熒光PCR 熔解曲線法在耐多藥結(jié)核病診治中的應(yīng)用及分析

秦 萬(wàn) 王明棟 歐維正 徐 勇

耐多藥結(jié)核病（multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB）是指同時(shí)耐異煙肼和利福平兩種以上抗結(jié)核藥物的結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病[1］，其防治已成為結(jié)核病防控的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一，并引起有關(guān)結(jié)核防控專家的高度重視。WHO 于2020 年發(fā)布的《全球結(jié)核病報(bào)告》顯示，2019 年全球范圍內(nèi)估計(jì)有1 000 萬(wàn)例新發(fā)結(jié)核病患者，約3.3% （46.5 萬(wàn)例）的初治患者和18%的復(fù)治患者對(duì)利福平耐藥，其中MDR-TB 患者約占78%，為 36.3 萬(wàn)例[2］。MDR-TB 患者的治療時(shí)間長(zhǎng)達(dá)2 年，治療藥品由多種二線抗結(jié)核藥品組成，副作用強(qiáng)，但治療成功率僅為54.0%[3-4］。

及時(shí)對(duì)結(jié)核病患者進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)檢測(cè)（簡(jiǎn)稱“藥敏檢測(cè)”）能夠及早發(fā)現(xiàn)耐藥，并提高M(jìn)DR-TB 患者的治療成功率[5］。目前的藥敏檢測(cè)方案除了“金標(biāo)準(zhǔn)”表型藥物敏感性試驗(yàn)（簡(jiǎn)稱“表型藥敏”）外，臨床中用得較多的便是對(duì)耐藥基因進(jìn)行檢測(cè)的分子生物學(xué)試驗(yàn)，該技術(shù)在檢測(cè)時(shí)間上比表型藥敏更短，可在4～6小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)并報(bào)告結(jié)果，為患者及時(shí)診斷和制定有效的治療方案帶來(lái)了極大的便捷。本研究對(duì)新引進(jìn)的結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)的PCR 熒光熔解曲線法（簡(jiǎn)稱“熔解曲線法”）在貴陽(yáng)市的開展情況進(jìn)行探討，以期為MDR-TB 的診斷及全新治療方案的調(diào)整提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源與藥敏檢測(cè) 標(biāo)本來(lái)源：收集2021 年1～7 月貴陽(yáng)市公共衛(wèi)生救治中心門診和住院結(jié)核患者經(jīng)羅氏培養(yǎng)為陽(yáng)性的84 種菌株。使用微孔板藥敏檢測(cè)法（以下簡(jiǎn)稱“微孔板法”）檢測(cè)上述菌株對(duì)RFP、INH、EMB、FQs[包括左氧氟沙星（Lfx）和莫西沙星（Mfx）］的耐藥性。參考試劑盒說(shuō)明書，將待測(cè)菌株的菌液稀釋到1.5～2.0 麥?zhǔn)蠁挝缓蠹尤胍后w培養(yǎng)基中，混勻后加樣至微孔板中，最后將微孔板放入37℃培養(yǎng)箱中，分別在第7 天、第10 天和第12 天進(jìn)行結(jié)果判讀。表型藥敏試驗(yàn)符合結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程[6］。同時(shí)微孔板檢測(cè)的Lfx 和Mfx 作為氟喹諾酮參照藥物，兩種藥物中只要一種藥物耐藥便可判為氟喹諾酮耐藥；微孔板藥敏試驗(yàn)為中敏的均按敏感處理；RFP 與INH 組合表示微孔板檢測(cè)的47 株MDR-TB 中熔解曲線檢測(cè)的耐藥菌株和敏感菌株數(shù)。

1.2 微孔板表型藥敏法示意圖 微孔板藥敏測(cè)試板提供不同種類及濃度的藥物，具體藥物濃度見(jiàn)圖1。最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration ，MIC）判讀：藥物濃度單位為μg/mL；當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照孔A2、B2 為陽(yáng)性時(shí)進(jìn)行結(jié)果判讀，記錄每個(gè)藥物的MIC 值，MIC 值為無(wú)白色沉淀的最低藥物濃度孔。將MIC 值記錄在結(jié)果記錄紙上。耐藥（drug resistant，R），又稱抗藥性，耐藥性一旦產(chǎn)生，藥物的化療作用就明顯下降；敏感（sensitive，S）指某種致病菌對(duì)于抗生素的敏感，即應(yīng)用常規(guī)劑量的抗生素就能把致病菌給抑制或者殺死掉。見(jiàn)圖1。

