魚油重復(fù)給藥毒性試驗研究

程顯淯 張友庭 江芝 孫軍

魚油是一種從多脂魚類中提取的油脂，具有較好的營養(yǎng)保健等功能，在我國屬于新資源食品。作為新型膳食補充劑，魚油在備受追捧的同時，其安全性也一直存在爭議。本試驗對大鼠重復(fù)給樣毒性試驗進行研究，對魚油的安全性進行再評價。

一、材料與儀器

1.供試品。魚油，1kg/瓶，批號：133082009001，人體推薦食用量為1.2g/日/人，山東新華制藥股份有限公司提供。根據(jù)該公司提供的質(zhì)檢報告，魚油中DHA（二十二碳六烯酸）含量為85%、EPA（二十碳五烯酸）含量為0.829%。

2.實驗動物。SPF級SD大鼠（購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司），實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0013，飼養(yǎng)于湖南普瑞瑪藥物研究中心有限公司屏障環(huán)境，實驗動物使用許可證號：SYXK（湘）2020-0015。

3.主要儀器。ME2002E/02型電子天平（梅特勒-托利多儀器）；ME1002E型電子天平（梅特勒-托利多儀器）；AR223CN型電子天平（奧豪斯儀器）；KJ8B型直接檢眼鏡（蘇州工業(yè)園康捷醫(yī)療器械有限公司）；BC-5000Vet獸用五分類血液細(xì)胞分析儀（深圳邁瑞公司）；LABOSPECT003型自動生化分析儀（日本日立公司）。

二、實驗與方法

1.90天經(jīng)口毒性試驗方法。（1）劑量設(shè)置及分組給藥。選用檢疫合格的SD大鼠120只（SPF級），雌雄各半，按性別、體重隨機分為溶媒對照組和魚油低、中、高劑量組，溶媒對照組衛(wèi)星組、魚油高劑量組衛(wèi)星組，每組20只。受試樣品低、中、高劑量分別設(shè)為2.0、3.0、4.6g/kg·bw（分別相當(dāng)于成人推薦食用量的100、150、230倍）。每周稱重，并根據(jù)體重變化調(diào)整給樣量，溶媒對照組給予同等劑量花生油，每天一次，連續(xù)給樣90d。

（2）一般臨床觀察。實驗期間所有動物單籠飼養(yǎng)，自由攝食攝水，每天觀察并記錄大鼠的一般表現(xiàn)、行為活動和生長情況等。

（3）體重及攝食量。所有大鼠前4周每周稱重兩次，4周后每周及解剖前稱重一次，每周加食兩次，記錄加食量、撒食量和剩余量，計算每周平均攝食量及總攝食量，根據(jù)體重增重計算大鼠每周及總食物利用率。食物利用率（%）=體重增重（g）/攝食量（g）×100%。

（4）眼科檢查。在試驗前及試驗中期、末期、恢復(fù)期，分別對溶媒對照組及受試樣品高劑量組大鼠進行眼科檢查（角膜、晶狀體、球結(jié)膜、虹膜）。

（5）尿液、血液學(xué)及血液生化學(xué)指標(biāo)。采集尿液，觀察尿液外觀，用尿液分析儀測定尿液相關(guān)指標(biāo)；禁食不禁水16h后采用異氟烷吸入麻醉，腹主動脈采血，采用BC-5000Vet獸用五分類血液細(xì)胞分析儀測定血液學(xué)、凝血相關(guān)指標(biāo)；非抗凝血分離血清，用LABOSPECT003型自動生化分析儀測定血液生化學(xué)相關(guān)指標(biāo)。

（6）大體解剖觀察及組織病理學(xué)檢查。試驗中期（第46天）、末期（第90天）、恢復(fù)期（第118天）禁食不禁水16h后采血，然后處死動物，解剖并進行大體解剖觀察及組織病理學(xué)檢查。稱量各組織器官重量，計算臟/體比值。

