大腸桿菌多酚氧化酶的分子克隆及異源高效表達(dá)

鄧 卉， 余 丹， 鄒成義， 范景勝， 李 斌， 屈 東， 倪青松， 鄭鈺嘉， 陳 瑾

（四川省畜牧科學(xué)研究院，動(dòng)物遺傳育種四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066）

優(yōu)質(zhì)飼料資源高度依賴進(jìn)口， 使我國(guó)飼料產(chǎn)業(yè)發(fā)展極度受制于國(guó)外供應(yīng)端的穩(wěn)定性、 安全性和經(jīng)濟(jì)性。2022 年，國(guó)家發(fā)改委修訂印發(fā)的《產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整指導(dǎo)目錄》 中將餅粕等糧油加工副產(chǎn)物綜合利用關(guān)鍵技術(shù)開發(fā)應(yīng)用列入鼓勵(lì)類條目。 菜籽粕、 棉籽粕是我國(guó)常見的餅粕類糧油加工副產(chǎn)物，也是最常見的非糧飼料資源，但由于其富含多酚等抗?fàn)I養(yǎng)因子，在商品飼料中的用量十分有限。目前利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生的酶蛋白來降解酚類抗?fàn)I養(yǎng)因子是最安全、最有效的技術(shù)手段。

本課題組前期篩選出的一株大腸桿菌SDB2已被證實(shí)能通過分泌多酚氧化酶來降解芥子堿等酚類物質(zhì)，但由于野生菌產(chǎn)酶效率低，純度不高，不能滿足商業(yè)化應(yīng)用。 通過基因工程技術(shù)克隆多酚氧化酶基因、 構(gòu)建重組菌株可以實(shí)現(xiàn)多酚氧化酶的高效表達(dá)。據(jù)報(bào)道，目前除了在蘋果、杏、楊樹等植物中克隆出了多酚氧化酶基因 （吳瑜凡等，2008），還有研究者在雙孢蘑菇、白腐菌等真菌中也克隆出了多酚氧化酶基因（Halalouili 等，2006；Wichers 等，2003），但關(guān)于細(xì)菌多酚氧化酶的克隆研究罕見報(bào)道。在基因重組表達(dá)體系中，誘導(dǎo)劑和溫度是影響表達(dá)效果的兩個(gè)重要因素。 本研究將SDB2 多酚氧化酶基因重組表達(dá)到大腸桿菌BL21中， 同時(shí)研究溫度和IPTG 濃度兩個(gè)因素對(duì)表達(dá)量的影響，確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，為SDB2 多酚氧化酶在飼料工業(yè)上的規(guī)模應(yīng)用奠定基礎(chǔ)， 為實(shí)現(xiàn)菜籽粕、 棉籽粕等非糧飼料資源的高效利用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種與質(zhì)粒 本課題組前期篩選保藏的大腸桿菌SDB2，質(zhì)粒pET28a，大腸桿菌（Escherichia coli）BL21 均購自生工生物工程公司。

1.1.2 試劑與工具酶 Taq DNA 聚合酶、dNTP、PCR 凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自生工生物工程公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)AR 試劑。

1.1.3 LB 培養(yǎng)基 胰蛋白胨10 g/L、 酵母浸粉5 g/L、氯化鈉10 g/L。

1.2 SDB2 基因組DNA 提取 SDB2 基因組DNA 提取按照FineMag 磁珠法通用型基因組DNA 提取試劑盒的說明書操作， 采用Purifier32全自動(dòng)核酸提取儀提取，獲得的DNA 樣品用封口膜封存于-20 ℃。

1.3 SDB2 多酚氧化酶基因PCR 擴(kuò)增 根據(jù)SDB2 多酚氧化酶基因設(shè)計(jì)引物， 開展兩輪PCR反應(yīng)，一輪反應(yīng)體系（擴(kuò)增模板DNA）為：雙蒸水41 μL、 模板DNA 2 μL、DNA 聚合酶1 μL、Buffer10×5 μL、dNTP 1 μL；PCR 反應(yīng)參數(shù)：96 ℃5 min；96 ℃22 s，60 ℃22 s，72 ℃25 s，22 個(gè)循環(huán)；72 ℃1 min。 二輪反應(yīng)體系為： 雙蒸水39 μL、首尾引物各1 μL、 一輪模板DNA 2 μL、DNA 聚合酶1 μL、Buffer10×5 μL、dNTP 1 μL；PCR 反應(yīng)參數(shù)：96 ℃5 min；96 ℃22 s，62 ℃22 s，72 ℃25 s，23 個(gè)循環(huán)；72 ℃1 min。 PCR 產(chǎn)物采用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠純化目的條帶。