圖1 微孔板示意圖

1.3 核酸提取 在1.5 mL 離心管中加入500 μL TBDNA 提取液，然后用接種環(huán)在羅氏培養(yǎng)基上刮取一小環(huán)疑似結(jié)核菌株放入上述離心管中，充分振蕩后進(jìn)行滅菌處理（95℃恒溫金屬浴15 min）。隨后，將菌懸液加入核酸自動(dòng)純化試劑條的加樣孔中，并通過(guò)Lab-Aid? 824s 核酸自動(dòng)提取儀進(jìn)行核酸提取。最后，將純化的核酸一次性全部轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中（大約130 μL）備用。

1.4 熒光PCR 熔解曲線法檢測(cè) 使用熔解曲線法分別進(jìn)行RFP、INH、EMB 和FQs 耐藥突變檢測(cè)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書操作。溶解曲線檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。

1.5 測(cè)序驗(yàn)證 對(duì)微孔板法和熔解曲線法檢測(cè)結(jié)果不一致的標(biāo)本進(jìn)行Sanger 測(cè)序（一代）驗(yàn)證，驗(yàn)證區(qū)域：利福平rpoB 基因 507～533 共27 個(gè)氨基酸密碼子區(qū)域內(nèi)（81 bp，利福平耐藥決定區(qū)）；異煙肼ahpC 啟動(dòng)子區(qū)（-44～-30 以及-15～3 位點(diǎn)）、inhA 啟動(dòng)子區(qū)（-17～-8 位點(diǎn)）、inhA94 密碼子和katG315 密碼子；乙胺丁醇embB 基因306 位、406 位、497 位密碼子；氟喹諾酮gyrA 基因88～94 位密碼子（圖3）；測(cè)序引物序列見(jiàn)表1。

表1 測(cè)序引物

圖3 測(cè)序驗(yàn)證圖

1.6 試劑與儀器 試劑：分枝桿菌藥敏檢測(cè)試劑盒（培養(yǎng)法）由珠海銀科醫(yī)學(xué)提供。結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼、乙胺丁醇和氟喹諾酮耐藥突變檢測(cè)試劑盒（熒光PCR 熔解曲線法）由廈門致善提供。儀器：細(xì)菌超聲分散計(jì)數(shù)儀、自動(dòng)讀器儀由廣東體必康提供；YK-909 分枝桿菌微孔板藥敏判讀儀、YK-96 小型全自動(dòng)移液平臺(tái)儀均由珠海銀科醫(yī)學(xué)提供；Lab-Aid? 824s核酸提取儀、SLAN-96S 全自動(dòng)PCR 儀由廈門致善提供。

1.7 質(zhì)量控制

1.7.1 微孔板藥敏 本試劑盒對(duì)標(biāo)準(zhǔn)減毒株H37Rv（ATCC25277）的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，接種到藥敏孔經(jīng)培養(yǎng)后應(yīng)完全受抑制，藥敏測(cè)定結(jié)果為敏感；對(duì)陰性質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性。

1.7.2 熔解曲線法 應(yīng)嚴(yán)格按照基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的要求進(jìn)行，耗材使用一次性物品，嚴(yán)格劃分區(qū)域操作等措施，避免交叉污染；每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照，只有當(dāng)陰陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果正常方可分析出據(jù)報(bào)告，否則重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Epidata 3.1 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入；采用SPSS 21.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；以微孔板法為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算熔解曲線法對(duì)RFP、INH、EMB 和FQs 4 種藥品的藥敏檢測(cè)符合率、靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和Kappa 值，其中Kappa 值在0.00～0.20 為極低一致性，0.21～0.40 為一般一致性，0.41～0.60 為中等一致性，0.61～0.80 為高度一致性，0.81～1.00 為幾乎一致性[7-9］。