2.試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計。采用SPSS 22.0進行統(tǒng)計分析，P≤0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。用Levens test方法檢驗方差齊性，如果沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），用單因素方差分析（ANOVA）進行統(tǒng)計分析；如果有統(tǒng)計學(xué)意義（P≤0.05），用LSD-t或Dunnett-t檢驗進行比較分析。

三、結(jié)果與分析

1.一般臨床觀察及體重。試驗期間，各組動物生長發(fā)育良好，與溶媒對照組比較，試驗?zāi)┢谛坌源笫笫茉嚇悠犯邉┝拷M第1-7周體重均明顯減輕；其余各檢測時間點各劑量組平均體重均未見統(tǒng)計學(xué)差異。

2.攝食量、體重增重及食物利用率。與溶媒對照組比較，雌性大鼠魚油高劑量組第4-8、10-13周攝食量及總攝食量明顯增加，中劑量組第10-11周攝食量明顯增加；雄性大鼠魚油高劑量第1周攝食量明顯降低，第10-13周攝食量明顯增加，中劑量組第11周攝食量明顯增加。高劑量衛(wèi)星組雌、雄性大鼠試驗中期第6周攝食量明顯增加；高劑量衛(wèi)星組雌性大鼠試驗?zāi)┢诘?、9、12、13周攝食量明顯增加，雄性大鼠第4、5、6、11周攝食量和總攝食量明顯增加；高劑量衛(wèi)星組雄性大鼠恢復(fù)期第1周攝食量明顯增加。

與溶媒對照組比較，受試樣品高劑量組雄性大鼠第1、3周體重增重明顯降低；試驗中期受試樣品高劑量衛(wèi)星組雄性大鼠第6周體重增重明顯增加；試驗?zāi)┢谑茉嚇悠犯邉┝啃l(wèi)星組雌性大鼠第9周體重增重明顯增加，第1周體重增重明顯降低，雄性大鼠第3周體重增重明顯降低；恢復(fù)期受試樣品高劑量衛(wèi)星組雄性大鼠第3周體重增重與總體重增重均明顯增加。

與溶媒對照組比較，雌性大鼠魚油高劑量組第1周食物利用率明顯降低；雄性大鼠高劑量組第1、3周食物利用率及總食物利用率均明顯降低，低劑量組第3周食物利用率明顯降低。試驗中期高劑量組衛(wèi)星組雄性大鼠總食物利用率明顯降低。試驗?zāi)┢诟邉┝拷M衛(wèi)星組雌性大鼠第1周食物利用率與總食物利用率均明顯降低，第9周食物利用率明顯增加，衛(wèi)星組雄性大鼠第3、4、6、13周食物利用率與總食物利用率均明顯降低?；謴?fù)期高劑量組衛(wèi)星組雄性大鼠第3周食物利用率與總食物利用率均明顯增加。

3.血液學(xué)及血液生化學(xué)指標(biāo)。如表1、2所示，與溶媒對照組比較，試驗?zāi)┢诖菩源笫蟮蛣┝拷MNeu、PT明顯升高，Lym明顯降低。中劑量組Bas明顯升高；高劑量組Neu、Bas明顯升高，Lym明顯降低。雄性大鼠低、中、高劑量組Neu明顯升高；中劑量組RBC、Lym明顯降低；高劑量組Eos明顯升高、Lym明顯降低。試驗中期高劑量組衛(wèi)星組雌性大鼠Neu明顯升高、Lym明顯降低；恢復(fù)期高劑量組衛(wèi)星組雌性大鼠WBC、APTT明顯升高，雄性大鼠Bas明顯升高。

如表3、4所示，與溶媒對照組比較，試驗?zāi)┢诖菩源笫蟮蛣┝拷MALP明顯升高、CHO明顯降低；中劑量組Na+明顯升高、CHO明顯降低；高劑量組CHO明顯降低。雄性大鼠低劑量組ALB明顯升高，CHO、TG、Cl－明顯降低；中劑量組AST明顯升高、CHO、TG、Na+明顯降低；高劑量組ALT、BUN、Cl－明顯升高，CHO、TG、Na+明顯降低。試驗中期高劑量衛(wèi)星組雌性大鼠CHO、Na+明顯降低，雄性大鼠TP、ALB、BUN明顯升高，CHO明顯降低?；謴?fù)期高劑量組衛(wèi)星組雌性大鼠ALB明顯升高、K+明顯降低、ALP明顯降低，雄性大鼠TP、GLU明顯降低。