1.4 重組菌株構(gòu)建 將純化后的PCR 產(chǎn)物酶切后與表達(dá)載體pET28a 連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 感受態(tài)細(xì)胞，42 ℃熱激后涂布在含有30 μg/mL 卡那霉素的LB 平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12 h。挑選出陽性重組菌株，提取重組菌株質(zhì)粒進(jìn)行單、雙酶切驗(yàn)證。

1.5 克隆基因生物信息學(xué)分析 單、雙酶切驗(yàn)證克隆基因后，委托生工生物工程公司測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果采用ExPASy 在線服務(wù)器推導(dǎo)出表達(dá)氨基酸的序列、相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)，并將重組氨基酸序列提交SWISS-MODEL 蛋白質(zhì)建模服務(wù)器進(jìn)行同源建模， 預(yù)測(cè)出SDB2 重組多酚氧化酶晶體三維結(jié)構(gòu)。

1.6 SDB2 多酚氧化酶基因的高效表達(dá)

1.6.1 基因工程菌 選擇1.4 中經(jīng)PCR 鑒定為陽性、 質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證為SDB2 多酚氧化酶基因的重組基因工程菌株開展多酚氧化酶的高效誘導(dǎo)表達(dá)試驗(yàn)。

1.6.2 試劑 LB 肉湯瓊脂培養(yǎng)基、 卡那霉素、誘導(dǎo)劑IPTG、TMB 顯色試劑盒、Western Blot 一抗、Western Blot 二抗均購自生工生物工程公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)AR 試劑。

1.6.3 SDB2 多酚氧化酶基因高效表達(dá)的誘導(dǎo)條件篩選 將重組菌株接種到含有30 μg/mL 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 當(dāng)OD 值達(dá)到0.6時(shí)， 設(shè)置不同誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)多酚氧化酶基因高效表達(dá)。 采用“2×2”交叉試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以溫度和誘導(dǎo)劑IPTG 濃度兩個(gè)因素作為重組菌株多酚氧化酶基因表達(dá)的影響因素，溫度和IPTG 濃度分別設(shè)計(jì)2個(gè)水平，詳見表1。 未添加誘導(dǎo)劑為陰性對(duì)照組。

表1 誘導(dǎo)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)束后，收集部分培養(yǎng)菌液制樣。將剩余菌液4000 r/min 離心10 min， 收集上清液和部分菌體沉淀制樣。 向剩余菌體沉淀添加Tris-NaCl buffer 懸浮，超聲破碎，離心收集上清和沉淀分別制樣。對(duì)前述制樣（未誘導(dǎo)樣品、誘導(dǎo)后菌液、破碎前上清、破碎前沉淀、破碎后原液、破碎后上清、破碎后沉淀）采用SDS-PAGE 和WB 雙重驗(yàn)證目標(biāo)酶蛋白，確立最佳誘導(dǎo)條件。

SDS-PAGE 檢測(cè)： 對(duì)蛋白樣品進(jìn)行處理制樣后，選用12%分離膠、5%濃縮膠來跑膠檢測(cè)出目標(biāo)蛋白分子質(zhì)量。 WB 檢測(cè)：將SDS-PAGE 分離的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜上，與對(duì)應(yīng)的WB 一抗（兔抗His 標(biāo)簽）起免疫反應(yīng)，再與WB 二抗（羊抗兔）起反應(yīng)，經(jīng)過放射自顯影檢測(cè)出目標(biāo)酶蛋白。1.6.4 高效表達(dá)并純化多酚氧化酶蛋白 依據(jù)確立的最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)重組菌株大量表達(dá)多酚氧化酶蛋白后，采用鎳柱純化親和層析法純化目標(biāo)酶蛋白， 純化過程中添加內(nèi)毒素去除緩沖液：50 mmol Tris-300 mmol NaCl，1%tritonX-114，pH 8.0； 平衡緩沖液：50 mmol Tris-300 mmol NaCl ，pH 8.0；清洗緩沖液：50 mmol Tris-300 mmol Na-Cl，pH 8.0 和20/50 mmol imidazole； 洗脫緩沖液：50 mmol Tris-300 mmol NaCl，pH 8.0 和500 mmol imidazole。制樣，采用SDS-PAGE 和WB 雙重驗(yàn)證經(jīng)純化的目標(biāo)酶蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建SDB2 多酚氧化酶基因重組菌株 SDB2多酚氧化酶基因經(jīng)提取、擴(kuò)增、純化后連接質(zhì)粒載體pET28a，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 構(gòu)建重組菌株，提取重組菌株質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證的結(jié)果如圖1 所示，得到一條741 bp 和一條5400 bp 的基因條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，說明成功構(gòu)建出重組菌株。