2 結(jié)果

本研究共納入47 株MDR-TB 菌株和37 株對(duì)照菌株（微孔板藥敏檢測(cè)為全敏感菌株作為對(duì)照菌株）。以微孔板法為標(biāo)準(zhǔn)，熔解曲線法對(duì)RFP、INH、EMB、FQs的符合率、靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和Kappa 值見(jiàn)表2。兩種檢測(cè)方法不一致的樣本經(jīng)Sanger 測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果均與熔解曲線法的檢測(cè)結(jié)果一致。見(jiàn)表3。

表2 以微孔板法為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)熔解曲線法對(duì)4種藥品耐藥性檢測(cè)的價(jià)值

表3 兩種藥敏試驗(yàn)不一致的結(jié)果與測(cè)序結(jié)果對(duì)比分析（株）

3 討論

導(dǎo)致耐藥性出現(xiàn)和迅速蔓延的一個(gè)重要因素是缺乏快速診斷，因此，快速診斷耐藥結(jié)核病獲得菌株耐藥信息是控制結(jié)核病傳播和治療的關(guān)鍵[10］。用藥前對(duì)患者進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌的藥敏檢測(cè)是制定耐藥結(jié)核病治療方案的重要依據(jù)。目前，羅氏比例法和MGIT960 表型藥敏試驗(yàn)仍是WHO 推薦的方法，但總體來(lái)說(shuō)存在操作繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，無(wú)法及時(shí)獲得藥敏結(jié)果來(lái)指導(dǎo)患者用藥。隨著結(jié)核分枝桿菌分子耐藥機(jī)制的深入研究，利用基因型方法快速檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性在臨床逐漸得到廣泛應(yīng)用。熒光PCR 熔解曲線法是國(guó)內(nèi)近期研發(fā)的一種新型檢測(cè)技術(shù)，目前已普遍用于國(guó)內(nèi)各結(jié)核病傳染醫(yī)院及結(jié)核預(yù)防控制機(jī)構(gòu)，并獲得業(yè)內(nèi)認(rèn)可。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是把擴(kuò)增和檢測(cè)兩步驟合一，對(duì)多種一線及二線抗結(jié)核藥物進(jìn)行耐藥檢測(cè)，具有實(shí)時(shí)擴(kuò)增實(shí)時(shí)檢測(cè)、高效、快捷、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，可以對(duì)結(jié)核分枝桿菌耐藥相關(guān)的多個(gè)基因同時(shí)檢測(cè)，特別適用于大批量篩查[11-14］。本研究顯示，熒光PCR 熔解曲線法對(duì)4 種抗結(jié)核藥品耐藥性檢測(cè)的靈敏度和特異性除乙胺丁醇外均在89% 以上，Kappa 值除乙胺丁醇外均≥0.78，說(shuō)明這兩種方法檢測(cè)具有較高一致性。同時(shí)對(duì)檢測(cè)中結(jié)果不一致的用一代Sanger 測(cè)序驗(yàn)證均與溶解性曲線法吻合，這也證明了該技術(shù)的可靠性。

化學(xué)療法仍然是結(jié)核病最重要的治療手段[15］。RFP 和INH 為治療結(jié)核病最重要的兩種藥物，對(duì)這兩種藥物進(jìn)行及時(shí)的藥敏檢測(cè)有利于MDR-TB 患者早期發(fā)現(xiàn)。本次研究中有5 株RFP 藥敏結(jié)果差異，經(jīng)Sanger 測(cè)序rpoB 基因有4 株相關(guān)基因位點(diǎn)突變，與溶解曲線結(jié)果一致，1 株溶解曲線敏感、微孔板法耐藥，經(jīng)測(cè)序未檢測(cè)出rpoB 基因突變位點(diǎn)；2 株INH 溶解曲線法敏感、微孔板法耐藥的菌株經(jīng)Sanger 測(cè)序相關(guān)katG 、inhA 、ahpC 基因位點(diǎn)未檢出突變；EMB 為另一種治療結(jié)核病的一線藥物，但其體外藥敏試驗(yàn)可靠性差，需要更加準(zhǔn)確、穩(wěn)定的藥敏檢測(cè)方案為用藥提供指導(dǎo)。而本次研究中就有19 株EMB 藥敏結(jié)果差異，經(jīng)Sanger 測(cè)序相關(guān)embB 基因306 位、406 位、497 位有17 株突變，均與溶解曲線法結(jié)果一致；2 株EMB 微孔板耐藥、溶解曲線敏感的菌株經(jīng)測(cè)序embB 基因未檢出突變；WHO 于2018 年制定的《耐多藥和耐利福平結(jié)核病治療指南》更新版中將氟喹諾酮（Lfx 和Mfx）作為A類核心藥物[16］，同時(shí)Mfx 在治療廣泛耐藥結(jié)核?。╔DR-TB）時(shí)不僅作為首選藥物，還需要全程使用[17］，由此可見(jiàn)FQs 在耐藥結(jié)核病治療中的重要地位。本研究中發(fā)現(xiàn)4 株FQs 結(jié)果差異，3 株溶解曲線耐藥、微孔板法敏感，測(cè)序gyrA 基因88～94 位密碼子結(jié)果均與溶解曲線結(jié)果一致；1 株微孔板耐藥、溶解曲線敏感，測(cè)序gyrA 基因未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，熒光PCR 熔解曲線法對(duì)以上4 種抗結(jié)核藥品耐藥性檢測(cè)的靈敏度均較高，顯示該技術(shù)對(duì)4 種藥品的MTB 耐藥相關(guān)基因位點(diǎn)覆蓋率較高。