4.尿液指標(biāo)。與溶媒對照組比較，試驗?zāi)┢谛坌源笫笾?、高劑量組pH明顯升高、SG明顯降低，其余各劑量組各尿液指標(biāo)均未見統(tǒng)計學(xué)差異。

5.眼科指標(biāo)。給樣前所有納入試驗的動物及試驗結(jié)束后試驗組和衛(wèi)星組（溶媒對照和高劑量）大鼠的眼瞼、結(jié)膜、角膜、虹膜、瞳孔、鞏膜、晶狀體、玻璃體及眼底等均未見明顯異常。

6.臟器濕重及臟/體比值。如表5、6所示，與溶媒對照組比較，試驗中期雌性大鼠高劑量組衛(wèi)星組腦濕重明顯升高。試驗?zāi)┢诖菩源笫笫茉嚇悠返?、中劑量組卵巢濕重明顯升高，中劑量組胸腺濕重明顯降低；雄性大鼠受試樣品高劑量組心臟濕重明顯降低；其余各劑量組動物臟器濕重均未見統(tǒng)計學(xué)差異。

如表7、8所示，與溶媒對照組比較，試驗?zāi)┢诖菩源笫笾袆┝拷M的卵巢臟/體比值明顯升高、胸腺臟/體比值明顯降低；雄性大鼠中劑量組的脾臟臟/體比值明顯升高。試驗中期雌性大鼠高劑量組衛(wèi)星組腎臟臟/體比值明顯升高?；謴?fù)期雌性大鼠高劑量組衛(wèi)星組腎上腺臟/體比值明顯升高。其余各劑量組動物臟/體比值均未見統(tǒng)計學(xué)差異。

7.大體解剖觀察及組織病理學(xué)檢查。肉眼觀察各劑量組動物各送檢組織均未見明顯異常，各劑量組各解剖動物胸、腹腔無積液、無異物和腫瘤等，各臟器的解剖學(xué)位置正常。綜合大體解剖觀察及顯微鏡觀察結(jié)果，試驗中期、試驗?zāi)┢诤突謴?fù)期解剖的魚油高劑量組動物與溶媒對照組動物相比，病變數(shù)量與病變程度均未見明顯差異，故不考慮與受試樣品毒性相關(guān)。由此判定，本次檢查未發(fā)現(xiàn)魚油90天經(jīng)口給樣對SD大鼠有毒性意義的病理改變。其余各劑量組各臟器未見明顯異常病變。

四、討論

本實驗室條件下，魚油高、中、低劑量組連續(xù)給樣90天，試驗期間各組動物生長發(fā)育良好，未出現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)和死亡，各異常指標(biāo)數(shù)值均在本實驗室歷史參考值范圍內(nèi)，且各異常指標(biāo)雌、雄性大鼠變化不一致，無明顯劑量關(guān)系，無臨床毒理學(xué)意義。大體解剖觀察和組織病理學(xué)檢查未見脾臟、腎臟等相關(guān)聯(lián)臟器有明顯異常病變，故認(rèn)為上述差異與受試樣品的毒性作用無關(guān)，不具有臨床毒理學(xué)意義。綜上所述，魚油對SD大鼠的未觀察到有害作用劑量（NOAEL）為4.6g/kg（約相當(dāng)于人體推薦食用量的230倍）。

同時在實驗數(shù)據(jù)中，實驗?zāi)┢诖菩源笫蟮?、中、高劑量組CHO均明顯降低；雄性大鼠低、中、高劑量組CHO、TG均明顯將低，且TG呈劑量依賴性，結(jié)合實驗過程中給樣組大鼠均有不同程度的體重降低，故本實驗結(jié)果認(rèn)為魚油對降低血脂確實有一定作用，其他研究者的實驗結(jié)果也證實了魚油的這一功效。