圖1 重組質(zhì)粒酶切驗(yàn)證圖

2.2 克隆基因生物信息學(xué)分析 對(duì)克隆出的SDB2 重組多酚氧化酶基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)該基因含目標(biāo)核苷酸741 個(gè)，總編碼氨基酸263 個(gè)（含標(biāo)簽氨基酸20 個(gè)），氨基酸組成的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為28499.0， 理論等電點(diǎn)為6.94。進(jìn)一步對(duì)SDB2 重組多酚氧化酶基因編碼的氨基酸序列開展三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析，進(jìn)入Swiss-Model三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)服務(wù)器， 提交該重組基因編碼的氨基酸序列，結(jié)果如圖2 所示。 SDB2 重組多酚氧化酶蛋白三維結(jié)構(gòu)模型的建立是以1u05.1.A 為模板， 一致性達(dá)97.94%，GMQE 值為0.90，QMEAN值為（0.92±0.05）。

圖2 SDB2 重組多酚氧化酶蛋白的三維預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)

2.3 確立SDB2 多酚氧化酶基因高效表達(dá)的誘導(dǎo)條件

2.3.1 不同誘導(dǎo)條件下多酚氧化酶基因表達(dá)的SDS-PAGE 分析 采用SDS-PAGE 對(duì)4 種不同誘導(dǎo)條件下的7 種性狀樣品進(jìn)行驗(yàn)證， 結(jié)果顯示（圖3 ~ 圖6）： 未經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的樣品（A1、B1、C1、D1）無特異條帶出現(xiàn)，不同誘導(dǎo)條件下的破碎前上清樣品（A3、B3、C3、D3）均無蛋白表達(dá)，而4種不同誘導(dǎo)條件下的誘導(dǎo)后菌液、破碎前沉淀、破碎后原液、破碎后上清、破碎后沉淀均在蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量25 ～35 KD 產(chǎn)生1 條特異的蛋白條帶，與預(yù)期蛋白大?。?8KD）一致，初步判斷重組菌株成功在胞內(nèi)表達(dá)出多酚氧化酶蛋白。 進(jìn)一步分析可知，“37 ℃，1 mmol IPTG” 誘導(dǎo)條件下的B2、B4、B5、B6、B7 多酚氧化酶表達(dá)量均高于其他3個(gè)誘導(dǎo)條件下對(duì)應(yīng)性狀樣品的表達(dá)量， 而載體為上清液的可溶性多酚氧化酶蛋白B6 對(duì)后續(xù)的純化提取工藝要求更簡(jiǎn)單、易操作，成本更低，因此選擇樣品B6 的生產(chǎn)方法作為重組菌株高效表達(dá)SDB2 多酚氧化酶的誘導(dǎo)條件， 有利于實(shí)現(xiàn)規(guī)?；瘧?yīng)用生產(chǎn)。

圖3 “37 ℃，0.2 mmol IPTG”誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE 結(jié)果

圖4 “37 ℃，1 mmol IPTG ”誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE 結(jié)果

圖5 “15 ℃，0.2 mmol IPTG”誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE 結(jié)果

圖6 “15 ℃，1 mmol IPTG ”誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE 結(jié)果

2.3.2 不同誘導(dǎo)條件下多酚氧化酶基因表達(dá)的WB 分析 繼SDS-PAGE 分析后， 再采用WB 對(duì)4 種不同誘導(dǎo)條件下的7 種性狀樣品進(jìn)行二次驗(yàn)證，結(jié)果顯示（圖7 ~ 圖10），未經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的樣品無特異條帶出現(xiàn)， 不同誘導(dǎo)條件下的破碎前上清樣品均無蛋白表達(dá)， 而4 種不同誘導(dǎo)條件下的誘導(dǎo)后菌液、破碎前沉淀、破碎后原液、破碎后上清、 破碎后沉淀均在蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量25 ～35 KD 產(chǎn)生1 條特異的蛋白條帶， 與預(yù)期蛋白大?。?8KD）一致，二次驗(yàn)證充分說明重組菌株成功在胞內(nèi)表達(dá)出多酚氧化酶蛋白。 進(jìn)一步分析可知，“37 ℃，1 mmol IPTG” 誘導(dǎo)條件下的B2、B4、B5、B6、B7 多酚氧化酶表達(dá)量均高于其他3 個(gè)誘導(dǎo)條件下對(duì)應(yīng)性狀樣品的表達(dá)量， 而載體為上清液的可溶性多酚氧化酶蛋白B6 對(duì)后續(xù)的純化提取工藝要求更簡(jiǎn)單、易操作，成本更低，因此選擇樣品B6 的生產(chǎn)方法作為重組菌株高效表達(dá)多酚氧化酶的誘導(dǎo)條件，有利于實(shí)現(xiàn)規(guī)模化應(yīng)用生產(chǎn)。由此可見，WB 二次驗(yàn)證結(jié)果與上述SDS-PAGE 分析結(jié)果一致，充分證實(shí)選擇“37 ℃，1 mmol IPTG”獲得菌體破碎后上清液的生產(chǎn)方法可作為多酚氧化酶高效表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件。

