈化材料C18可以吸附脂質和糖類等非極性雜質[34]，GCB作為弱極性或非極性吸附劑，能有效去除色素、類胡蘿卜素和甾醇等非極性化合物[35]。不同凈化材料用量對枸杞干果、鮮果中氯酸鹽和高氯酸鹽提取率的影響見圖4。

圖4 不同凈化材料用量對枸杞干果（A）、鮮果（B）中氯酸鹽和高氯酸鹽回收率的影響Fig.4 Effect of different purification materials dosages on recovery rates of chlorate and perchlorate in dried (A) and fresh (B) wolfberry

由圖4A可知，以枸杞干果為樣品，當C18添加量為50～200 mg時，氯酸鹽回收率為52.8%～98.8%，高氯酸鹽的回收率為51.2%～85.1%，當C18添加量為150 mg時，氯酸鹽和高氯酸鹽的回收率最高，分別為98.8%和85.1%。當GCB添加量為20～100 mg時，氯酸鹽回收率為68.4%～94.4%，高氯酸鹽的回收率為51.8%～89.5%，當GCB添加量為40 mg時，氯酸鹽和高氯酸鹽的回收率最高，分別為94.4%和89.5%。選擇C18和GCB聯合使用作為凈化吸附劑，當C18 150 mg和GCB 40 mg組合使用時，氯酸鹽和高氯酸鹽的回收率達到最大值，分別為98.3%、89.5%，滿足分析要求。

由圖4B可知，以枸杞鮮果為樣品，當C18添加量為50～200 mg時，兩種離子的回收率隨C18用量增加而降低，C18用量分別為70 mg和50 mg時，氯酸鹽、高氯酸鹽的回收率最高，兩種離子回收率分別為85.5%和98.8%及86.0%和95.0%，綜合考慮，確定C18添加量為50 mg。當GCB添加量為10～40 mg時，兩種離子回收率呈先增加后降低的趨勢，當GCB添加量為20 mg時，氯酸鹽和高氯酸鹽回收率最高，分別為86.9%和100.3%。選擇C18和GCB聯合使用作為凈化吸附劑，組合使用C18 50 mg和GCB 20 mg組合使用效果好，氯酸鹽和高氯酸鹽的回收率達到最大值，分別為96.0%、102.0%，滿足分析要求。

2.2 方法學考察

2.2.1 工作曲線、檢出限和定量限

配制兩種離子的基質混合標準溶液，以定量離子峰面積（y）為縱坐標，基質標準溶液質量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程，結果見表2。

表2 氯酸鹽和高氯酸鹽線性回歸方程、線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Linear regression equation, linear range, detection limit and quantitation limit of chlorate and perchlorate

由表2可知，氯酸鹽在1.0～100.0 ng/mL范圍內線性關系良好，回歸方程分別為y=20 462x-207 568和y=775 017x-858 500，相關系數r為0.998 9和0.999 2；高氯酸鹽在0.5～100.0 ng/mL范圍內線性良好，回歸方程分別為y=1 932 166x-1 753 250和y=4 995 940x-4 748 357，相關系數r為0.998 4和0.999 0。方法檢出限（limitof detection，LOD）（S/N=3）、定量限（limit of quantitation，LOQ）通過加標回收的方法確定。當試樣量為2.5 g，定容體積20.0 mL時，干果中氯酸鹽的檢出限為1.0 μg/kg、定量限為10.0 μg/kg；高氯酸鹽的檢出限為0.5 μg/kg、定量限為5.0 μg/kg。鮮果稱樣量為5.0 g，定容體積20.0 mL時，氯酸鹽的檢出限為1.0 μg/kg，定量限10.0 μg/kg；高氯酸鹽的檢出限為0.5 μg/kg，定量限為5.0 μg/kg。

2.2.2 回收率及精密度試驗

干果中分別加入20 μg/kg、50 μg/kg、100 μg/kg氯酸鹽和高氯酸鹽標準溶液，鮮果中分別加入10 μg/kg、40 μg/kg、50 μg/kg的氯酸鹽和高氯酸鹽標準溶液，按本方法條件測定并計算回收率，平行制備樣品溶液5份，檢測結果見表3。由表3可知，在不同添加濃度下，干果中氯酸鹽和高氯酸鹽平均回收率分別為89.9%、93.4%、90.5%和76.8%、93.6%、91.4%，精密度實驗結果的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）值分別小于11.0%和12.0%；鮮果中氯酸鹽和高氯酸鹽平均回收率分別為73.8%、94.9%、85.8%和61.2%、90.5%、88.9%，精密度實驗結果的RSD值分別小于11.0%和17.0%。方法準確度和精密度良好。與BJS201706補充方法[32]比較，該方法專屬性強、準確度高、節(jié)約成本。

表3 加標回收率及精密度試驗結果Table 3 Results of adding standard recovery and precision tests

2.2.3 實際樣品測定

采用本方法測定了10 份基地采摘的枸杞樣品，樣品中檢出了一定量的氯酸鹽和高氯酸鹽，其含量分別為0～6.45 μg/kg和2.70～10.2 μg/kg，與歐盟規(guī)定的干茶葉中高氯酸鹽限量值0.75 mg/kg相比[19]不存在超限量值問題。

3 結論

本研究建立了枸杞干果、鮮果中氯酸鹽和高氯酸鹽含量測定的熱水浴提取-分散固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯質譜分析方法。結果表明，枸杞干果、鮮果中氯酸鹽和高氯酸鹽均分別在1.0～100.0 ng/mL、0.5～100.0 ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數r分別為0.998 9和0.999 2及0.998 4和0.999 0。氯酸鹽檢出限（LOD）為1.0 μg/kg、定量限（LOQ）為10.0 μg/kg；高氯酸鹽LOD為0.5 μg/kg、LOQ為5.0 μg/kg。干果中氯酸鹽和高氯酸鹽平均加標回收率分別為89.9%～93.4%和76.8%～93.6%，相對標準偏差（RSD）分別小于11.0%和12.0%；鮮果中氯酸鹽和高氯酸鹽平均加標回收率分別為73.8%～94.9%和61.2%～90.5%，RSD分別小于11.0%和17.0%。方法用于實際樣品檢測，氯酸鹽和高氯酸鹽均檢出。方法準確度和精密度良好，可滿足枸杞中氯酸鹽和高氯酸鹽含量測定要求。研究結果在枸杞氯酸鹽、高氯酸鹽風險監(jiān)測中可廣泛應用，有望為枸杞質量安全控制提供技術保障。