據(jù)有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在臨床應(yīng)用中基因型耐藥檢測(cè)與表型耐藥檢測(cè)存在不一致[18-19］，故本研究的主要設(shè)想就是利用微孔板法檢測(cè)三種常用的一線抗癆藥物和二線氟喹諾酮類藥物并與熔解曲線法進(jìn)行對(duì)比，評(píng)估在高發(fā)病率、高耐藥結(jié)核病地區(qū)開展該新技術(shù)的必要性或重要性。從本研究結(jié)果中可以看出，熔解曲線法與微孔板法對(duì)MDR-TB、RFP、INH 和FQs 檢測(cè)結(jié)果的一致性較高，而對(duì)EMB 則顯示出中等一致性。對(duì)28份兩種檢測(cè)方法結(jié)果不一致的標(biāo)本使用測(cè)序方法予以驗(yàn)證。由本研究結(jié)果中可知，盡管兩種藥敏方法檢測(cè)結(jié)果有差異，但熔解曲線法結(jié)果與核酸測(cè)序結(jié)果完全一致，說(shuō)明該方法在方法學(xué)角度上具有高度的準(zhǔn)確性。而分子生物學(xué)檢測(cè)方法與表型藥敏檢測(cè)結(jié)果不一致的情況可能有以下原因：①熔解曲線法和Sanger 測(cè)序都僅對(duì)特定的已知耐藥突變區(qū)域進(jìn)行檢測(cè)，若耐藥突變發(fā)生在檢測(cè)區(qū)域之外，或由其他耐藥機(jī)制導(dǎo)致（如藥物外排泵），則有可能出現(xiàn)分子生物學(xué)檢測(cè)為敏感而表型結(jié)果為耐藥的情況；②部分耐藥突變僅導(dǎo)致低水平耐藥，如rpoB511 和533 密碼子突變，其耐藥水平小于等于培養(yǎng)基的含藥濃度，則有可能出現(xiàn)分子生物學(xué)結(jié)果為耐藥而表型結(jié)果為敏感的情況[20］；③有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，表型藥敏試驗(yàn)本身存在不穩(wěn)定性，可能導(dǎo)致不一致結(jié)果的出現(xiàn)[21］。

綜上所述，分子生物學(xué)的耐藥性檢測(cè)由于具有檢測(cè)的藥物種類多且全面、檢測(cè)報(bào)告時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)日益受到廣大臨床醫(yī)師和醫(yī)療科研工作者的青睞。而溶解曲線法目前正符合此要求，不但在診斷性能方面，與“金標(biāo)準(zhǔn)”比例法具有高度的一致性外，還與測(cè)序法具有高度的吻合性。盡管如此，但對(duì)部分耐藥靶點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果與表型藥敏試驗(yàn)結(jié)果存在不一致，且其能夠檢測(cè)的基因位點(diǎn)有限。因此，可以將兩種檢測(cè)方法綜合運(yùn)用于結(jié)核病診療中，優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)[22］。