圖7 “37 ℃，0.2 mmol IPTG”誘導(dǎo)表達(dá)WB 結(jié)果

圖8 “37 ℃，1 mmol IPTG ”誘導(dǎo)表達(dá)WB 結(jié)果

圖9 “15 ℃，0.2 mmol IPTG”誘導(dǎo)表達(dá)WB 結(jié)果

圖10 “15 ℃，1 mmol IPTG ”誘導(dǎo)表達(dá)WB 結(jié)果

2.4 高效表達(dá)并純化多酚氧化酶蛋白 依據(jù)2.3中確立的最佳誘導(dǎo)條件“37 ℃，1 mmol IPTG”誘導(dǎo)SDB2 多酚氧化酶蛋白大量表達(dá)后， 對(duì)重組菌株破碎后上清液采用鎳柱純化親和層析法純化目標(biāo)酶蛋白，結(jié)果如圖11 所示，樣品S 在SDS-PAGE 和Western 分析圖中均在蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量25 ～35 KD 產(chǎn)生1 條特異的蛋白條帶，與預(yù)期蛋白大?。?8 KD）一致，說明重組菌株采用前述誘導(dǎo)和純化工藝，最終成功獲得目標(biāo)多酚氧化酶蛋白。

圖11 最終純化蛋白SDS-PAGE和Western 分析圖

3 結(jié)論與討論

本研究將課題組前期篩選出的大腸桿菌SDB2 的多酚氧化酶基因克隆到表達(dá)質(zhì)粒pET28a，轉(zhuǎn)化至宿主E.coli BL21 中，成功構(gòu)建出SDB2 多酚氧化酶基因重組菌株。 以溫度和IPTG濃度作為影響因素設(shè)置不同誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)多酚氧化酶基因在重組菌株中高效表達(dá)，對(duì)表達(dá)蛋白采用SDS-PAGE 和WB 進(jìn)行雙重驗(yàn)證，確立SDB2 多酚氧化酶高效表達(dá)的最佳誘導(dǎo)條件為“37 ℃，1 mmol IPTG”，最終在該誘導(dǎo)條件下成功純化出SDB2 多酚氧化酶蛋白。

陳衛(wèi)等（2002）將嗜熱脂肪芽孢桿菌IAM11001的半乳糖苷酶基因克隆到表達(dá)質(zhì)粒pET-28 （b）并轉(zhuǎn)化至宿主E.coli BL21 后，采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)來探尋該重組菌表達(dá)半乳糖苷酶基因的最適IPTG 濃度，結(jié)果表明IPTG 濃度為0.8 mmol 時(shí)，基因的蛋白表達(dá)量最大。 張強(qiáng)（2010）研究表明，耐熱淀粉酶重組大腸桿菌BL21-amylase 高效表達(dá)酶蛋白的最佳誘導(dǎo)溫度為37 ℃、IPTG 濃度為0.6 mmol。Kamna等（2012） 采用表達(dá)質(zhì)粒pGEX-2T 和宿主E.coli BL21 高效表達(dá)木聚糖酶基因的研究結(jié)果顯示，1 mmol IPTG 誘導(dǎo)的酶蛋白表達(dá)量為1.6%， 遠(yuǎn)低于0.01 mmol IPTG 的誘導(dǎo)表達(dá)量12.7%， 該試驗(yàn)條件下的IPTG 添加量在極低濃度下能達(dá)到更好的效果。 Cui 等（2011）將嗜冷單胞菌的脂肪酶基因克隆到質(zhì)粒pColdI 并轉(zhuǎn)化至宿主E.coli BL21 后， 摸索出脂肪酶基因在重組菌中高效表達(dá)的最佳溫度為35 ℃。 本研究以課題組篩選的一株大腸桿菌SDB2的多酚氧化酶基因?yàn)檠芯繉?duì)象，采用BL21/pET28a作為表達(dá)載體， 以溫度和IPTG 濃度兩個(gè)因素設(shè)計(jì)“2×2”交叉試驗(yàn)，研究該重組基因高效表達(dá)酶蛋白的最佳條件， 結(jié)果表明該基因在BL21 中實(shí)現(xiàn)了胞內(nèi)分泌酶蛋白，在“37 ℃，1 mmol IPTG”條件下表達(dá)出大量可溶性酶蛋白，避免了包涵體酶蛋白的復(fù)雜提純工藝，有利于應(yīng)用生產(chǎn)。

綜上所述， 本研究運(yùn)用基因工程技術(shù)成功將能有效降解芥子堿、 棉酚的SDB2 多酚氧化酶基因克隆、異源高效表達(dá)，為多酚氧化酶實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)， 為提高我國(guó)非糧飼料資源利用率、 緩解飼料原料高度依賴進(jìn)口的現(xiàn)狀提供了技術(shù)解決方法。